Identificación de marcadores moleculares asociados con la resistencia a la pudrición de cogollo en palma de aceite FTG-58/99

Transcripción

1 Reuniones Técnicas de Fontagro Bogotá, julio de 2006 Identificación de marcadores moleculares asociados con la resistencia a la pudrición de cogollo en palma de aceite FTG-58/99 Pedro León Gómez Cuervo, Ph.D. Pedro J. Rocha S., Ph.D.

2 Fecha de aprobación: junio de 1999 Fecha de inicio: 1 julio de 2002 Fecha de terminación: 30 junio 2004 Prórroga 1 hasta el 30 de diciembre de 2004 Prórroga 2 hasta el 5 de junio de 2005 Coordinador General: Pedro L. Gómez C. Ejecutor responsable: Pedro J. Rocha S. Ejecutores asociados: CIAT (Colombia), Embrapa (Brasil), ASD y Coopeagropal (Costa Rica), INIAP y Palmeras del Ecuador (Ecuador)

3 Pudrición de Cogollo (PC) Sana PC Avanzado

4 PC: Generalidades Clorosis y necrosis en las flechas. Agente causal: Thielaviopsis paradoxa (Nieto, 1996). Factores abióticos predisponentes Climáticos (Acosta et al., 1996). Edáficos. Físicos (Burgos y Perdomo, 1997). Nutrición (Munévar y Acosta, 2002). Estrategias de control fallidas Uso de fungicidas, cirugías, organismos antagónicos, etc.

5 Complejo de pudrición del cogollo Distribución geográfica (según Fanqueville, 2001)

6 Objetivo Lograr que el proceso de mejoramiento genético de la palma de aceite por resistencia a la PC sea más rápido y efectivo.

7 Objetivos específicos Implementar y desarrollar el laboratorio de marcadores moleculares. Desarrollar experimentos de caracterización molecular de materiales con tolerancia o resistencia a la PC. Establecer alianzas con instituciones nacionales e internacionales.

8 Actividades Desarrollo de un taller con expertos en el tema Instituciones participantes: CIAT, Iniap, Embrapa, Cirad, Nifor, U. Cambridge No participaron: Costa Rica, plantación de Ecuador Generación de recomendaciones para el desarrollo del proyecto Reorientación de objetivos y actividades. Sugerencias y hechos: No se encontrará un marcador molecular asociado a la resistencia (al menos en los siguientes 10 años). Continuar con el proyecto y explorar nuevas posibilidades de investigación.

9 Actividades Fortalecer la logística del Laboratorio Compra de equipos Solicitud de acceso a materiales biológicos Gestión de convenios Desarrollar e implementar metodologías de marcadores moleculares Estandarizar metodología de extracción de ADN Estandarizar metodologías RAPD, AFLP y SSR.

10 Actividades Generación de nuevas estrategias experimentales Anáslisis de diversidad de materiales susceptibles y tolerantes a PC mediante herramientas moleculares E. guineensis de origen Africano (Angola) E. oleifera de Amazonía Colombiana y Magdalena Medio Híbridos interespecíficos OxG Evaluación de poliaminas como estrategia de control de la PC Participación en la discusión sobre la marchitez letal y su relación con la PC

11 Resultados Metodologías de marcadores moleculares implementadas y utilizadas de manera rutinaria. Análisis de diversidad. Materiales comerciales E. guineensis proveniente de Angola E. oleifera proveniente del Amazonas y del Magdalena Medio Generación de una práctica de manejo de la enfermedad con poliaminas Generación de convenios (Ecuador, Malasia).

12 Resultados Metodologías de marcadores moleculares implementadas y utilizadas de manera rutinaria. Análisis de diversidad. Materiales comerciales E. guineensis proveniente de Angola E. oleifera proveniente del Amazonas y del Magdalena Medio Generación de una práctica de manejo de la enfermedad con poliaminas Generación de convenios (Ecuador, Malasia).

