RECK control interno de calidad del ARN extraído

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1 ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRESENTACIÓN DEL PRODUCTO pág. 1 CARACTERÍSTICAS DEL PRODUCTO pág. 2 OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS pág. 2 MATERIAL PROVISTO EN EL PRODUCTO pág. 3 MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL PRODUCTO pág. 3 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES pág. 3 PROCEDIMIENTO pág. 5 PROBLEMAS Y SOLUCIONES pág. 9 SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS pág. 10 USO PREVISTO El producto se utiliza en el control de idoneidad del ARN extraído de muestras biológicas en las pruebas de transcripción inversa y amplificación. Además el producto permite facilitar los procedimientos analíticos en las pruebas de transcripción inversa y amplificación. La identificación de las muestras no idóneas en las pruebas de amplificación para la búsqueda de un ADNc blanco en el producto de la reacción de transcripción inversa obtenido del ARN extraído de muestras biológicas puede ser utilizada para la comprobación de las muestras verdaderas negativas. PRESENTACIÓN DEL PRODUCTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Oficinas: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sitio WEB: C El producto provee el control positivo de extracción de ARN CPE-RNA y la mezcla de control, dosificados en probetas y listos para su uso. El procedimiento prevé el uso del control positivo de extracción de ARN en fase de extracción y de la mezcla de control en la fase de amplificación. En la primera fase el CPE-RNA, una solución estable de ARN genómico del fago MS2, se agrega después de la muestra al sistema de extracción, de manera de proveer el control interno. El CPE-RNA está extraído y retrotranscrito junto con el ARN de la muestra. En la segunda fase el, utilizado como diluyente de la enzima Taq ADN polimerasa, se agrega a la reacción de amplificación para el parámetro en análisis. El provee los oligonucleótidos primers para la coamplificación de la región genómica que codifica para la proteína de ensamblaje del ADNc de fago MS2. La presencia del producto específico de la reacción de amplificación del CPE-RNA indica la ejecución correcta de la extracción, transcripción inversa y amplificación. Además, el permite verificar visualmente el agregado de la enzima diluida en la mezcla de amplificación gracias a su coloración, y cargar el producto de la reacción de amplificación directamente en el gel de agar gracias a sus características de densidad y coloración. CARACTERÍSTICAS DEL PRODUCTO El puede ser utilizado tanto con los sistemas que prevén la ejecución de una sola reacción de amplificación (single round) como con sistemas que prevén la ejecución de dos reacciones de amplificación sucesivas (nested). El puede ser utilizado en reacciones de amplificación cuyo producto específico sea una molécula de ADN de dimensión inferior a 500 bp. El puede ser utilizado en reacciones de amplificación cuya temperatura de hibridación de los oligonucleótidos primers (annealing) esté comprendida entre los 50C y los 60C. El está calibrado para no modificar la sensibilidad de la reacción de amplificación. Cuando se lo utiliza con los productos de la serie OligoMIX, la sensibilidad de la reacción de amplificación permanece aproximadamente en 10 moléculas de ADNc blanco en los 10 µl de producto de la reacción de transcripción inversa agregados a la probeta «monotest». El producto permite efectuar el control de idoneidad de 50 extracciones y de 100 extracciones de amplificación totales (100 single round o 50 nested), controles positivos y negativos incluidos. OTROS PRODUCTOS REQUERIDOS Los reactivos para la extracción del ARN de las muestras a analizar, para la transcripción inversa del ARN, para la amplificación, el control positivo de amplificación y la detección del ADN amplificado, no están incluidos en este producto. Para realizar estas fases analíticas se aconseja la utilización de los siguientes productos accesorios producidos por ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAgen» (código EXTG01), kit de extracción de los ácidos nucleicos de muestras no celulares; el kit permite efectuar 50 extracciones; «EXTRAzol» (código EXTR01), kit de extracción del ARN de muestras celulares y no celulares; el kit permite efectuar 50 extracciones; «RT - kit plus» (código BRK200), kit de transcripción inversa del ARN con "random primer"; el kit permite efectuar 50 reacciones; «DNA polymerase 2U / µl» (código ER40, ER140), enzima ADN polimerasa termoestable para la amplificación des los ácidos nucleicos; el producto ER40 permite efectuar 25 reacciones, el producto ER140 permite efectuar 100 reacciones. serie «oligomix Alert kit», kit de amplificación del ADNc producido por la transcripción inversa del ARN extraído de muestras biológicas; serie «Positive», controles positivos de amplificación de ADN plasmídico; serie «ELECTROPHORESIS» (códigos EPH02 o EPH04), detección del ADN amplificado por electroforesis en gel de agar; el kit permite efectuar 64 extracciones. SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 1/10 SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 2/10

