REALPURE SPIN DNA/RNA KIT

Transcripción

1 REALPURE SPIN DNA/RNA KIT Ref. 50 Preps. 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION La extracción de ADN y ARN a partir de una única muestra es una necesidad para un numero creciente de aplicaciones. En muchas ocasiones no es fácil obtener réplicas de una misma muestra, como muestras de biopsia, focos únicos en células en cultivo o individuos de pequeños organismos. REALPURE SPIN DNA/RNA Kit provee un método rápido para la extracción y purificación simultánea de ADN genómico y ARN total a partir de una única muestra de células en cultivo y pequeñas muestras de tejidos, sangre, bacterias, levaduras, hongos y plantas. El proceso implica primero la lisis de las células o tejido de interés en un Tampón de guanidine isotiocianato, que rápidamente inactiva las RNasas y DNasas para asegurar una extracción de ADN y ARN intacto. El lisado se pasa a través de una DNA Spin columna, esta columna permite la unión selectiva del ADN genómico. La columna es lavada y el ADN es posteriormente eluido. Se añade etanol al líquido que ha pasado a través de la DNA Spin columna para crear las condiciones favorables para que el ARN se una, y la muestra es pasada por la RNA Spin columna, donde el ARN total se une a la membrana y los contaminantes son eliminados mediante lavados y luego el ARN total es eluido con agua libre de nucleasas. El kit permite purificar todas las especies de ARN, desde el ARN ribosomal y ARNm hasta el microarn (miarn) y el ARN de interferencia (ARNi). El ARN purificado puede ser utilizado en diversas aplicaciones incluidas real time PCR, RT-PCR, Northern blotting, ensayos de protección de la RNasa, primer extension y ensayos en arrays de expresión. El ADN genómico es de alta calidad y puede ser utilizado en reacciones de PCR, secuenciación, Southern blotting y análisis de SNP. Selective isolation of DNA and RNA from unique, precious samples is a demand for an increasing number of applications. Splitting is unfavourable if not impossible for a number of samples like biopsy samples, single foci from cell cultures or single individuals of small organisms. REALPURE SPIN DNA/RNA Kit provides a rapid method for the isolation and purification genomic DNA and total RNA simultaneously from a single sample of cultured animal cells, small tissues samples, blood, bacteria, yeast, fungi or plants. The process involves first the cells or tissue lysis in a highly denaturing guanidine-isothiocyanatecontaining buffer, that will rapidly inactive RNases and DNases to ensure isolation of intact DNA and RNA. The lysate is then passed through a DNA spin column; this column allows selective binding of genomic DNA. The column is washed and pure, ready-to-use DNA is the eluted. Ethanol is added to the flow-through from the DNA spin column to provide appropriate binding conditions for RNA, and the sample is the applied to a RNA spin column, where total RNA binds to the membrane and contaminants are efficiently washed away, high-quality RNA is then eluted. The kit purifies all sizes of RNA, from large mrna and ribosomal RNA down to microrna (mirna) and small interfering RNA (RNAi). The purified RNA can be used in a number of downstream applications including real time PCR, RT-PCR, Northern blotting, RNase protection and primer extension and expression array assays. The genomic DNA is of the highest quality and can be used in PCR reactions, sequencing, Southern blotting and SNP analysis. 1/19

2 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS Solución de Lisis ARN RNA Lysis Buffer Tampón de Lavado ARN RNA Washing Buffer Tampón de Elución ARN RNA Elution Buffer Tampón de Desinhibición Desinhibition Buffer Tampón de Lavado ADN DNA Washing Buffer Tampón de Elución ADN DNA Elution Buffer REAL DNA Spin Columnas REAL DNA Spin Columns REAL RNA Spin Columnas REAL RNA Spin Columns Tubos de Recogida Collection Tubes Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: * Etanol 100%. * Etanol 70% * Microtubos de 1.5 o 2 ml libres de RNasas * Microcentrifuga * Homogeneizadores generales para tejidos animales y de plantas * Nitrógeno líquido, mortero y maza * -mercaptoetanol. Ref. Ref. 50 preps Equipment and additional reagents required Tª ERS01 25 ml RT ERS02 22 ml RT ERS03 6 ml RT REA03 18 ml RT REA04 10 ml RT REA05 6 ml RT RSC01 50 unid. RT RSCR01 50 unid. RT R unid. RT * 100 % Ethanol * 70% Ethanol * Rnase-free 1.5 or 2 ml microtubes * Microcentrifuge * Mechanical homogenizator for animal and plants tissues * Liquid Nitrogen, mortar and pestle. -mercaptoethanol. 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares 3.1 Preliminary conditions OPCIONAL: El uso de -mercaptoetanol en la lisis es altamente recomendado para tejidos animales, particularmente en aquellos que se sabe que tienen un alto contenido en RNAsas (ejem. páncreas), al igual que en tejidos de plantas. También se recomienda para aquellos usuarios que quieren aislar RNA para aplicaciones muy sensibles o enriquecimiento de microrna. Preparar una cantidad apropiada de Tampón de Lisis RNA añadiendo 10 l de - mercaptoetanol por 1 ml de Tampón de Lisis RNA. Alternativamente, la Solución de Lisis RNA puede ser utilizada tal y como es suministrada. OPTIONAL: The use of -mercaptoethanol in lysis is highly recommended for most animal tissues, particularly those know to have a high RNAse content (ex. pancreas), as well as for most plant tissues. It is also recommended for uses who whish to isolate RNA for sensitive downstream applications or microrna enrichment. Add 10 l of -mercaptoethanol (provided by the user) to each 1 ml of Lysis Buffer required. Alternatively, the Lysis Buffer can be used as provided. 2/19

