Regulación de la expresión génica: genoma y proteoma. Regulación de la expresión génica: genoma y proteoma

Transcripción

1 Regulación de la expresión génica: Regulación de la expresión génica: genoma y proteoma genoma y proteoma Tipos de genes: Con trol gén ico: Constitutivos Qué genes se expresan Inducibles En qué momento Represibles Con qué pauta temporal Esquema de diferenciación tisular rogramas de diferenciación celular Regulación:40-50% 1 Regulación de la expresión génica Regulación de la expresión génica biosíntesis Estado estacionario degradación Expresión génica Funciones codificadas por genes humanos Gen Transcripción nucleótidos Transcrito primario rocesamiento post-transcripcional mrna maduro Hidrólisis del mrna Traducción roteína (inactiva) Modificaciones post-traducionales aminoácidos roteolisis Todos los procesos son regulados roteína (activa) Funciones fisiológicas 2

2 Control de la expresión génica en procariotas: operones Control de la expresión génica en procariotas: operones bacterianos bacterianos roteína unida: transcripción bloqueada Nivel basal de transcripción elevado Regulación por represión roteínas de control simples Organización génica en operones: Disociación: alivio de la inhibición Unidad de transcripción policistrónica Secuencias de control únicas Control conjunto por represor Acoplamiento Transcripción/Traducción: Regulación conjunta 3 Control génico en eucariotas: características generales Control génico en eucariotas: características generales Nivel basal de transcripción nulo Cromatina muy condensada Acceso al promotor restringido Mecanismo principal: control de la estimulación de la iniciación Regulación por activación Organización jerárquica Organización génica dispersa unidades de transcripción monocistrónicas Control individualizado de genes Señales de control múltiples roteínas reguladoras complejas Integración Control combinatorio Control alternativo rocesamiento del transcrito Variabilidad en splicing proteoma>>genoma Desacoplamiento transcripción/traducción Transporte al citosol regulado Regulación de la traducción Mecanismos de regulación Histonas rrna Transcripción (núcleo) citoplasma Dosis génica Silenciamiento génico (epigenético) Metilación del DNA Condensación de la cromatina Control de la iniciación Regulación de la elongación/terminación Splicing alternativo Edición del mrna Transporte nucleocitoplasmático Estabilidad del mrna Interferencia génica (irna) Regulación de la síntesis de proteínas 4

3 Condensación de la cromatina y transcripción Condensación de la cromatina y transcripción Empaquetamiento DNA/Histonas: promotores inaccesibles a factores TAF, RNApol elementos reguladores El empaquetamiento de los cromosomas metafásicos bloquea todo acceso al DNA ara la transcripción, el DNA debe remodelarse sin llegar a desorganizarse Sensibilidad a la DNasa I Cromatina activa: (promotor: sitios hipersensibles) obre en H1 oco metilada (CpG) Rica en HMGs Histonas acetiladas 5 El código de histonas El código de histonas Modificaciones conocidas de histonas Efectos de la modificación 6

4 Acetilación de histonas: condensación de cromatina Acetilación de histonas: condensación de cromatina Acetilación Acetilación de histonas Relaja unión DNA al nucleosoma romueve unión de TFs roporciona sitios de unión para reguladores (unión a bromodominios) Complejos de acetilación/desacetilación Bromodominios se unen a Ac-histonas DNA unido laxamente HAT Cromatina condensada No hay transcripción Cromatina relajada Si hay transcripción HDAC 7 Complejos reorganizadores de la cromatina Complejos reorganizadores de la cromatina Actividades enzimáticas Reorganización del nucleosoma Acetilación de histonas Reclutados por Trans-moduladores Co-moduladores Mediador Cambio conformacional AT-dependiente Reclutados por transactivadores/ mediador/co-mod oligómero >20 >10 >11 Subunidades compartidas con Mediador/THIID HATs HDACs HDAC actividad pcaf/saga HAT msin3 HDAC SWI/SNF Remodelado msin3 HDAC Represión: Desacetilación HAT pcaf HAT Activación: Acetilación Ensamblaje: HATs B CAF1 (H3/H4) NA1 (H2A/H2B) 8

