EXTRACCION DE POLIFENOLES ASISTIDA POR MICROONDAS A PARTIR DE Punica granatum L.

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1 EXTRACCION DE POLIFENOLES ASISTIDA POR MICROONDAS A PARTIR DE Punica granatum L. Alejandra Martínez-Ramírez 1, Juan Carlos Contreras-Esquivel 1 y Ruth Belares-Cerda 2 *. RESUMEN 1. Departamento de Bioquímica de los alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Coahuila. Blvd. Venustiano Carranza, 25,000. Saltillo, Coahuila, México. 2. Centro Kappa de Conocimiento S.C. Saltillo, Coahuila, México *Correo electrónico: El aprovechamiento de los residuos agroindustriales generados en nuestro país, es la pauta para reducir los niveles de contaminación, así como el empleo de tecnologías que tengas poco impacto ambiental. En el presente trabajo, se empleo la tecnología de microondas evaluando tiempos de 5, 20 y 30 minutos, así como tres agentes de extracción (agua y etanol 20 % y 60%) a una temperatura de 40 C. El mayor rendimiento en la extracción de polifenoles totales se obtiene con el empleo de agua y etanol 60% en un tiempo de 30 minutos (3.04 % y 2.93 % respectivamente). INTRODUCCION La granada (Punica granatum), es una fruta nativa de Irán, pero es una fruta que se ha cultivado por todas partes del mundo. (Samadloiy y colaboradores, 2008; Berry 2005). De acuerdo con Berry (2005); Aradhya y colaboradores (2006), reportan que la granada representa una fuente de azucares, vitamina C y de hierro, pero deficiente en calcio. Los compuestos fitoquímicos presentes en la granada, son una gama de compuestos fenolicos, tales como, los flavonoides (antocianinas), taninos condensados (proantocianidinas) y taninos hidrolizables (elagitaninos y galotaninos). (Jaiswal y colaboradores, 2010; Aguilar y colaboradores, 2007). Los compuestos polifenólicos son considerados metabólitos secundarios que se encuentran distribuidos por todas las partes de las plantas. (Silva, 1999; Miller y colaboradores, 2000; Melo, 2008; Queiroz, 2008; Soares, 2008). Son sintetizados en el retículo endoplásmico y son almacenados en vacuolas en el interior de la célula. (Queiroz, 2008) Los alimentos de origen vegetal, como, frutas, vegetales hortalizas y productos de grano entero son considerados como una fuente natural de compuestos antioxidantes. (Kornsteiner y colaboradores, 2005; Sales y colaboradores, 2010). Por lo tanto estos compuestos entran en el organismo humano por medio de la dieta (Neyestani, 2008). Los compuestos polifenolicos poseen propiedades antioxidantes que le confieren características y participación en los procesos responsables de color y el sabor astringente de algunos alimentos. (Soares, 2002; Silva y colaboradores 1999; Queiroz y colaboradores, 2002). Tienen la capacidad de precipitar las proteínas solubles, inhibir la oxidación de sustratos, moléculas simples o polímeros y de bio-sistemas. (Queiroz, 2002; Soares, 2002). Actúan como captadores de radicales libres y en algunas ocasiones en la quelación de metales. (Vázquez, 2007; Soares, 2002). La actividad antioxidante de los polifenoles se debe a sus propiedades reductoras, que dependen fundamentalmente por el número y la posición de los grupos hidroxilos en la molécula. (Melo y colaboradores, 2008; Miller y colaboradores, 2000). En las últimas décadas se han optimizado diferentes métodos de extracción que minimicen el daño al medio ambiente, y a su vez que se mejoren los rendimientos de reacción. La tecnología de microondas, se ha convertido durante los últimos años, en una herramienta que mejora la productividad de los procesos. (Wannberg, 2006; Duvernay, 2005). El microondas trabaja con radiaciones electromagnéticas que se encuentran en el rango de 0.3 a 300 GHz (λ = 1 hasta m). (Wannberg, 2006; Duvernay, 2005; Tsubaki 2008). En comparación con los métodos convencionales de calefacción, las microondas generan calor dentro del material, lo que conduce a velocidades de calentamiento más rápido y en períodos de tiempos más cortos. (Fang Li 2010; Duvernay, 2005 Wannberg, 2006.).