3 NO utilizar más muestra que la indicada en la DNA Spin columna, ya que esto llevará a co-purificar ADN con ARN. Tampoco sobrecargar la RNA Spin columna ya que esto reducirá el rendimiento y pureza del ARN total obtenido. Algunos tejidos o muestras pueden contener cantidades altas de ADN lo que sobrecargará la DNA Spin columna, para estas muestras, se recomienda realizar una digestión de DNasa si el eluido de ARN total va a ser utilizado posteriormente en aplicaciones sensibles a la presencia de pequeñas cantidades de ADN. ATENCION: El Tampón de Lisis RNA contiene Guanidine isothiocianato y el tampón de desinhibición contienen Guanidine hydrochloride, ambos son agentes irritantes, por lo que es conveniente la utilización de guantes y gafas para su manejo Do not overload the DNA Spin column, as this will lead to co purification of DNA with RNA. Do not overload the RNA Spin column, as this will significantly reduce RNA yield and purity. Some tissues or samples can contain very high amounts of DNA will overload the DNA Spin column, for these samples, we recommended performing DNase digestion if the eluted RNA will be used in downstream applications sensitive to very small amounts of DNA. ATTENTION: The Lysis Solution contains Guanidine thiocyanate and the Desinhibition Buffer contains Guanidine hydrochloride which is an irritant agent, for this reason we recommend to use gloves and glasses for its manipulation. 3.2 Preparaciones preliminares 3.2 Preliminary Preparations Añadir 50 ml de Etanol 100 % al Tampón de Lavado RNA, con lo que el volumen final será de 72 ml.mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. Añadir 10 ml de Etanol 100 % al Tampón de Desinhibición. Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. Añadir 40 ml de Etanol 100 % al Tampón de Lavado DNA. Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. Precalentar el Tampón de Elución DNA a 70ºC. El resto de soluciones deben estar a temperatura ambiente. Add 50 ml of 100% Ethanol to the RNA Wash Buffer. This will give a final volume of 72 ml. Keep the container closed to avoid ethanol evaporation. Add 10 ml of 100 % Ethanol to the Desinhibition Buffer. Keep the container closed to avoid the ethanol evaporation Add 40 ml of 100% Ethanol to the DNA Wash Buffer. Keep the container closed to avoid the ethanol evaporation. Pre-heat the Elution Buffer DNA at 70ºC. Ensure that all the rest of solutions are at room temperature prior use. 3.3 Protocolo de extracción de ADN/ARN a partir de células en cultivo monocapa Protocol of DNA/RNA isolation from cultured animal cells growing in a monolayer Nota: La máxima cantidad recomendada de células es 1 x Los pellets de células pueden ser conservados a -70ºC para un uso posterior (determinar el número de células antes de congelar). Los pellets congelados no deberán ser conservados más de 2 semanas para asegurar que la integridad del ARN no se verá comprometida. El Tampón de lisis RNA se añadirá directamente sobre los pellets congelados sin dejar que alcancen la temperatura ambiente. Note: The maximum recommended input of cells is 1 x 10 6.Cell pellets can be stored at -70ºC for later use or used directly in the procedure. Determine the number of cell present before freezing. Frozen pellets should be stored no longer than 2 weeks to ensure that the integrity of the RNA is not compromised. Frozen pellets should not be thawed to beginning the protocol. Add the Lysis buffer directly to the frozen cell pellet. 3/19

4 Protocolo para la extracción de ARN total de células creciendo en monocapa 1. Aspirar el medio y lavar las células con una cantidad apropiada de PBS. Aspirar el PBS. 2. Añadir 400l de Tampón de Lisis RNA directamente a la placa de cultivo. 3. Lisar las células, tapar la placa y agitar el tampón alrededor de la superficie de la placa durante 5 minutos. 4. Pasar el lisado a un microtubo. IMPORTANTE: Anotar la cantidad de lisado. 5. Añadir 15 l de etanol 100 % por cada 100 l de lisado. Mezclar mediante 10 segundos. 6. Ensamblar una DNA Spin columna con un tubo de recogida que se suministra. 7. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto. 8. Retener el líquido que ha pasado a través de la columna y que se encuentra en el tubo de recogida y que contiene el ARN total. Pasar el líquido retenido a un microtubo nuevo de 1.5 ml (no suministrado con el kit). 9. Ensamblar la DNA Spin columna con un tubo de recogida y conservar a temperatura ambiente (15-25ºC) o a 4ºC para purificación del ADN más tarde. 10. Añadir 450 l de Etanol % al líquido retenido que contiene el ARN total. Mezcla por vortex 10 segundos. Después de la adición del etanol se podrá apreciar un precipitado, asegurarse de que todo el precipitado se añade a la RNA Spin columna. 11. Ensamblar una RNA Spin columna con un tubo de recogida que se suministra. 12. Aplicar la mitad del liquido + etanol en la RNA Spin columna y centrifugar durante 1 minuto. Descartar el líquido y reensamblar la columna con su tubo de recogida. 13. Repetir el punto 12 hasta completar la captura de todo el ARN total. 14. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la Asegurarse que todo el tampón de lavado ha pasado a través de la columna, sino fuera así centrifugar otro minuto adicional. 15. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. 16. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida. 17. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml (no suministrado con el kit) para eluir el ARN total. 18. Añadir l de Tampón de Elución RNA a la columna. 19. Centrifugar durante 2 minutos a 200xg (aprox rpm), seguido de 1 minuto a xg (aprox rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a x g (aprox rpm). 20. El ARN purificado puede ser conservado a - 20ºC durante algunos días. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos Protocolo para la extracción de ADN genómico de células creciendo en monocapa 1. Añadir 500 l de Tampón de Desinhibición a la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 2. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 3. 2º Lavado. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido 4. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar todo el etanol residual. 5. Eliminar el tubo de recolección y insertar la DNA Spin columna en un microtubo de 1.5 ml. Añadir l Tampón de Elución DNA (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la DNA Spin columna. Incubar durante 1 minuto. 6. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. El microtubo contiene ahora el ADN genómico. 4/19