2 MATERIAL PROVISTO EN EL PRODUCTO Componente Descripción Cantidad Composición Etiquetado CPE-RNA control positivo de extracción de ARN 4 x 150 µl mezcla de control 4 x 200 µl ~3 fm ARN genómico MS2, BSA acetilada, Guanidina tiocianato, Sodio lauril sarcosinato, 100 mm 2-Mercaptoetanol, Citrato de Sodio, Ácido clorhídrico Poliacrilamida lineal 0,1 µm oligonucleótidos TRIS-HCl, sacarosa, Azul de Bromofenol, Xilencianol FF MATERIAL REQUERIDO NO PROVISTO EN EL PRODUCTO Xn - NOCIVO - Campana de flujo laminar. - Guantes descartables de látex o similares. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas y tips estériles con filtro para aerosol o de dispensación positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl). - Agua bidestilada estéril. - Termostato programable (thermal - cycler). ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Este producto es para uso exclusivo in vitro. Advertencias y precauciones generales Manipular y eliminar todas las muestras biológicas como si pudiesen transmitir agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con las muestras biológicas. No producir salpicaduras ni aerosol. El material que está en contacto con las muestras biológicas debe ser tratado con hipoclorito de sodio al 3% por al menos 30 minutos o bien tratado en autoclave a 121C dura nte una hora antes de ser eliminado. Manipular y eliminar todos los reactivos y todos los materiales usados para realizar la prueba como si fuesen agentes infecciosos. Evitar el contacto directo con los reactivos. No producir salpicaduras ni aerosol. Los residuos deben ser tratados y eliminados según normas de seguridad adecuadas. El material combustible monouso debe ser incinerado. Los residuos líquidos que contienen ácidos o bases deben ser neutralizados antes de la eliminación. Usar indumentaria de protección y guantes adecuados, protegerse los ojos o la cara. No pipetear con la boca ninguna solución. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el área de trabajo. Lavarse bien las manos después del manejo de muestras y reactivos. Eliminar los reactivos sobrantes y los residuos según las normas vigentes. Leer todas las instrucciones provistas en el kit antes de realizar la prueba. Respetar las instrucciones provistas en el producto durante la ejecución de la prueba. Respetar la fecha de caducidad del producto. Utilizar sólo los reactivos presentes en el producto y los aconsejados por el fabricante. No intercambiar reactivos que provengan de lotes diferentes. No utilizar reactivos que provengan de productos de otros fabricantes. - Advertencias y precauciones en los procedimientos de biología molecular Los procedimientos de biología molecular, como la extracción, la transcripción inversa, la amplificación y la detección de ácidos nucleicos, requieren personal instruido para evitar el riesgo de resultados incorrectos, en particular a causa de la degradación de los ácidos nucleicos de las muestras o de la contaminación de las mismas por parte de productos de amplificación. Es necesario disponer de áreas separadas para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación o para la amplificación / detección de los productos de amplificación. Nunca introducir un producto de amplificación en el área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Es necesario disponer de batas, guantes e instrumentos destinados para la extracción / preparación de las reacciones de amplificación y para la amplificación / detección de productos de amplificación. Nunca transferir batas, guantes e instrumentos del área de amplificación / detección de productos de amplificación al área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Las muestras deben ser destinadas exclusivamente a este tipo de análisis. Las muestras deben ser manipuladas bajo una campana de flujo laminar. Las probetas que contengan muestras diferentes nunca deben ser abiertas al mismo tiempo. Las pipetas utilizadas para manipular las muestras deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosol. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los reactivos deben ser manipulados bajo campana de flujo laminar. Los reactivos necesarios para la amplificación deben ser preparados de manera tal que sean utilizados en una sola sesión. Las pipetas utilizadas para manipular los reactivos deben ser destinadas sólo a este uso. Las pipetas deben ser del tipo de dispensación positiva o usar tips con filtro para aerosoles. Los tips utilizados deben ser estériles, sin la presencia de ADNasa y ARNasa, sin la presencia de ADN y ARN. Los productos de amplificación deben ser manipulados en modo de limitar al máximo su dispersión en el ambiente para evitar contaminaciones. Las pipetas utilizadas para manipular los productos de amplificación deben ser destinadas sólo a este uso. Advertencias y precauciones específicas para los componentes Para el reactivo CPE-RNA se deben tener en cuenta las siguientes frases de riesgo (R) y los siguientes consejos de prudencia (S): Xn - NOCIVO R 20/21/22/-32. Nocivo por inhalación y contacto con la piel y por ingestión. En contacto con la piel libera un gas altamente tóxico. S No comer ni beber durante su empleo. No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles. Usar guantes adecuados. No mezclar con ácidos. Para el reactivo se deben tener en cuenta las siguientes precauciones (S): S No respirar los gases/ humos/ vapores/ aerosoles. Evitar el contacto con los ojos. SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 3/10 SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 4/10

3 Programación del ciclo térmico PROCEDIMIENTO - controlar que los parámetros del ciclo térmico de la reacción de amplificación principal, prevean una temperatura de hibridación de los oligonucleótidos primers (annealing) comprendida entre los 50C y los 60C ; - programar en el thermal - cycler los parámetros del ciclo térmico de la reacción de amplificación principal. Nota: No se requiere ninguna modificación a los parámetros del ciclo térmico de la reacción de amplificacióne. s El material a utilizar con este producto debe estar constituido por el producto de la reacción de transcripción inversa (ADNc) obtenido del ARN extraído de muestras biológicas. El sistema de transcripción inversa del ARN debe utilizar los "random primer" para producir la reacción de polimerización. Cuando se utilizan muestras biológicas celulares, por ejemplo sangre entera, se aconseja verificar la cantidad de ARN total extraído que se agrega a la reacción de transcripción inversa, para evitar la aparición de productos inespecíficos y posibles fenómenos de inhibición en la siguiente reacción de amplificación. La concentración final máxima del ARN total en la reacción de transcripción inversa debería ser aproximadamente 40 ng / µl. Por ejemplo, la cantidad máxima de ARN total a agregar en la reacción de transcripción inversa con un volumen final de 25 µl es de aproximadamente 1 µg. El sistema de extracción del ARN de la muestra de partida debe proveer ARN adecuado al uso en reacciones de trascripción inversa y amplificación. Se aconseja preparar diferentes alícuotas de las muestras para conservarlas congeladas y no someterlas a repetidos ciclos de congelación / descongelación. es de extracción, transcripción inversa y amplificación Es absolutamente necesario confirmar cada una de las sesiones de extracción y amplificación preparando un control negativo y un control positivo. Para el control negativo utilizar agua bidestilada estéril (no provista en el producto) a extraer en lugar de la muestra biológica sin agregar el CPE-RNA. El extracto será luego utilizado en la reacción de transcripción inversa y en la reacción de amplificación. Para el control positivo utilizar agua bidestilada estéril (no provista en el producto) a extraer en lugar de la muestra biológica y agregar el CPE-RNA. El extracto será luego utilizado en la reacción de transcripción inversa y en la reacción de amplificación. Preparación de la extracción - descongelar una probeta de CPE-RNA, mezclar por inversión, centrifugar durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerla en hielo. Nota: El CPE-RNA debe ser utilizado en la primera fase del procedimiento de extracción. Después de agregar la muestra a la solución lisante, incorporar 10 µl de CPE-RNA a cada probeta de extracción y mezclar por inversión. Nota: No se requiere ninguna otra modificación al protocolo de extracción. Preparación de la transcripción inversa El sistema de transcripción inversa debe utilizar oligonucleótidos de secuencia casual "random primer" para producir la reacción de polimerización del ADNc. Nota: No se requiere ninguna modificación al protocolo de retrotranscripción. Preparación de la amplificación - descongelar una probeta de, mezclar por inversión, centrifugar durante 5 segundos para obtener en el fondo el contenido y mantenerla en hielo; - diluir la enzima ADN polimerasa termoestable (no provista en