2 MATERIALES Y METODOS Materia prima. La granada (Punica granatum) variedad California compraron en una tienda de auto servicio en Saltillo Coahuila, México. Preparación y acondicionamiento de la cáscara de granada. Los frutos de granada fueron lavados con agua potable. La cáscara de los frutos se retiró de manera manual. Una vez separada la cáscara, nuevamente se lavó con agua potable y se deshidrató en un secador de charolas (Koleff K26, Querétaro, México) a 60 C hasta peso constante. Terminado el tiempo de secado, la cáscara se trituró con la ayuda de un mortero de porcelana, para posteriormente ser almacenada en bolsas herméticamente cerradas, para evitar alteraciones en su composición. Extracción de antioxidantes de cáscara de granada asistida por microondas. La cáscara de granada seca (5 g) se colocó en un reactor de teflón (240 ml). Para llevar a cabo la reacción, el reactor de teflón fue colocado en el equipo de microondas (Ethos Synth, Milestone, Bregamo, Italia) conteniendo el volumen del agente extractor (120 ml). Los factores evaluados fueron tiempos de 5, 20 y 30 min, concentraciones de etanol de 0, 20 y 60% y una temperatura de 40 C, en las extracciones de cascara de granada. El equipo de microondas controla parámetros como el tiempo, la potencia, presión, temperatura y agitación. Terminado el calentamiento de las muestras con la energía de microondas, la suspensión fue filtrada a través tela muselina. Los extractos obtenidos fueron almacenados en frascos protegiéndolos de la luz y en refrigeración. El material insoluble (cáscara tratada) fue deshidratado a 60 C hasta peso constante. Todos los experimentos de extracción fueron realizaron por triplicado. Evaluación de procianidinas totales (PT) y taninos condensados (TC) de extractos obtenidos de cáscara de granada, (Vermerris, y Nicholson (2009). Los PT y TC en extractos de los residuos agroindustriales fueron estimados por el método colorimétrico de la vainillina-acido sulfúrico. En un tubo de ensayo se colocan 500 µl de la muestra diluida apropiadamente con 1 ml de la solución de vainillina-acido sulfúrico 70% (comercial con pureza del 95-98%). Los tubos se mezclaron en vortex por 2 min y posteriormente fueron reposados por 15 minutos a 24 C. El color de la reacción es en tonos rosa o rojo cereza dependiendo de la concentración de taninos condensados. Terminado el tiempo de incubación se analizan en un espectrofotometreo de UV/visible (Marca VARIAN) a 500 nm. La concentración de PT y TC se determina con la ecuación de la recta de la curva patrón de acido gálico y catequina de pureza 98% Sigma Aldrich a una concentración de 100 ppm, respectivamente. Evaluación de taninos hidrolizables (TH). (Vermerris y Nicholson, 2009). Los taninos hidrolizables (TH) fueron evaluados por el método de fenol-folin-ciocalteu. En un tubo de ensaye fueron colocados 400 µl de la muestra y 400 µl del reactivo de fenol-folin-ciocalteu 2N (Sigma). El tubo fue agitado y se dejan reposar por 15 minutos a temperatura ambiente; posteriormente se agregan 400 µl de carbonato de sodio (0.01 M) y se diluye la mezcla con 2 ml de agua destilada. Los tonos de coloración de reacción están entre amarillo verdoso y verde oscuro. Las muestras son analizadas en un espectrofotómetro UV/Visible (Marca VARIAN) a 750 nm. La concentración de TH es determinada de acuerdo a la ecuación de la recta obtenida de la curva patrón de ácido gálico (Sigma-Aldrich) 200 ppm. Todos los análisis fueron realizados por triplicado. RESULTADOS Y DISCUSIONES Acondicionamiento de cáscara de granada. El peso de la cáscara de granada en base húmeda correspondió al 47%, mientras que las semillas y el jugo representaron el 53%. Estos resultados indican la alta proporción de residuos que son generados durante el procesamiento de la granada. La cáscara de granada llegó a peso constante luego de secar por 10 horas. El rendimiento de cáscara de granada deshidratada con respecto al fruto es de 12.12%. El contenido de humedad y cenizas presente en la cáscara de granada deshidratada fue de 0.41 y 3.19%, respectivamente. Extracción de polifenoles de cáscara de granada En la figura 1 se observa la liberación de ácido gálico como índice de taninos hidrolizables luego de exponer a la cáscara de granada en presencia de etanol en concentraciones de 0, 20 y 60 % a 40 C. El mayor rendimiento de ácido gálico fue de 2.89 % con agua en 30 minutos. Por otro lado los rendimientos de etanol 20 y 60% son de 0.94%

3 y 2.66% respectivamente. Los resultados obtenidos se ven afectados por la polaridad de los solventes empleados, pues el agua es una molécula muy polar, mientras que la mezcla de etanol- agua es moderadamente polar (J.M Coulson 2003), esto permite que la energía electromagnética se convierta en energía cinética que posteriormente se pierde en calor por fricción de las moléculas. Lo anterior permite una mayor liberación de los compuestos fenólicos. En el caso de la diferencia observada en la concentración de etanol al 20 % se debe a que solubiliza en menor proporción los compuestos fenólicos que el etanol que se encuentra en concentraciones de 0 y 60%. No se observa un diferencia significativa entre el empleo de etanol 60% 6 5 0% /40ºC 20%/ 40ºC 60%/ 40ºC Acido gálico (%) Tiempo (min) Figura 1. Efecto del tiempo y concentración de etanol sobre la liberación de polifenoles de cáscara de granada empleando irradiación por microondas. La liberación de catequina como índice de taninos condensados, se representa en la figura 2. En comparación con los resultados obtenidos en la evaluación de los taninos hidrolizables, el mayor rendimiento obtenido es de 0.29 % con etanol 60% en 30 minutos. Los taninos condensados tienen estructuras moleculares más complejas y con mayor peso molecular, lo que dificulta su liberación, además de que son menos solubles en agua % /40ºC 20%/ 40ºC 60%/ 40ºC Catequina (%) Tiempo (min) Figura 2. Efecto del tiempo y concentración de etanol sobre la liberación de polifenoles (catequina) de cáscara de granada empleando irradiación por microondas.