5 Protocol for total RNA extraction from cultured animal cells growing in a monolayer 1. Aspirate media and wash cell monolayer with an appropriate amount of PBS. Aspirate PBS 2. Add 400 l of Lysis Buffer directly to culture plate. 3. Lyse cells by gently tapping culture dish and swirling buffer around plate surface for five minutes. 4. Transfer lysate to a microcentrifuge tube. IMPORTANT: Note the volume of the lysate. 5. Add 15 l of 100 % ethanol every 100 l of lysate. Mix by vortexing for 10 seconds. 6. Assemble a DNA Spin column with one 7. Apply the clarified lysate with ethanol onto the columns. Centrifuge for 1 minute. 8. Retains the flowthrough, which contains the total RNA. Use the flowthrough for RNA purification. Transfer the flowthrough to a new RNase-free microcentrifuge tube (not provided). 9. Place the DNA Spin column in a new collection tube and store at room temperature (15-25ºC) or a 4ºC for later DNA purification. 10. Add 450 l of % Ethanol to the flowthrough. Mix by vortexing for 10 seconds. After addition of ethanol a stringy precipitate may become visible, be sure to load all of the precipitate on the RNA Spin column. 11. Assemble a RNA Spin column with one 12. Apply half of the flowthrough with ethanol onto the columns and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with the collection tube. 13. Repeat step 12 to complete the capture of the total RNA. 14. Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Ensure the entire wash buffer has passed through into the collection tube by inspecting the column. If the entire wash volume has not passed, spin for an additional minute. 15. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with its collection tube. Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute 16. Wash column a third time by adding another 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and centrifuge for 2 minutes to eliminate the residual ethanol. En sure that the column is dry and discard the collection tube with the flowthrough. 17. Place the column into a fresh 1.5 ml microfuge tube (not provided in the kit) 18. Add 50 l-100 of Elution Buffer RNA to the column. 19. Centrifuge for 2 minutes at 200x g (aprox rpm), followed by 1 minute at xg (aprox rpm). Note the volume eluted from the column. If the entire 50 l has not been eluted, spin the column at x g (aprox rpm) for 1 additional minute. 20. The purified microrna sample may be stored at -20ºC for a few days. It is recommended that samples be placed at - 70ºC for long term storage Protocol for Genomic DNA isolation from cultured animal cells growing in a monolayer 1. Add 500 l of Desinhibition Buffer to the DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 2. Add 500 l of Wash Buffer DNA into reservoir of DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 3. 2º Wash. Add 500 l of Wash Buffer DNA into reservoir of DNA Spin column Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 4. Centrifuge at maximum speed for 120 seconds to remove the residual ethanol. 5. Remove the collection tube and insert the DNA Spin Column in a 1.5 ml microtube. Add 100l of elution buffer (preheated at 70ºC) into reservoir of DNA Spin column. Incubate 1 minute. 6. Centrifuge at maximum speed for 60 seconds. The microtube contains now the genomic DNA. 5/19

6 3.4. Protocolo de extracción de ADN/ARN a partir de células creciendo en suspensión Protocol of DNA/RNA isolation from cells growing in suspension Protocolo de extracción de ARN total de células creciendo en suspensión 1. Transferir la suspensión celular a un tubo libre de RNAsas (no suministrado) y centrifugar a no más de 200x g (aprox rpm) durante 10 minutos para obtener el pellet de las células. 2. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante. 3. Añadir 400 l de Tampón de Lisis RNA al pellet. Lisar las células por vortex durante 15 segundos. Asegurarse que todo el pellet está disuelto antes de proceder con el siguiente paso. 4. Pasar el lisado a un microtubo. IMPORTANTE: Anotar la cantidad de lisado. 5. Añadir 15 l de etanol 100 % por cada 100 l de lisado. Mezcla por vortex 10 segundos. 6. Ensamblar una DNA Spin columna con 7. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto. 8. Retener el líquido que ha pasado a través de la columna y que se encuentra en el tubo de recogida y que contiene el ARN total. Pasar el líquido retenido a un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit). 9. Ensamblar la DNA Spin columna con un tubo de recogida y conservar a temperatura ambiente (15-25ºC) o a 4ºC para purificación del ADN más tarde. 10. Añadir 450 l de Etanol % al líquido retenido que contiene el ARN total. Mezcla por vortex 10 segundos. Después de la adición del etanol se podrá apreciar un precipitado, asegurarse de que todo el precipitado se añade a la RNA Spin columna. 11. Ensamblar una RNA Spin columna con 12. Aplicar la mitad del liquido + etanol en la RNA Spin columna y centrifugar durante 1 minuto. Descartar el líquido y reensamblar la columna con su tubo de recogida. 13. Repetir el punto 12 hasta completar la captura de todo el ARN total. 14. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo el tampón de lavado ha pasado a través de la columna, sino fuera así centrifugar otro minuto adicional. 15. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la 16. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida. 17. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total. 18. Añadir l de Tampón de Elución RNA a la columna. 19. Centrifugar durante 2 minutos a 200xg (aprox rpm), seguido de 1 minuto a xg (aprox rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a x g (aprox rpm). 20. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos días. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos Protocolo de extracción de ADN genómico de células creciendo en suspensión 1. Añadir 500 l de Tampón de Desinhibición a la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 2. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 3. 2º Lavado. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido 4. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar todo el etanol residual. 5. Eliminar el tubo de recolección y insertar la DNA Spin columna en un microtubo de 1.5 ml. Añadir l Tampón de Elución DNA (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la DNA Spin columna. Incubar durante 1 minuto. 6. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. El microtubo contiene ahora el ADN genómico. 6/19