el producto) con el en una concentración final. Preparar un volumen de enzima diluida suficiente para todas las reacciones previstas (controles incluidos) más una, para contar con un margen de seguridad. La enzima diluida no puede conservarse. Nota: El volumen de agregado a la reacción de amplificación con la enzima diluida debe ser un décimo del volumen final de la reacción de amplificación. Agregar a cada una de las probetas de amplificación 5 µl de ADN polimerasa termoestable diluida en el (si el volumen final de reacción es de 50 µl). Nota: El agregado de la enzima diluida en la mezcla de amplificación puede ser verificado visualmente gracias a la coloración azul del. Nota: No se requiere ninguna modificación al protocolo de amplificación. Nota: Cuando el se utiliza con sistemas que prevén la ejecución de dos reacciones de amplificación sucesivas (nested), debe ser utilizado para diluir la enzima ADN polimerasa termoestable tanto en la preparación de la primera amplificación como en la preparación de la segunda amplificación. Preparación de la detección electroforética en gel de agar El producto específico de la reacción de amplificación puede ser detectado e identificado mediante separación electroforética en las condiciones descritas a continuación: - utilizando un gel de agar al 2% con bromuro de etidio 1 µg / ml en tampón TBE 1x (89 mm TRIS, 89 mm ácido bórico, 2 mm EDTA disódico); - utilizando un gel de agar al 4% con bromuro de etidio 1 µg / ml en tampón TAE 1x (40 mm TRIS, 20 mm ácido acético, 1 mm EDTA disódico), como en los productos de la serie «ELECTROPHORESIS». Nota: El suprime la necesidad de preparar el producto de la reacción de amplificación agregando un tampón de carga gracias a su densidad y coloración. Extraer 15 µl de producto de la reacción de amplificación y transferirlos directamente a un pocillo del gel de agar. El producto específico de la amplificación del CPE-RNA tiene dimensiones de aproximadamente 610 bp. Nota: La corrida electroforética debe ser realizada para disolver el producto específico de la reacción de amplificación del parámetro en análisis partiendo del producto específico del CPE-RNA. Nota: No se requiere ninguna otra modificación al protocolo de detección. Nota: El producto de la reacción de amplificación tiene la capacidad de contaminar las pruebas siguientes. Aislar el producto residual de la reacción de amplificación y los desechos producidos en la fase de detección. SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 5/10 SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 6/10

4 A título de ejemplo, se presenta a continuación un esquema que representa el resultado de la separación electroforética de una sesión de extracción, trascripción inversa y amplificación en la que fueron analizadas cuatro muestras. La reacción de amplificación para el parámetro en análisis presenta un producto específico de 235 bp. Pocillos Pesos positivo Moleculares parámetro en análisis positivo negativo general positiva negativa idónea positiva* no idónea Interpretación de los resultados Antes de convalidar definitivamente un resultado ADNc del parámetro en análisis AUSENTE para una muestra, se debe analizar el resultado obtenido con el para esta muestra. Los resultados de las reacciones referidas a las muestras que se analizan se utilizan para evaluar la presencia del ADNc del CPE-RNA, como se describe en la tabla siguiente: Resultado de la prueba ADNc del CPE-RNA Idoneidad de la muestra Producto específico AUSENTE negativo AUSENTE no idónea* 1380 bp Producto específico PRESENTE positivo PRESENTE idónea, verdadera negativa 517 bp 459 bp 610 bp 610 bp 610 bp 387 bp 247 bp 75 bp 65 bp 46 bp 235 bp 235 bp 235 bp * Las muestras positivas para el parámetro en análisis, si bien son idóneas, pueden no presentar el producto de la reacción de amplificación del CPE-RNA. De hecho, la reacción de amplificación del CPE-RNA con el puede ser desplazada por la reacción de amplificación del parámetro en análisis. Es absolutamente necesario convalidar la especificidad del producto de la reacción de amplificación de una muestra comparando su migración en gel con la migración de un marker de peso molecular y con la migración del producto de la reacción de amplificación del control positivo. La eventual presencia de productos inespecíficos de la reacción de amplificación no tiene significado alguno con respecto a la búsqueda del ADNc del CPE-RNA en la muestra. Si el producto específico de amplificación está ausente en la reacción de una muestra en análisis, se han verificado problemas en la fase de amplificación (amplificación no eficiente o nula) o en la fase de transcripción inversa (transcripción inversa no eficiente o nula) o en la