13 Metodologías Implementadas Folíolos de hojas jóvenes E. guineensis provenientes de los cruces (Palmar del Oriente): Ekona/ Deli x Ekona (20 muestras) Ekona/ Deli x La Mé (20 muestras) Tanzania x Avros (13 muestras) Deli x Avros (14 muestras) E. guineensis IRHO (29 muestras), La Cabaña E. oleifera (41 muestras) del banco de germoplasma Total 137 muestras.

14 Metodologías Implementadas Método de extracción de ADN empleando fenol Emplea 3 g de tejido foliar Se obtienen 3µg de ADN / g de tejido Utiliza fenol, cloroformo Estable durante ocho días Rocha (2001)

15 Metodologías Implementadas RAPD 137 muestras 7 cebadores 26 bandas por muestra > 3500 bandas Ausencia total de polimorfismo No se comprobaron resultados de Ochoa (2000) 1,650 1, MP DA1 DA2 DA3 DA4 DA5 DA6 DA7 DA8 DA9 DA10 DA11 DA12 DA13 DA14 DA15 DA16 DA17 DA18 DA19

16 Metodologías Implementadas Microsatélites 137 muestras Veinte combinaciones de cebadores (Billotte et al., 2001) 7124 bandas Siete cebadores polimórficos

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18 Metodologías Implementadas AFLP 12 materiales Siete combinaciones de cebadores 5748 bandas 258 bandas polimórficos EACT-MCAA

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20 Conclusiones Dentro de E. oleifera se encuentra alta variabilidad genética y es mayor que la que presenta E. guineensis. Los materiales de Angola poseen mayor variabilidad que la reportada para otros materiales E. guineensis No existe un marcador molecular de amplio espectro que agrupe a los individuos tolerantes a la PC. Las técnicas de AFLP y SSR son reproducibles y generan resultados complementarios. En ningún momento se presentan discrepancias. La relación beneficio costo define a la técnica de SSR como la más adecuada para el LCM.

21 Resultados Metodologías de marcadores moleculares implementadas y utilizadas de manera rutinaria. Análisis de diversidad. Materiales comerciales E. guinenesis proveniente de Angola E. oleifera proveniente del Amazonas y del Magdalena Medio Generación de una práctica de manejo de la enfermedad con poliaminas Generación de convenios (Ecuador, Malasia).

22 Poliaminas en PC 1. Estudiar la relación entre el contenido de poliaminas y la pudrición de cogollo en palma de aceite. 2. Evaluar el efecto de la aplicación exógena de poliaminas en palmas afectadas por pudrición de cogollo.

23 Contenido endógeno de PA cogollo meristemo Muestreo destructivo en palmas adultas Detalle de los tejidos analizados

24 Resultados: Análisis Cualitativo Parámetro TR (min) K Asym α N R B u t A 9,1 ± 0,98 10,12 1, P u t 9,7 ± 1,4 11,15 1,20 1, ,80 S p d 12,8 ± 2,7 15,08 1,16 1, ,21 S pm 20,3 ± 2,5 24,45 1,15 1, ,37

25 Resultados: Contenido endógeno de PA Perfil cromatográfico de las PA presentes en una palma adulta sana. Meristemo Perfil cromatográfico de las PA presentes en una palma adulta con PCA. Meristemo

26 Resultados: Contenido endógeno de PA en COGOLLO (nmol/gpf) Edad Vivero (10 meses) Adultas (15 años) Estado Sana PCI Sana PCI PCA REC Put 45,2 67,2 95,6 71,0 43,6 108,1 Spd 24,8 26,1 35,8 20,6 14,9 34,8 Spm 4 6,8 12,2 7,2 5,3 9,3 PA total 74,1 100,2 143,6 98,9 63,8 152,3 La PC altera el contenido total de PA en el cogollo y el meristemo

27 Contenido endógeno de PA Conclusiones - Se detectó la presencia de Put, Spd y Spm libres en palma de aceite. - Las concentraciones de PA varían según el tejido, la edad y el grado de desarrollo de la PC. - La PC en la palma de aceite altera el contenido endógeno de PA. - Aumenta en palmas de vivero - Disminuye en palmas adultas

28 Aplicación n exógena de PA Estrategia Determinar el efecto de la aplicación exógena de poliaminas sobre la prevención y/o recuperación de las palmas afectadas por la pudrición del cogollo.