7 Protocol for total RNA isolation from cells growing in suspension 1. Transfer cell suspension to an RNase-free tube (not provided) and centrifuge at no more than 200x g (aprox rpm) for 10 minutes to pellet cells. 2. Carefully decant the supernatant. 3. Add 400 l of Lysis Buffer RNA to the pellet. Lyse cells by vortexing for 15 seconds. Ensure that the entire pellet is completely dissolved before proceeding to the next step. IMPORTANT: Note the volume of the lysate. 4. Transfer lysate to a microcentrifuge tube. IMPORTANT: Note the volume of the lysate. 5. Add 15 l of 100 % ethanol to every 100l of lysate. Mix by vortexing for 10 seconds. 6. Assemble a DNA Spin column with one 7. Apply the clarified lysate with ethanol onto the columns. Centrifuge for 1 minute. 8. Retains the flowthrough, which contains the total RNA. Use the flowthrough for RNA purification. Transfer the flowthrough to a new RNase-free microcentrifuge tube (not provided). 9. Place the DNA Spin column in a new collection tube and store at room temperature (15-25ºC) or a 4ºC for later DNA purification. 10. Add 450 l of % Ethanol to the flowthrough. Mix by vortexing for 10 seconds. After addition of ethanol a stringy precipitate may become visible, be sure to load all of the precipitate on the RNA Spin column. 11. Assemble a RNA Spin column with one 12. Apply half of the flowthrough with ethanol onto the columns and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with the collection tube. 13. Repeat step 12 to complete the capture of the total RNA. 14. Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Ensure the entire wash buffer has passed through into the collection tube by inspecting the column. If the entire wash volume has not passed, spin for an additional minute. 15. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with its collection tube. Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute 16. Wash column a third time by adding another 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and centrifuge for 2 minutes to eliminate the residual ethanol. En sure that the column is dry and discard the collection tube with the flowthrough. 17. Place the column into a fresh 1.5 ml microfuge tube (not provided in the kit) 18. Add 50 l-100 of Elution Buffer RNA to the column. 19. Centrifuge for 2 minutes at 200xg (aprox rpm), followed by 1 minute at xg (aprox rpm). Note the volume eluted from the column. If the entire 50 l has not been eluted, spin the column at xg (aprox rpm) for 1 additional minute. 20. The purified microrna sample may be stored at -20ºC for a few days. It is recommended that samples be placed at - 70ºC for long term storage Protocol for Genomic DNA isolation from cells growing in suspension 1. Add 500 l of Desinhibition Buffer to the DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 2. Add 500 l of Wash Buffer DNA into reservoir of DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 3. 2º Wash. Add 500 l of Wash Buffer DNA into reservoir of DNA Spin column Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 4. Centrifuge at maximum speed for 120 seconds to remove the residual ethanol. 5. Remove the collection tube and insert the DNA Spin Column in a 1.5 ml microtube. Add 100l of elution buffer (preheated at 70ºC) into reservoir of DNA Spin column. Incubate 1 minute. 6. Centrifuge at maximum speed for 60 seconds. The microtube contains now the genomic DNA. 7/19

8 3.5. Protocolo de extracción de ADN/ARN a partir de tejidos animales Protocol of DNA/RNA isolation from animal tissues Nota: El ARN en tejidos animales no se encuentra protegido hasta que después de su recolección es roto y homogenizado en la Solución de Lisis. Para este procedimiento se pueden utilizar tanto tejidos frescos como congelados. Los tejidos deberían congelarse en nitrógeno líquido y transferidos inmediatamente a -70ºC para almacenamientos largos. Cuando aislamos ARN total de tejidos congelados asegurase que no asciende mucho su temperatura durante el pesaje y la pulverización con una mano de mortero. Note: RNA in animal tissues is not protected after harvesting until it is disrupted and homogenized into Lysis solution. Fresh or frozen tissues may be used for the procedure. Tissues should be flashfrozen in liquid nitrogen and transfer immediately to a -70ºC freezer for long term storage. When isolating total RNA from frozen tissues, you need to ensure that the tissue does not thaw during weighing or prior to grinding with the mortar and pestle Protocolo de extracción de ARN total a partir de tejidos animales 1. Determinar la cantidad de tejido a pesar, se recomienda no utilizar más de 10 mg de tejido. 2. Colocar el tejido en un mortero que contenga una cantidad apropiada de nitrógeno líquido para cubrir la muestra. Pulverizar el tejido utilizando una mano de mortero. Permitir que el nitrógeno líquido se evapore, sin que se descongele la muestra. 3. Pasar la muestra a un microtubo libre de RNAsas (no suministrado) y añadir 400 l de Tampón de Lisis RNA. Homogenizar pasando el lisado 5 o 10 veces a través de una jeringa con una aguja de 25 o con un homogenizador eléctrico de mano. 4. Centrifugar durante 2 minutos para obtener el pellet de algún desecho celular que pueda quedar. Pasar el sobrenadante a un microtubo libre RNAsas nuevo (no suministrado).importante: Anotar la cantidad de sobrenadante/lisado. 5. Añadir 15 l de etanol 100 % por cada 100 l de lisado. Mezclar por vortex 10 segundos. 6. Ensamblar una DNA Spin columna con 7. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto. 8. Retener el líquido que ha pasado a través de la columna y que se encuentra en el tubo de recogida y que contiene el ARN total. Pasar el líquido retenido a un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit). 9. Ensamblar la DNA Spin columna con un tubo de recogida y conservar a temperatura ambiente (15-25ºC) o a 4ºC para purificación del ADN más tarde. 10. Añadir 450 l de Etanol % al líquido retenido que contiene el ARN total. Mezcla por vortex 10 segundos. Después de la adición del etanol se podrá apreciar un precipitado, asegurarse de que todo el precipitado se añade a la RNA Spin columna. 11. Ensamblar una RNA Spin columna con 12. Aplicar la mitad del liquido + etanol en la RNA Spin columna y centrifugar durante 1 minuto. Descartar el líquido y reensamblar la columna con su tubo de recogida. 13. Repetir el punto 12 hasta completar la captura de todo el ARN total. 14. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo el tampón de lavado ha pasado a través de la columna, sino fuera así centrifugar otro minuto adicional. 15. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la 16. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida. 17. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total. 18. Añadir l de Tampón de Elución RNA a la columna. 19. Centrifugar durante 2 minutos a 200x g (aprox rpm), seguido de 1 minuto a xg (aprox rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a x g (aprox rpm). 20. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos días. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos. 8/19

