LABORATORIO DE ALTO RENDIMIENTO PARA SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS

Transcripción

1 LABORATORIO DE ALTO RENDIMIENTO PARA SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS F. Javier Chaves Martínez Laboratorio de Estudios Genéticos, Fundación de Investigación del Hospital Clínico Universitario de Valencia. Técnicas Secuenciación Identificación y análisis de polimorfismos PCR cuantitativo a tiempo real Equipamiento Secuenciador de gran capacidad Sistemas automáticos de manejo de líquidos Termocicladores de alta capacidad LightTyper PCR cuantitativo (Roche)

2 LABORATORIO DE ESTUDIOS GENÉTICOS: USO DE SISTEMAS DE ALTO RENDIMIENTO SECUENCIACIÓN Identificación y análisis de polimorfismos RESULTADOS DE SECUENCIACIÓN Capacidad de preparación y análisis de unas 1 secuenciaciones al día

3 LABORATORIO DE ESTUDIOS GENÉTICOS APLICACIONES: Identificación de mutaciones/polimorfismos. Estudio de genes candidatos a causar enfermedades. Estudio de genes que puedan estar implicados en enfermedades multifactoriales. Caracterización de mutaciones: Estudio de alteraciones de I/D, grandes reordenamientos, etc. Caracterización de cdnas, etc. LABORATORIO DE ESTUDIOS GENÉTICOS: USO DE SISTEMAS DE ALTO RENDIMIENTO Secuenciación ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS PCR cuantitativo a tiempo real

4 LABORATORIO DE ESTUDIOS GENÉTICOS ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS Polimorfismos que suponen la I/D de bases: - Análisis de fragmentos - SNPlex (I/D de 6 bp) Análisis de SNPs: - LightTyper - SNAPShot - SNPlex ANÁLISIS DE FRAGMENTOS ANÁLISIS SEMICUANTITATIVO - Detección de grandes reordenamientos. - Determinación de polimorfismos de I/D de grandes secuencias (exones o genes completos como en GSTT1 y GSTM1). ANÁLISIS DE TAMAÑOS - Detección de pequeñas alteraciones. - Estudio de I/D, STRs y VNTRs.

5 GRANDES ALTERACIONES DE LA SECUENCIA P53 E18 PE1 E17 FH 13 Control PEQUEÑAS INSERCIONES O DELECIONES P5 3 E11 E6 E16 FH51 (884delT) Control

6 PEQUEÑAS INSERCIONES O DELECIONES P53 E5 E3 E13 FH218 (del 7pb E13) Control LABORATORIO DE ESTUDIOS GENÉTICOS ANÁLISIS DE STRs: Estudios de asociación Pérdida de heterozigosidad Inestabilidad

7 Análisis de SNPs - LIGHTTYPER - SNAPShot -SNPlex LIGHTTYPER Detección de un SNP en unos 2 minutos (en 384 muestras). Utilización de sondas específicas para uno de los alelos y realización de curvas de disociación Permite obtener unos 1 datos de SNPs al día

8 SNAPSHOT AMPLIFICACIÓN POR PCR PURIFICACIÓN MINISECUENCIACIÓN PURIFICACIÓN ELECTROFORESIS SNAPSHOT Permite obtener mas de 15 datos de SNPs al día

9 SNPLEX Figura de los polimorfismos de SNPlex Resultados. AMPLIFICACIÓN HIBRIDACIÓN PURIFICACIÓN ELECTROFORESIS

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11 SNPLEX Permite obtener hasta 1 datos de polimorfismos al día ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS Estudios en daño renal en hipertensos: localización de una región cromosómica de unas 1 kb posiblemente relacionada con el desarrollo de daño renal. INDIVIDUALMENTE (p) HAPLOTIPOS (p) HAPLOTIPOS (Bonferroni p)

12 LABORATORIO DE ESTUDIOS GENÉTICOS APLICACIONES DEL ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS: Estudio de genes candidatos que puedan estar implicados en enfermedades mono/oligogenéticas y/o multifactoriales. Identificación de regiones cromosómicas y, posteriormente, de genes relacionados con enfermedades mono/oligogenéticas y/o multifactoriales. CONCLUSIÓN DISPONEMOS Y DISPONEIS DE UN LABORATORIO DE ANÁLISIS GENÉTICOS QUE NOS PUEDE FACILITAR LA VIDA EN ESTE TIPO DE TRABAJOS.

13 GRUPOS DE TRABAJO Estudios Genéticos F. Javier Chaves Martínez Sebastián Blesa Lujan Ana B. García García Mª Luisa Mansego Talavera Verónica González Albert Servicio de Endocrinología Rafael Carmena Juan F. Ascaso José T. Real Sergio Martínez Hervás Redes Cooperativas de Investigación Servicio de Medicina Interna Josep Redón Mas Jose V Lozano Vidal Hospital Rio Hortega (Valladolid) Juan C. Martín Escudero Conselleria de Sanidad Rosa Marín

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15 ASOCIACIÓN XO CON NIVELES DE EO 1 MDA 6,2 8-oxo-dG-g,9 6,1,8 6,7,6,5,4,3 5,9 5,8 5,7 5,6,2 5,5,1 5,4 5,3 AA (26) AG (34) GG (2) AA (26) AG (34) GG (2) 337GA 337GA p=.1 p=.23,9 MDA 6,4 8-oxo-dG-g,8 6,3,7 6,2,6 6,1,5 6,4 5,9,3 5,8,2 5,7,1 5,6 5,5 CC (39) TC (34) TT (17) CC (39) TC (34) TT (17) CT CT p=.2 p=.4 CONCLUSIONES Variaciones de la xantin oxidasa modulan los niveles de presión arterial y los niveles de EO.