29 Área total: 12 ha Escala: 1:125

30 Aplicaciones exógenas de PA Perforación de la base peciolar Detalle de la inyección de soluciones de PA

31 Resultados: Prevención de la PC % de palmas sin síntomas de PC TRAT Mes Put Put Put Spd Spd Spd Spm Spm Spm Testigo Aplicación de Put 1000 µm evitó la aparición de PC en palmas sanas

32 Resultados: Recuperación en PCA % de palmas con PCA recuperadas TRAT Mes Put Put Put Spd Spd Spd Spm Spm Spm Testigo Aplicación de Spd 50 µm y Spm 75 µm indujeron la recuperación total en las palmas con PCA

33 Aplicaciones de PA Conclusiones Las palmas respondieron a la aplicación de PA con el sistema de perforación de la base peciolar La aplicación exógena de PA en palmas sanas previno el desarrollo de PC Put 1000 µm previno la aparición de PC en palmas sanas La aplicación exógena de PA en palmas con PC favoreció recuperación Spd 100 µm indujo mayor recuperación en las palmas con PCI Spd 50 µm y Spm 75 µm indujeron la recuperación total en las palmas con PCA la Después de 24 meses de evaluación, las PA aplicadas no mostraron efectos sobre los componentes de productividad

34 Resultados Metodologías de marcadores moleculares implementadas y utilizadas de manera rutinaria. Análisis de diversidad. Materiales comerciales E. guinenesis proveniente de Angola E. oleifera proveniente del Amazonas y del Magdalena Medio Generación de una práctica de manejo de la enfermedad con poliaminas Generación de convenios (Ecuador, Malasia).

35 Visitas Técnicas A Ecuador Iniap, Ancupa, Palmar del Río, Palmeras del Ecuador A Malasia SDTC, MPOB, AAR, GH, UP, UKM, A Reino Unido University of Cambridge, University of Nottingham John Innes Centre, Sainsbury Laboratory

36 Fontagro: Indicadores de Ejecución Nombre del indicador Unidad Resultados esperados / obtenidos Extracciones de ADN Número - Aislamiento de ADN de mínimo 30 materiales susceptibles y ejecutadas 30 materiales resistentes a PC. Cada muestra con tres réplicas Prueba molecular tipo RAPD Prueba molecular tipo AFLP (microsatélites) Número Número - Se emplearon 137 materiales. - Validación de tres de los cebadores reportados como polimórficos para PC. - Prueba de 20 cebadores - Cebadores A8, B12 y G10 fueron probados pero no fueron reproducibles. - Mínimo cinco combinaciones de cebadores evaluadas en los 40 individuos contrastantes. - Introducción de SSR al laboratorio (20 micros). Taller de trabajo Número - Definición de estrategias de trabajo con base en un taller internacional con expertos en el área de marcadores moleculares - Taller de MM y Visita Dra Airede llevados a cabo en Diciembre Proyectos nuevos Número - Presentación de al menos un proyecto para financiación externa - Proyecto presentado a Colciencias (aprobado Cód ). - Proyecto Bioinformática presentado a Colciencias. Tesis de Pregrado Número - Una tesis de pregrado aprobada. - Tesis meritoria para Diana Arias (UPTC, Febrero 2003). - Tesis MSc. Cristina Mendoza (Unal, 2003). Continuación...