9 Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de tejidos animales 1. Añadir 500 l de Tampón de Desinhibición a la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 2. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 3. 2º Lavado. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido 4. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar todo el etanol residual. 5. Eliminar el tubo de recolección y insertar la DNA Spin columna en un microtubo de 1.5 ml. Añadir l Tampón de Elución DNA (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la DNA Spin columna. Incubar durante 1 minuto. 6. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. El microtubo contiene ahora el ADN genómico Protocol for Total RNA isolation from animal tissues 1. Determine the amount of tissue by weighing. It is recommended that no more than 10 mg of tissue be used for the protocol. 2. Transfer the tissue into a mortar that contains an appropriate amount of liquid nitrogen to cover the sample. Grind the tissue thoroughly using a pestle. Allow the liquid nitrogen to evaporate, without allowing the tissue to thaw. 3. Transfer the sample to an RNase-free tube (not provided)) and add 400 l de Lysis Buffer. Homogenize by passing the lysate 5-10 times through a 25 gauge needle attached to a syringe or an electrical homogenizator. 4. Spin the lysate for 2 minutes to pellet any cell debris. Transfer de supernatant to another RNase-free microcentrifuge tube. IMPORTANT: Note the volume of the supernatant/lysate. 5. Add 15 l of 100 % ethanol to every 100l of lysate.. Mix by vortexing for 10 seconds. 6. Assemble a DNA Spin column with one 7. Apply the clarified lysate with ethanol onto the columns. Centrifuge for 1 minute. 8. Retains the flowthrough, which contains the total RNA. Use the flowthrough for RNA purification. Transfer the flowthrough to a new RNase-free microcentrifuge tube (not provided). 9. Place the DNA Spin column in a new collection tube and store at room temperature (15-25ºC) or a 4ºC for later DNA purification. 10. Add 450 l of % Ethanol to the flowthrough. Mix by vortexing for 10 seconds. After addition of ethanol a stringy precipitate may become visible, be sure to load all of the precipitate on the RNA Spin column. 11. Assemble a RNA Spin column with one 12. Apply half of the flowthrough with ethanol onto the columns and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with the collection tube. 13. Repeat step 12 to complete the capture of the total RNA. 14. Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Ensure the entire wash buffer has passed through into the collection tube by inspecting the column. If the entire wash volume has not passed, spin for an additional minute. 15. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with its collection tube. Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute 16. Wash column a third time by adding another 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and centrifuge for 2 minutes to eliminate the residual ethanol. En sure that the column is dry and discard the collection tube with the flowthrough. 17. Place the column into a fresh 1.5 ml microfuge tube (not provided in the kit) 18. Add 50 l -100 of Elution Buffer RNA to the column. 9/19