fase de extracción (ausencia de ARN o presencia de inhibidores) que pueden causar resultados falsos negativos. La muestra es NO IDÓNEA pero el análisis debe repetirse a partir de la extracción de una nueva muestra. *Nota: Cuando en la reacción de amplificación está presente el producto específico para el parámetro en análisis, el producto específico del CPE-RNA puede estar ausente. De hecho, la reacción de amplificación del CPE-RNA con el, al ser calibrada para no interferir, puede ser desplazada por la reacción de amplificación para el parámetro en análisis. En este caso, la muestra de todas maneras es idónea y el resultado positivo del análisis es válido. Convalidación general de la sesión de amplificación Los resultados de las reacciones de control negativo y de control positivo son utilizados para convalidar la sesión extracción, transcripción inversa y amplificación como se describe en las tablas siguientes: Amplificación del control negativo Producto específico AUSENTE Amplificación del control positivo Producto específico PRESENTE Extracción, transcripción inversa y amplificación correcta Extracción, transcripción inversa y amplificación correcta Si el producto específico de amplificación está presente en la reacción de control negativo, se han verificado problemas de contaminación en la fase de extracción, trascripción inversa o amplificación que pueden causar resultados falsos positivos, la prueba debe repetirse a partir de la fase de extracción. Si el producto específico de amplificación está ausente en la reacción de control positivo, se han verificado problemas en la fase de extracción (ausencia de ARN o presencia de inhibidores), en la fase de transcripción inversa (transcripción inversa no eficiente o ausente) o en la fase de amplificación (amplificación no eficiente o ausente) que pueden causar resultados falsos negativos, la prueba debe ser repetida a partir de la fase de extracción. SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 7/10 SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 8/10

5 PROBLEMAS Y SOLUCIONES SIGNIFICADO DE LOS SÍMBOLOS Producto específico de amplificación presente en la reacción de control negativo Causas posibles Error durante la dispensación del CPE-RNA. Error durante la dispensación del ARN extraído. Error durante la dispensación del ADNc. Error durante la dispensación del producto de primera amplificación. Contaminación de los reactivos preparados para la sesión. Contaminación del agua estéril o del para la dilución de las enzimas. Contaminación de los stock de enzimas. Contaminación del área de extracción / preparación de las reacciones de amplificación. Soluciones Realizar atentamente la reconstitución, la dilución y la dispensación de los reactivos, cambiar siempre de tip. Utilizar una nueva alícuota de agua estéril o del. Utilizar nuevas alícuotas de enzimas. Limpiar superficies y instrumentos con detergentes acuosos, lavar batas, sustituir probetas y tips en uso. Número de catálogo. Límites de temperatura. Código de lote. Utilizar antes del último día del mes. Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme a los requisitos de la Directiva Europea 98\79\CE correspondiente a los dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Contenido suficiente para "N" test. Producto específico de amplificación ausente en la reacción de Positive Causas posibles Soluciones Atención, consultar las instrucciones de uso. Error durante la dispensación del CPE-RNA. Error durante la dispensación del ARN extraído. Error durante la dispensación del ADNc. Dispensar con atención el CPE-RNA. Dispensar con atención el ARN. Dispensar con atención el ADNc. Fabricante. Error durante la dispensación del producto de primera amplificación. Error durante la dispensación del productode la reacción de amplificación en el gel. Error durante la extracción del ARN. Extraer y distribuir prestando atención el producto de la primera amplificación en la segunda amplificación. Prestando atención al cargar el producto de la reacción de amplificación en el gel. Seguir con atención las instrucciones referidas a la extracción del ARN. Sistema de trascripción inversa no apta. Utilizar un sistema con random primer. Enzimas demasiado diluidas o error durante la dispensación de las enzimas. Volver a controlar los cálculos de dilución, seguir atentamente la dispensación de las enzimas y mezclar de manera adecuada. Degradación del control positivo. Error de programación de los ciclos térmicos. Utilizar una nueva alícuota de CPE-RNA. ar los ciclos térmicos programados en el thermal - cycler. Temperatura de annealing superior a 60C. SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 9/10 SCH m_es 28/05/13 Revisión 02 Pág. 10/10