37 Fontagro: Indicadores de Ejecución Nombre del indicador Unidad Resultados esperados / obtenidos Seminario Número - Al menos un seminario en Universidad o Instituto acerca de la investigación de Cenipalma en el área molecular. - Seminario Universidad Nacional (2) - Seminario Universidad de Cundinamarca - Seminario Semilleros de Investigación - Seminarios Malasia, Ecuador - Participación RedBio 2004 (Rep. Dominicana) - Seminario Reunión Anual Cenipalma (2) Convenios Número - Ser miembro de una sociedad científica colombiana especializada en el área de ingeniería genética y/o biología molecular. (Si no existe tal sociedadparticipar en su creación). - Ser miembro de la iniciativa CENIS liderada por CIAT. - Creación de la Red Nacional de Ingeniería Genética. - Mayor participación en la Red Cenis (Página Web, propuestas de trabajo). - Creación de un consorcio de bioinformática (Cenis, CIAT, IBUN, Von Humboldt, Sinchi). Reportes Número y fecha Informes técnicos 2 Informes financieros 5

38 Fontagro: Indicadores de Resultados Nombre del indicador Unidad Resultados esperados / obtenidos Metodología para aislamiento de ADN Marcadores RAPD & AFLP y microsatélites Número Número - Mínimo una metodología optimizada y reproducible. - Dos métodos para extracción con diferentes cantidades de tejido. - Mínimo dos marcadores moleculares ligados a la resistencia a PC. - Se optimizaron metodologías pero no se encontró marcador alguno Base de datos Número - Una base de datos relacional que integre información agronómica y de marcadores moleculares que sirva de apoyo a la selección de materiales. - Archivos creados - Dendrogramas

39 Fontagro: Indicadores de Impacto Nombre del indicador Unidad Resultados esperados / obtenidos Práctica de selección exitosa Número - Aplicar la información obtenida con los MM para seleccionar poblaciones de material susceptible y resistente a PC en etapas de previvero. - No se desarrolló ninguna práctica para selección de material resistente a PC. - Se desarrolló metodología para incorporación de datos moleculares en el proceso de selección del programa de mejoramiento de Cenipalma. Convenios Número - Convenio con INIAP y ANCUPA (?) - Convenio con NIFOR Publicaciones Número - Journal of Oil Palm Research 17: (2005) Poliaminas. - Fitotecnia Colombiana 5(2)1-10 (2005) - Angola - Palmas 25(3): (2004) Resultados RAPD, AFLP y SSR. - Palmas 25 (especial): Palmas 25 (especial) Palmas 24(4): 9-20 (2003) - Fusarium - Palmas 24(3): (2003) Marcadores moleculares. - Palmas 23 (4): (2002) Revisión poliaminas. - Palmas 23(3):9-17 (2002) Extracción de ADN. - Ceniavances 121:1-4 (2005) Evaluación Angola. - Ceniavances 105:1-4 (2003) Poliaminas. - Ceniavances 101:1-4 (2003) Colecta Amazonas. - Ceniavances 100:1-3 (2002) Marchitez letal. - Protocolos del LCM. (ISO-Colciencias)

40 Ejecución Presupuestal CATEGORIA Presupuesto USD Total Gastos Cenipalma USD 0 Personal 0,1 Salarios Subtotal: Equipamento 1,1 Insumos ,2 Instrumentos y maquinaria ,3 Equipo de Computo 0 0 1,4 Contratos por "Obra especializada " 0 0 Subtotal: Consultores o especialistas 2,2 Honorarios ,3 Viáticos 0 2,4 Seguros 0 Subtotal: Viajes y viáticos (Personal Nacional) 3,1 Viáticos 0 3,2 Pasajes ,3 Arriendo de Vehículos Combustible Kilometraje Desplazamiento a Aeropuertos 0 Subtotal: Divulgación 4,1 Publicaciones ,2 Eventos 0 0 Subtotal: TOTAL GASTOS TOTAL INGRESOS DISPONIBLE

41 Agradecimientos Diana Arias Carmenza Montoya Cristina Mendoza Fanny Fuentes Jacqueline Sánchez Marcelo Torres Catherine Airede (Nifor) Norbert Billotte (Cirad) Edson Barcelós (Embrapa) M.C. Duque, M. Fregene, J. Tohmé (Ciat) Rommel Vargas (Ancupa) Digner Ortega (Iniap)

42 Agradecimientos Plantaciones La Cabaña, Palmar del Oriente Iniap, Ancupa, Ciat, Embrapa Cirad, Nifor, Sdtc, Mpob Colciencias Fondo de Fomento Palmero Fontagro