10 19. Centrifuge for 2 minutes at 200xg (aprox rpm), followed by 1 minute at x g (aprox rpm). Note the volume eluted from the column. If the entire 50 l has not been eluted, spin the column at xg (aprox rpm) for 1 additional minute. 20. The purified microrna sample may be stored at -20ºC for a few days. It is recommended that samples be placed at - 70ºC for long term storage Protocol for Genomic DNA isolation from animal tissues 1. Add 500 l of Desinhibition Buffer to the DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 2. Add 500 l of Wash Buffer DNA in to reservoir of DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 3. 2º Wash. Add 500 l of Wash Buffer DNA into reservoir of DNA Spin column Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 4. Centrifuge at maximum speed for 120 seconds to remove the residual ethanol. 5. Remove the collection tube and insert the DNA Spin Column in a 1.5 ml microtube. Add 100l of elution buffer (preheated at 70ºC) into reservoir of DNA Spin column. Incubate 1 minute. 6. Centrifuge at maximum speed for 60 seconds. The microtube contains now the genomic DNA Protocolo de extracción de ADN/ARN a partir de sangre. Protocol of DNA/RNA isolation from blood Nota: Se recomienda no utilizar más de 100 l de sangre total con el fin de prevenir el colapsado de la membrana. Recomendamos el uso de este kit para la extracción de ARN a partir de sangre fresca no coagulada, utilizando EDTA como anticoagulante Note: It is recommended that no more than 100 l of blood be used in order to prevent clogging of the column. We recommend the use of this kit to isolate RNA from non coagulating fresh blood using EDTA as the anti-coagulant Protocolo de extracción de ARN total a partir de sangre 1. Transferir 100 l de sangre no coagulada a un microtubo libre RNAsas (no suministrado). 2. Añadir 300 l de Tampón de Lisis RNA a la sangre. Lisar las células por vortex durante 15 segundos. Asegurarse que la mezcla está transparente antes de proceder con el siguiente paso. IMPORTANTE: Anotar la cantidad de lisado. 3. Añadir 15 l de etanol 100 % por cada 100 l de lisado. Mezcla por vortex 10 segundos. 4. Ensamblar una DNA Spin columna con 5. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto. 6. Retener el líquido que ha pasado a través de la columna y que se encuentra en el tubo de recogida y que contiene el ARN total. Pasar el líquido retenido a un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit). 7. Ensamblar la DNA Spin columna con un tubo de recogida y conservar a temperatura ambiente (15-25ºC) o a 4ºC para purificación del ADN más tarde. 8. Añadir 450 l de Etanol % al líquido retenido que contiene el ARN 10/19 total. Mezcla por vortex 10 segundos. Después de la adición del etanol se podrá apreciar un precipitado, asegurarse de que todo el precipitado se añade a la RNA Spin columna. 9. Ensamblar una RNA Spin columna con 10. Aplicar la mitad del liquido + etanol en la RNA Spin columna y centrifugar durante 1 minuto. Descartar el líquido y reensamblar la columna con su tubo de recogida. 11. Repetir el punto 12 hasta completar la captura de todo el ARN total. 12. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo el tampón de lavado ha pasado a través de la columna, sino fuera así centrifugar otro minuto adicional. 13. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la 14. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la

11 Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida. 15. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total. 16. Añadir l de Tampón de Elución RNA a la columna. 17. Centrifugar durante 2 minutos a 200xg (aprox rpm), seguido de 1 minuto a xg (aprox rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a x g (aprox rpm). 18. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos días. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos Protocolo de extracción de ADN genómico de sangre 1. Añadir 500 l de Tampón de Desinhibición a la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 2. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 3. 2º Lavado. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido 4. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar todo el etanol residual. 5. Eliminar el tubo de recolección y insertar la DNA Spin columna en un microtubo de 1.5 ml. Añadir l Tampón de Elución DNA (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la DNA Spin columna. Incubar durante 1 minuto. 6. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. El microtubo contiene ahora el ADN genómico Protocol for Total RNA isolation from blood 1. Transfer up to 100 f non coagulating blood to an RNase free microcentrifuge tube (not provided). 2. Add 300 l of Lysis Buffer to the blood. Lyse cells by vortexing for 15 seconds. Ensure that the mix become transparent before proceeding to the next step. IMPORTANT: Note the volume of the supernatant/lysate. 3. Add 15 l of 100 % ethanol every 100 l of lysate. Mix by vortexing for 10 seconds. 4. Assemble a DNA Spin column with one 5. Apply the clarified lysate with ethanol onto the columns. Centrifuge for 1 minute. 6. Retains the flowthrough, which contains the total RNA. Use the flowthrough for RNA purification. Transfer the flowthrough to a new RNase-free microcentrifuge tube (not provided). 7. Place the DNA Spin column in a new collection tube and store at room temperature (15-25ºC) or a 4ºC for later DNA purification. 8. Add 450 l of % Ethanol to the flowthrough. Mix by vortexing for 10 seconds. After addition of ethanol a stringy precipitate may become visible, be sure to load all of the precipitate on the RNA Spin column. 9. Assemble a RNA Spin column with one 10. Apply half of the flowthrough with ethanol onto the columns and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with the collection tube. 11. Repeat step 12 to complete the capture of the total RNA. 12. Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Ensure the entire wash buffer has passed through into the collection tube by inspecting the column. If the entire wash volume has not passed, spin for an additional minute. 13. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with its collection tube. 11/19