4 Yasoubi y col. (2007) llevaron a cabo un estudio de extracción de polifenoles de cáscara de granada empleando calentamiento convencional, fluidos supercríticos y ultrasonido en combinación con cinco solventes orgánicos (acetona, metanol, etanol, etil acetato y agua). Al utilizar fluidos supercríticos los autores lograron obtener un rendimiento de fenoles totales de %. Mientras que al utilizar ultrasounido como tecnología de extracción se logró incrementar el rendimiento hasta un 40%, le presente trabajo obtuvo rendimientos mayores a los presentados por Yasoubi y col. (2007). CONCLUSIONES Mediante el empleo de la tecnología del microondas, para la extracción de compuestos fenólicos a una temperatura de 40 C, se logran extraer los compuestos fenólicos a partir de la cáscara de granada, aunque los rendimientos no se encuentran por debajo de otros métodos extractivos, es importante optimizar el método. Pues en el estudio se observo que el tiempo es un factor que influye en la mayor liberación de los compuestos fenólicos. AGRADECIMIENTOS Por el apoyo otorgado para la realización de este proyecto dentro del Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica CONACYT-Gobierno del Estado de Coahuila; dentro del marco teórico del proyecto: Desarrollo y Aplicación de una Tecnología de Proceso de Nanoencapsulado de Antioxidantes Vegetales para Incrementar la Efectividad de Insumos Orgánicos en el Sector Alimenticio COAH-2008-C REFERENCIAS 1. Johan Wannberg, Karolina Ersmark, Mats Larhed. Microwave-Accelerated Synthesis of Protease Inhibitors. Top Curr Chem (2006) 266: Springer-Verlag Berlin Heidelberg Shuntaro Tsubaki, Hiroyuki Iida, Masahiro Sakamoto, Jun-Ichi Azuma. Microwave Heating of Tea Residue Yields Polysaccharides, Polyphenols, and Plant Biopolyester. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, P. Yasoubi, M. Barzegarl, M. A. Sahari andm. H. Azizi. Total Phenolic Contents and Antioxidant Activity of Pomegranate (Punica granatum L.) Peel Extracts. J. Agric. Sei. Technol. (2007) VoL 9: Ju-Fang Li, Fang Wei, Xu-Yan Dong, Lu-Lu Guo, Gang-You Yuan, Feng-Hong Huang, Mu-Lan Jiang, Yuan-Di Zhao, Guang-Ming Li, and Hong Chen. Microwave-assisted Approach for the Rapid Enzymatic Digestion of Rapeseed Meal. Food Sci. Biotechnol. 19(2): (2010). 5. Cristóbal Noé Aguilar, Antonio Aguilera-Carbo, Armando Robledo, Janeth Ventura, Ruth Belmares, Diego Martinez, Raul Rodríguez-Herrera, Juan Contreras. Production of Antioxidant Nutraceuticals by Solid-State Cultures of Pomegranate (Punica granatum) Peel and Creosote Bush (Larrea tridentata) Leaves. Food Technol. Biotechnol. 46 (2) (2008). 6. Harold E. Miller, Fred Rigelhof, Leonard Marquart, Aruna Prakash, and Mitch Kanter. Antioxidant Content of Whole Grain Breakfast Cereals, Fruits and Vegetables. Journal of the American College of Nutrition, Vol. 19, No. 3, 312S 319S (2000). 7. Sergio Eduardo Soares. Phenolic acids as antioxidants. Rev. Nutr., Campinas, 15(1):71-81, jan./abr., Margit Kornsteiner, Karl-Heinz Wagner, Ibrahim Elmadfa. Tocopherols and total phenolics in 10 different nut types. Food Chemistry 98 (2006) Mara Reis SILVA, Maria Aparecida Azevedo Pereira da SILVA. Nutritional aspects of phytates and tannins. Rev. Nutr., Campinas, 12(1): 5-19, jan./abr., Enayde de Almeida Melo*, Maria Inês Sucupira Maciel, Vera Lúcia Arroxelas Galvão de Lima, Rosilda Josefa do Nascimento. Capacidade antioxidante de frutas. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 44, n. 2, abr./jun., Carla Regina Amorim dos Anjos Queiroz, Sérgio Antônio Lemos de Morais e Evandro Afonso do Nascimento. Caracterizacao dos taninos da Aroeira-Preta (Myracrodruon urundeuva). R. Árvore, Viçosa- MG, v.26, n.4, p , Tirang R. Neyestani. Polyphenols and Immunity. Wild-Type Food in Health Promotion and Disease Prevention. Edited by: F. De Meester and R. R. Watson Humana Press Inc., Totowa, NJ.

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