16 PRÓXIMOS ESTUDIOS Análisis de 5 genes en unos 4 pacientes HF para identificar mutaciones en genes candidatos. Diagnostico genético de unas 1 muestras (principalmente HF). Estudio de unos 5-1 genes para identificar nuevos polimorfismos relacionados con HTA. SERVICIO DE SECUENCIACIÓN. - Reacciones de secuenciación y electroforesis. - Diseño y realización de estudios de secuenciación de genes, sistemas genéticos, ARNs o genomas. PRÓXIMOS ESTUDIOS - Análisis de unos 2 polimorfismos en unas 5 muestras. - Acotamiento de regiones cromosomicas identificadas mediante búsqueda genómica mediante microchips de SNPs (1K-Affimetrix) para la identificación de genes causantes de daño renal. SERVICIO DE ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS - Electroforesis de muestras. - Realización de reacciones y electroforesis. - Diseño y realización de estudios de polimorfismos. - Análisis estadístico de los resultados.

17 LABORATORIO DE ESTUDIOS GENÉTICOS Desarrollo de un laboratorio con sistemas de alto rendimiento para la realización de: Secuenciación Identificación y Análisis de polimorfismos PCR cuantitativo a tiempo real PCR CUANTITATIVO A TIEMPO REAL

18 ESTUDIO DEL EO EN PACIENTES CON ALTO RIESGO CARDIOVASCULAR GSSG(nmol/mg Prot.) 1 GSSG Control HFC HF HTA GSH (nmol/mg Prot.) GSH Control HFC HF HTA 1xGSSG/GSH(nmol/mg Prot.) GSSG/GSH Control HFC HF HTA : P<.1 8-oxo-dG/1 dg NIVELES DE 8-oxo-dG EN ADN GENÓMICO 8-oxo-dG Control HFC HF HTA : P<.1 : p<.1

19 NIVELES DE MDA EN LINFOCITOS MDA (nmoles/mg Prot.) 1 MDA Control HFC HF HTA : P<.1 : p<.5 DURACIÓN DEL TRATAMIENTO ANTIHIPERTENSIVO Y NIVELES DE EO GSSG/GSH 24-hour mmhg SOD U/mg protein 8-oxo-dG/dG Basal 3 meses 12 meses Basal 3 meses 12 meses

20 NIVELES DE GSH NIVELES DE ARNm DE GSS 3 3. GSH (U/protein) GSS ARNm/GAPDH x Controles HTA basal HTA tratamiento Controles HTA basal HTA tratamiento p<.1 al comparar entre controles y pacientes sin tratar. p<.1 al comparar entre pacientes sin tratar y tratados. ACTIVIDAD GSR NIVELES DE ARNm DE GSR 8 8 GSR (U/g proteína) GSR ARNm/GAPDH x Controles HTA basal HTA tratamiento Controles HTA basal HTA tratamiento p<.1 al comparar entre controles y pacientes sin tratar. p<.1 al comparar entre pacientes sin tratar y tratados.

21 ACTIVIDAD DE LA Cu/ZnSOD NIVELES DE ARNm SOD (U/protein) ARNm CuZnSOD/GAPDH x Controles HTA basal HTA tratamiento Controles HTA basal HTA tratamiento p<.1 al comparar entre controles y pacientes sin tratar. p<.1 al comparar entre pacientes sin tratar y tratados. ACTIVIDAD DE LA GPX INTRACELULAR NIVELES DE ARNm DE GPX1 GPX1 (U/protein) GPX1 ARNm / GAPDH x Controles HTA basal HTA tratamiento Controles HTA basal HTA tratamiento p<.1 al comparar entre controles y pacientes sin tratar. p<.1 al comparar entre pacientes sin tratar y tratados.

22 3. 8 ARNm GSS/GAPDH x ARNm GSR/GAPDH x Controles HTA basal HTA tratamiento Controles HTA basal HTA tratamiento 8 5 ARNm GPX1/GAPDH x ARNm CuZnSOD/GAPDH x Controles HTA basal HTA tratamiento Controles HTA basal HTA tratamiento p<.1 al comparar entre controles y pacientes sin tratar. p<.1 al comparar entre pacientes sin tratar y tratados. SISTEMA TIOREDOXINA,14,16,12 mrna levels /GAPDH mrna,1,8,6,4 TXN TXN2 mrna levels/gapdh mrna,14,12,1,8,6,4 TXNRD1 TXNRD2 TXNRD3,2,2 Controls HTN baseline HTN treatment 3 HTN treatment 12 Controls HTN baselinehtn treatment 3 HTN treatment 12 months months months months

23 Niveles de ARNm NADP(H) OXIDASA en Controles, Hipertensos e Hipertensos tratados,5,45,4,35,3,25,2 P22phox P47phox P91phox rac1 rac2 P67phox,15,1,5, Controles HTA basal HTA tras 3 meses tratamiento HTA tras 12 meses tratamiento CONCLUSIONES Existe una alteración de los niveles de expresión de los genes protectores frente a EO que ocasiona parte del incremento de los niveles de EO en células circulantes en HTA y en otras enfermedades con alto riesgo cardiovascular.

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25 GP X1 NIVELES DE ARNm DE GENES PROTECTORES FRENTE A EO EN PACIENTES CON ENFERMEDADES DE ALTO RIESGO CARDIOVASCULAR GSS,3,8,25,7,6,2,5,15 GP X1,4 GSS,1,3,2,5,1 contr oles HTA HF HFC controles HTA HF HFC