5 Silenciamiento génico por metilación del DNA Silenciamiento génico por metilación del DNA 9 Amplificadores: Trans activación Amplificadores: Trans activación Elementos potenciadores -10 / -50 kb -200 roteínas reguladoras unidas a elementos de control Exones intrones y UTRs +10 / +50 kb -30 IC Complejo de preiniciación GTFs + RNApol Transactivadores Interacción activadora: Mediador/TFIID Unión a surco menor: curva en DNA dúplex cooperativas TFIID: TB 11 TAFs Mediador: >20 subunits unido a CTD Co-activadores Co-represores Se unen al IC Reclutan transactivadores Reclutan remodeladores 10

6 Amplificadores eucarióticos: elementos cis Amplificadores eucarióticos: elementos cis Núcleo del promotor: (core promoter) róximo a +1 Unión de RNApolII TATA GC-box Inr Elementos proximales: osición cercana (hasta -200 pb) Siempre 5 Orientación fija Afectan al promotor inmediato Todos los anteriores + Elementos de respuesta a hormonas choque térmico (HSTF) Amplificadores: Elementos distales ( kb) 5, 3 y en intrones Orientación bidireccional Controlan grupos de genes elemento s. consenso factor CAAT box GGCCAATCT GC box GGGCGG C/EB, CTF1 S1 Octámero ATTTGCAT Oct-1 κb GGGACTTTCC NF-κB ATF GTGACGT ATF HRE CRE sec. consenso TRE SRF GRE RARE factor CREB A-1 SRF AGAACAN3TGTTCT AGGTCAN5AGGTCA GR RAR/RXR 11 Elementos trans: Factores de Transcripción Elementos trans: Factores de Transcripción Función: Unión a elementos de control cis (DNA) Regular iniciación reclutamiento activación represión Estructura: N C AD DBD S1 Modulares D. unión a DNA (DBD) D. de activación (AD) Interacción proteína-proteína Diméricos AD DBD DBD LBD GR AD Gal4 Integración combinatoria Dominios de unión a DNA (DBDs): α-hélice protrusiva α-hélice 1.2 nm Contactos con surco mayor Surco 1.2 x nm Unión a secuencias específicas Sin desaparear bases (sin desenrollar) Muy conservados 80% en tres categorías HTH Dedos de Zn bzi surco mayor No existe un código constante Imposible predecir secuencias surco menor 12

7 Estructuras de dominios DBD Estructuras de dominios DBD hélice-giro-hélice (HTH) Homeodominio Dedos de Zn 60 aa C2 H2 30 aa S1 20 aa bzi: Cremalleras de leucina básicas Cx 60 aa 60 aa NR Interacción proteína-proteína 13 Dominios de transactivación Dominios de transactivación Dominios de transactivación: Diversidad estructural Cambio conformacional por unión a DNA Interacción con co-activadores Ovillo α-hélice anfipática (reclutamiento) Tipos de dominios Acídico Rico en Q Rico en Rico en S y T Hidrofóbicos Básicos muy potente promiscuo (todo tipo de genes) Represión Se pueden intercambiar módulos en proteínas quiméricas Un dominio AD rico en transactiva desde un elemento GC 14

8 Trans represión Trans represión Inverso funcional de la trans-activación Esencial para una red de control Construcción del complejo de amplificación impedida No hay transcripción Ejemplo: tumores de Wilms Mecanismos de represión: Represor WT-1 Competición por unión al DNA Bloqueo de dominios AD Bloqueo del reclutamiento de Co-activadores TFIID/Mediador GTFs Reclutamiento de remodeladores compactación/desacetilación A-1 SRF Elementos de control -1 kb Gen EGR-1 Esencial en el desarrollo Tumores posteriormente 15 Mediadores del Mediador: Mediadores del Mediador: co activadores y co represores co activadores y co represores Los transactivadores NO se unen a IC: roteínas de intermediación Co-moduladores: Centros de interacción (construcción del complejo proteíco) Reclutamiento de otros factores (Remodelamiento/HAT) Co-activadores:N-CoA, CB/p300 Co-represores: N-CoR CB/ p300 Red compleja de interacciones proteína-proteína TFIID/TAFs: Unión a Histona-Ac Similar a histonas (cromatina activa) Bromodominios Interacciones proteína-proteína Reconocimiento de promotor Construcción de IC Estabilización Unión a Inr etc promotores sin TATA a pel Ce ntral Subunidades compartidas entre complejos TFIID/ Mediator/ pcaf(saga) etc Reclutamiento Unión a trans-moduladores Remodelación Mediador: Multimérico (20 p) Interacciones proteína-proteína Reclutado sobre IC-CTD TAFs CAF Med 16