12 Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute 14. Wash column a third time by adding another 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and centrifuge for 2 minutes to eliminate the residual ethanol. En sure that the column is dry and discard the collection tube with the flowthrough. 15. Place the column into a fresh 1.5 ml microfuge tube (not provided in the kit) 16. Add 50 l -100 of Elution Buffer RNA to the column. 17. Centrifuge for 2 minutes at 200xg (aprox rpm), followed by 1 minute at xg (aprox rpm). Note the volume eluted from the column. If the entire 50 l has not been eluted, spin the column at x g (aprox rpm) for 1 additional minute. 18. The purified microrna sample may be stored at -20ºC for a few days. It is recommended that samples be placed at - 70ºC for long term storage Protocol for Genomic DNA isolation from blood 1. Add 500 l of Desinhibition Buffer to the DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 2. Add 500 l of Wash Buffer DNA into reservoir of DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 3. 2º Wash. Add 500 l of Wash Buffer DNA into reservoir of DNA Spin column Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 4. Centrifuge at maximum speed for 120 seconds to remove the residual ethanol. 5. Remove the collection tube and insert the DNA Spin Column in a 1.5 ml microtube. Add 100l of elution buffer (preheated at 70ºC) into reservoir of DNA Spin column. Incubate 1 minute. 6. Centrifuge at maximum speed for 60 seconds. The microtube contains now the genomic DNA Protocolo de extracción de ADN/ARN a partir de bacterias Protocol of DNA/RNA isolation from bacteria Nota: Se recomienda no utilizar más de 1 x 10 9 células /ml, el crecimiento bacteriano puede ser medido por un espectrofotómetro, como regla general, un cultivo de E.coli de 1 x 10 9 células /ml tiene una DO 600 de 1.0. Preparar una cantidad apropiada de TE conteniendo lisozima, esta solución se preparará con TE libre de RNAsas y conservado en hielo hasta su uso. Para Gram negativos la concentración de lisozima será de 1 mg/ml y Gram-positivos la concentración de lisozima será de 3 mg/ml. Note: It is recommended that no more than 1 x 10 9 bacteria cells be used. Bacterial growth can be measured using a spectrophotometer, as a general rule, an E.coli culture containing 1 x 10 9 bacteria cells has an OD 600 of 1.0. Prepare the appropriate lysozyme-containing TE buffer, this solution should be prepared with sterile, Rnase free TE buffer, and kept on ice until needed. For Gram-negative the concentration of lysozyme will be of 1 mg/ml and for Gram-positive the concentration of lysozyme will be of 3 mg/ml Protocolo de extracción de ARN total a partir de bacterias 1. Obtener el pellet de las células por centrifugación a x g (aprox rpm) durante 1 minuto. 2. Eliminar el sobrenadante y resuspender por vortex el pellet en 100 l del TE con la cantidad apropiada de lisozima. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. 3. Añadir 200 l de Tampón de Lisis RNA y vortex durante 15 segundos. 4. Añadir 50 l de Etanol % al lisado. Mezcla por vortex 10 segundos. Asegurarse que el pellet es completamente disuelto antes de proceder con el siguiente paso. 5. Ensamblar una DNA Spin columna con 6. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto. 7. Retener el líquido que ha pasado a través de la columna y que se encuentra en el tubo de recogida y que contiene el ARN total. Pasar el líquido retenido a un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit). 8. Ensamblar la DNA Spin columna con un tubo de recogida y conservar a temperatura ambiente (15-25ºC) o a 4ºC para purificación del ADN más tarde. 9. Añadir 450 l de Etanol % al líquido retenido que contiene el ARN total. Mezcla por vortex 10 segundos. Después de la adición del etanol se podrá apreciar un precipitado, asegurarse de 12/19

13 que todo el precipitado se añade a la RNA Spin columna. 10. Ensamblar una RNA Spin columna con 11. Aplicar la mitad del liquido + etanol en la RNA Spin columna y centrifugar durante 1 minuto. Descartar el líquido y reensamblar la columna con su tubo de recogida. 12. Repetir el punto 12 hasta completar la captura de todo el ARN total. 13. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo el tampón de lavado ha pasado a través de la columna, sino fuera así centrifugar otro minuto adicional. 14. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la 15. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida. 16. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total. 17. Añadir l de Tampón de Elución RNA a la columna. 18. Centrifugar durante 2 minutos a 200xg (aprox rpm), seguido de 1 minuto a xg (aprox rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a x g (aprox rpm). 19. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos días. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de bacterias 1. Añadir 500 l de Tampón de Desinhibición a la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 2. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 3. 2º Lavado. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido 4. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar todo el etanol residual. 5. Eliminar el tubo de recolección y insertar la DNA Spin columna en un microtubo de 1.5 ml. Añadir l Tampón de Elución DNA (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la DNA Spin columna. Incubar durante 1 minuto. 6. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. El microtubo contiene ahora el ADN genómico Protocol for Total RNA isolation from bacteria 1. Pellet bacteria by centrifugation at x g (aprox rpm) for 1 minute. 2. Decant supernatant, and carefully remove any remaining media by aspiration. Resuspend the bacteria in 100 l of appropriate lysozyme-containing TE by vortexing. Incubate at room temperature for 10 minutes 3. Add 200 l of Lysis Buffer. Lyse cells by vortexing for 15 seconds 4. Add 50 l of ethanol % to lysate. Mix by vortexing for 10 seconds. Ensure that the entire pellet is completely 13/19 dissolved before proceeding to the next step. 5. Assemble a DNA Spin column with one 6. Apply the clarified lysate with ethanol onto the columns. Centrifuge for 1 minute. 7. Retains the flowthrough, which contains the total RNA. Use the flowthrough for RNA purification. Transfer the flowthrough to a new RNase-free microcentrifuge tube (not provided).