9 Regulación génica: Regulación génica: Integración cooperativa de señales Integración cooperativa de señales Regulación del gen de la transtiretina en hepatocitos GTFs Generales + específicos de tejido Compleja red de interacciones Trans-moduladores Mediator RNApol II IC remodelación co-moduladores TFIID untos de inicio alternativos Construcción por reclutamineto Construcción cooperativa 17 Integración combinatoria de señales Integración combinatoria de señales Aumento factorial de las opciones de regulación Diméricos: Homo/Heterodimerización A-1: combinaciones de fos/jun/otros Complejo multiproteico: Enhanceosome otenciosoma? Reconocimiento de señales cis repeticiones simetría El orden puede ser significativo Interacciones proteína-proteína uede combinarse con represores 18

10 Regulación de los factores de transcripción Regulación de los factores de transcripción Regulación de la unión al DNA por: Unión de ligandos Expresión diferencial (inducción) Fosforilación/desfosforilación Unión de ligandos Localización/secuestro Síntesis proteica inactivo activo fos jun La expresión génica es controlada por señales celulares Fosforilación/ desfosforilación Localización/ secuestro inactivo AT AD NR (ER,TR.RAR) citosol núcleo proteolisis citosol núcleo activo CREB SRF E2F/Rb NF-κB NF-AT Notch 19 Regulación génica: organización jerárquica Regulación génica: organización jerárquica Señal Organización jerárquica: Cascadas de reguladores Activación del regulador primario Unión al DNA (y otras acciones) Regulación alternativa: Expresión de un nuevo regulador que controla varios genes Varias rutas para cada gen Activación/represión coordinadas Expresión de reguladores secundarios Trans-activación roteínas activas Trans-represión Respuesta fisiológica celular No transcripción Supresión de proteínas activas 20

11 SF. de Receptores Nucleares: zonas conservadas SF. de Receptores Nucleares: zonas conservadas DBD AF1 CoA AF2 LBD CoR A/B H2N- variable aa C D unión DNA aa 42-94% E F -COOH unión ligando aa 15-57% Largos: Homodímeros >185 aa ER 946 R 777 GR 408 TR 432 RAR Cortos: Heterodímeros 1 1 <185 aa VDR 21 Estructura de Receptores Nucleares Estructura de Receptores Nucleares Reconocimiento de secuencias diana de DNA específicas DBD DNA Rotación de homo/herodímeros Represión bisagra LBD Unión de Ligando Homo/hetero-dimerización Trasactivación trascripcional 22

12 Estructura de los dominios DBD Estructura de los dominios DBD Caja : unión a hemi-elemento hexámero HRE Caja D: Dimerización Dedos de Zn: C4 Unión al DNA C5 caja D caja H2N- A/B C D E F -COOH 23 Unión al DNA: Elementos de Respuesta a Hormonas (HREs) Unión al DNA: Elementos de Respuesta a Hormonas (HREs) DR3 (MR, R, AR) palindrómicos GR dimérico secuencias consenso HRE DR3 DR4 RXR Repetiticiones directas DR4 DR5 Espaciado impone geometría de dimerización TR RAR DR5 RXR 24

13 Estructura del dominio de unión a ligando Estructura del dominio de unión a ligando H9 Activación de receptores nucleares: Cambios conformacionales inducidos por ligando H10 apo-lbd (desocupado) Interfaz de dimerización, Heptadas hidrofóbicas H9-H10 H10 H9 holo-lbd (ocupado) vista axial Glu Lys AF-2 τc Bolsillo hidrofóbico unión LXXLL φ φ XEφφ 25 Reclutamiento de co moduladores Reclutamiento de co moduladores Familia p160: co-activadores N-CoA / SRC1 GRI1 / TIF2 Unión de motivos LXXLL / AF-2 efecto hidrofóbico interacción iónica Motivos LXXLL bhlh AS Unión a NR Unión a CB/p300 Familia co-represores N-CoR SMRT Unión a la bisagra 26

14 Inhibición por tamoxifen Inhibición por tamoxifen ACTIVO INACTIVO Motivo φφ XEφφ fuera de lugar 27 Receptores Nucleares: Dimerización Receptores Nucleares: Dimerización R. glucocorticoides DR3 RAR DR5 RXR 28

15 Receptores nucleares: especificidad Receptores nucleares: especificidad RXR silente Orientación de hemisitios Espaciador Desviaciones de la secuencia consenso RXR activo 29 Acciones de los Receptores nucleares Acciones de los Receptores nucleares Esteroides: Glucocorticoides: Reacción estrés, Gluconeogénesis, lipolisis Activación de receptores nucleares Mineralcorticoides: Transporte Na+, K+ y Cl- en riñón Andrógenos/estrógenos: C. sexuales, ciclo menstrual rogestágenos: gestación Tiroideas: Metabolismo basal, desarrollo Retinoides (Vit. A): Retina, epitelios, morfogénesis Vitamina D: Metabolismo del Ca2+ (intestino y hueso) Unión al DNA transcripción Acción roteínas de Respuesta secundaria roteínas de Respuesta primaria roliferación Diferenciación Morfogénesis Factores de transcripción represión activación 30

16 Regulación transcripcional por R. Nucleares Regulación transcripcional por R. Nucleares 31 Controles de largo alcance Controles de largo alcance Controles de grupos génicos Afectan a grupos de genes coordinados Remodelado de la cromatina LCR: compactación de la cromatina Sólo activado en células eritroides ε: saco vitelino γ:hígado fetal β,δ:médula ósea adulta Cada gen tiene controles individuales Deleción causa talasemia Aisladores (elementos frontera) Limitan acción de amplificadores revienen efecto de posición Actúan por unión de proteínas 32

17 Regulación de la expresión génica: Regulación de la expresión génica: Edición del mrna maduro Edición del mrna maduro Edición: Cambiar la secuencia del mrna maduro Muy frecuente en mitocondrias y cloroplastos Mecanismo de edición: Modificación de bases in situ Reconocimiento de secuencia por RNA iglur(ama) Desaminación: C U A I ermeabiliadad al Ca2+ (plasticidad sináptica: memoria) Apo-B100 (500 kd): hepatocitos Apo-B48 (240 kd): intestino Apolipoproteína B hígado intestino conversión en codón stop Se une a LDL-R Cede colesterol a tejidos periféricos No se une a LDL-R No cede colesterol Dominio de unión a LDL-R 33 Estabilidad del mrna: opciones de regulación Estabilidad del mrna: opciones de regulación Recambio constitutivo: mrnas son muy estables en eucariotas Degradación por sistema enzimático específico Degradación regulada: 3 UTR 5 cap mrna Secuencias AUUUA repetidas en 3 UTR Reconocimiento por nucleasas 3 oli-a Estable Lábil Aumento de degradación: señal 3 UTR citoquinas Genes inmediatos tempranos Aumento de estabilidad sistema caseina/prolactina sistema TfR/Hierro (IREs ) Señal de degradación rápida Regulacion de la estabilidad del mrna de TfR por Fe Unión específica a secuencias de bucle IRE IRE-B activa (no Fe) protege de la degradación 34

18 Degradación citosólica constitutiva del mrna Degradación citosólica constitutiva del mrna Recambio: vía principal Degradación lenta progresiva de cola poli-a Acelerada por señales de AUUUA en 3 UTR Reclutamiento de endonucleasa específica Recambio: vía acelerada Señales codificadas en 5 UTR y 3 UTR 35 Regulación de la traducción: represión traduccional Regulación de la traducción: represión traduccional Secuestro de eif2: p-eif2 unido a eif2b Quinasa eif2: HCR Co-regulación globina-hemo Represores 3'UTR: Unión al mrna, bloqueo de eifs Represores 5'UTR: Elementos IRE No modifican degradación Unión de IRE-B previene iniciación de traducción Elementos IRE en 5 UTR Fe secuestrado por ferritina Fe disponible para Fe-enzimas 36

19 Insulina, mtor y síntesis de proteínas Insulina, mtor y síntesis de proteínas Insulina KB Insulina promueve el crecimiento celular estimulación raptor/rictor: Especificidad de sustratos mtor G L raptor G L rictor actividad quinasa p70 S6K Otras acciones mtor 4E-B 4E-B eef2-k eif-4e X eef2 Desfosfo-eEF2 activo elongación de proteínas rps6 Subunidad 40S Traducción 5'TO mrnas Biogénesis de ribosomas eif-4e eif-4a AB eif-4g eif-4e Mnk1 mrna ERKs Complejo de iniciación (eif3/mrna) Ensamblaje de ribosoma funcional Traducción de 5'cap-mRNAs (genes estructurales: proteínas ) 37