14 8. Place the DNA Spin column in a new collection tube and store at room temperature (15-25ºC) or a 4ºC for later DNA purification. 9. Add 450 l of % Ethanol to the flowthrough. Mix by vortexing for 10 seconds. After addition of ethanol a stringy precipitate may become visible, be sure to load all of the precipitate on the RNA Spin column. 10. Assemble a RNA Spin column with one 11. Apply half of the flowthrough with ethanol onto the columns and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with the collection tube. 12. Repeat step 12 to complete the capture of the total RNA. 13. Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Ensure the entire wash buffer has passed through into the collection tube by inspecting the column. If the entire wash volume has not passed, spin for an additional minute. 14. Discard the flowthrough and reassemble the spin column with its collection tube Protocol for Genomic DNA isolation from bacteria Add 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute 15. Wash column a third time by adding another 400 l of Wash Buffer RNA to the column and centrifuge for 1 minute. Discard the flowthrough and centrifuge for 2 minutes to eliminate the residual ethanol. En sure that the column is dry and discard the collection tube with the flowthrough. 16. Place the column into a fresh 1.5 ml microfuge tube (not provided in the kit) 17. Add 50 l -100 of Elution Buffer RNA to the column. 18. Centrifuge for 2 minutes at 200xg (aprox rpm), followed by 1 minute at xg (aprox rpm). Note the volume eluted from the column. If the entire 50 l has not been eluted, spin the column at xg (aprox rpm) for 1 additional minute. 19. The purified microrna sample may be stored at -20ºC for a few days. It is recommended that samples be placed at - 70ºC for long term storage. 1. Add 500 l of Desinhibition Buffer to the DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 2. Add 500 l of Wash Buffer DNA in to reservoir of DNA Spin column. Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 3. 2º Wash. Add 500 l of Wash Buffer DNA into reservoir of DNA Spin column Centrifuge for 1 minute. Remove the liquid. 4. Centrifuge at maximum speed for 120 seconds to remove the residual ethanol. 5. Remove the collection tube and insert the DNA Spin Column in a 1.5 ml microtube. Add 100l of elution buffer (preheated at 70ºC) into reservoir of DNA Spin column. Incubate 1 minute. 6. Centrifuge at maximum speed for 60 seconds. The microtube contains now the genomic DNA Protocolo de extracción de ADN/ARN a partir de levaduras Protocol of DNA/RNA isolation from yeast Nota: Se recomienda no utilizar más de 10 7 células de levadura o 1ml de cultivo. Preparar una cantidad apropiada de Tampón de Resuspensión que contenga liticasa : 50mM tris, ph 7.5, 10 mm EDTA, 1M Sorbitol, 0.10 % - mercaptoetanol y 1 unidad / l de liticasa. Esta solución debería prepararse con reactivos estériles y libres de RNAsas y mantenida en hielo hasta ser utilizada Protocolo de extracción de ARN total a partir de levaduras Note: It is recommended that no more than 10 7 yeast cells or 1 ml of culture be used for this procedure. Prepare the appropriate amount of lyticase resuspension buffer: 50mM Tris, ph 7.5, 10 mm EDTA, 1M Sorbital, 0.10 % -mercaptoethanol and 1 unit / l of lyticase. This solution should be prepared with sterile, Rnase free reagents, and kept on ice until needed. 1. Obtener el pellet de las levaduras por centrifugación a xg (aprox rpm) durante 1 minuto. 2. Eliminar el sobrenadante y resuspender por vortex el pellet en 100 l del Tampón de Resuspensión con la cantidad apropiada de liticasa. Incubar a 37ºC durante 10 minutos. 3. Añadir 300 l de Tampón de Lisis RNA al pellet. Lisar las células por vortex durante 15 segundos. Asegurarse que todo 14/19

15 el pellet está disuelto antes de proceder con el siguiente paso. 4. Pasar el lisado a un microtubo. IMPORTANTE: Anotar la cantidad de lisado. 5. Añadir 15 l de etanol 100 % por cada 100 l de lisado). Mezcla por vortex 10 segundos. 6. Ensamblar una DNA Spin columna con 7. Añadir el lisado + etanol a la columna. Centrifugar durante 1 minuto. 8. Retener el líquido que ha pasado a través de la columna y que se encuentra en el tubo de recogida y que contiene el ARN total. Pasar el líquido retenido a un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit). 9. Ensamblar la DNA Spin columna con un tubo de recogida y conservar a temperatura ambiente (15-25ºC) o a 4ºC para purificación del ADN más tarde. 10. Añadir 450 l de Etanol % al líquido retenido que contiene el ARN total. Mezcla por vortex 10 segundos. Después de la adición del etanol se podrá apreciar un precipitado, asegurarse de que todo el precipitado se añade a la RNA Spin columna. 11. Ensamblar una RNA Spin columna con 12. Aplicar la mitad del liquido + etanol en la RNA Spin columna y centrifugar durante 1 minuto. Descartar el líquido y reensamblar la columna con su tubo de recogida. 13. Repetir el punto 12 hasta completar la captura de todo el ARN total. 14. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la columna y centrifugar durante 1 minuto. Asegurarse que todo el tampón de lavado ha pasado a través de la columna, sino fuera así centrifugar otro minuto adicional. 15. Eliminar el líquido y ensamblar la columna con el tubo de recogida. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la 16. Realizar un tercer lavado. Añadir 400 l de Tampón de Lavado RNA a la Eliminar el líquido del tubo de recogida y centrifugar durante 2 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de recogida. 17. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total. 18. Añadir l de Tampón de Elución RNA a la columna. 19. Centrifugar durante 2 minutos a 200xg (aprox rpm), seguido de 1 minuto a xg (aprox rpm). Ver la cantidad de eluido de la columna, sino se han eluido los 50 l centrifugar por 1 minuto adicional a x g (aprox rpm). 20. El ARN purificado puede ser conservado a -20ºC durante algunos días. Se recomienda que las muestras se conserven a -70ºC para almacenamientos largos Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de levaduras 1. Añadir 500 l de Tampón de Desinhibición a la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 2. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido. 3. 2º Lavado. Añadir 500 l de Tampón de Lavado DNA en el reservorio de la DNA Spin columna. Centrifugar durante 1 minuto. Eliminar el líquido 4. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar todo el etanol residual. 5. Eliminar el tubo de recolección y insertar la DNA Spin columna en un microtubo de 1.5 ml. Añadir l Tampón de Elución DNA (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la DNA Spin columna. Incubar durante 1 minuto. 6. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. El microtubo contiene ahora el ADN genómico. 15/19