Instructivo Técnico para Detección de Anticuerpos frente a. Mycoplasma meleagridis Mediante Técnica de ELISA-I. Tabla de Contenidos

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1 Instructivo Técnico para Detección de Anticuerpos frente a Mycoplasma meleagridis Mediante Técnica de ELISA-I Tabla de Contenidos Contenido Página 1. Objetivos y Alcance 2 2. Referencias y Documentos Relacionados 2 3. Definiciones y Abreviaturas 2 4. Requisitos Requisitos infraestructura equipos materiales y reactivos Requisitos de personal Requisitos específicos Medios de verificación de Requisitos 5 5. Análisis/Ensayo Preparación de las muestras 5.2 Captación y envío de la muestra Recepción y manejo de la muestra Metodología Cálculo y expresión de los resultados Interpretación de resultados 8 6. Registro y envío de resultados 8 7. Supervisión a los Laboratorios Acreditados 9 Código IT-LAB-23-v01 Página 1 de 10

2 1. Objetivos y Alcance Este análisis es para ser aplicado a muestras de sueros de pollos y pavos provenientes de Planteles adscritos al Programa de Planteles de Aves de Corral bajo Certificación Oficial. (PABCO) y los planteles comerciales de aves que se incorporen al Programa de Control de Mycoplasma sp. en planteles comerciales de aves. El objetivo de este instructivo es dar a conocer los requisitos específicos para la acreditación de laboratorios por parte del SAG para ejecutar el análisis/ensayo mediante técnica de ELISA-I para la detección de anticuerpos frente a Mycoplasma meleagridis. Del mismo modo, en este documento se estipulan instrucciones técnicas que deben cumplir los laboratorios para que obtengan y mantengan tal acreditación. 2. Referencias y Documentos Relacionados. Manual de Estándares para pruebas Diagnósticas y Vacunas de la O.I.E., versión vigente. Programa de Control de Mycoplasma sp. en Planteles Comerciales de Aves, versión vigente. Reglamento especifico para la Acreditación de Laboratorios Análisis/Ensayo. versión vigente. Laboratory Biosafety Guidelines, Medical Research Council, Canada. Version vigente. 3. Definiciones y Abreviaturas ELISA I Indirect Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay MVL Médico Veterinario Laboratorio NBS 1 Laboratorio con Nivel Bioseguridad 1 (NBS 1) TL Protocolo Oficial SAG IHA Laboratorio Oficial OIE Técnico de Laboratorio Documento emitido por el Medico Veterinario Oficial del SAG o Médico Veterinario Acreditado: Protocolo de Toma de Muestras del Proyecto Nacional de Vigilancia Epidemiológica en Aves y Resultados Laboratorio. Servicio Agrícola y Ganadero Inhibición de la hemoaglutinación Laboratorio Perteneciente al SAG. Organización Mundial de Salud Animal Código IT-LAB-23-v01 Página 2 de 10

3 MVO MVA 4. Requisitos Médico Veterinario Oficial del SAG Medico Veterinario Acreditado 4.1 Requisitos infraestructura equipos materiales y reactivos El Laboratorio debe poseer infraestructura adecuada a un nivel Bioseguridad 1, de acuerdo a Laboratory Biosafety Guidelines, Medical Research Council, Canadá (Versión Vigente) Equipos, instrumentos y materiales Gradillas para tubos de 12x75 mm. Pipetas parciales de 1, 2 y 5 ml. Micropipeta monocanal ajustable µl. Micropipeta monocanal ajustable 1-10 µl. Micropipeta multicanal de 8 y 12 canales. (50 a 300 µl ) Las micropipetas deben tener su respectivo certificado de calibración, la que se hará una vez al año. Puntas amarillas desechables. Reloj Control. Refrigerador (4-8 C). Termómetro para refrigerador contrastado con termómetro patrón. Espectrofotómetro (650 nm.). Sistema de calefacción o enfriamiento para mantener temperatura ambiental entre C. Termómetro para medir temperatura ambiental contrastado con termómetro patrón Reactivos: Agua Destilada y o des-ionizada. Kit Elisa IDEXX o su equivalente técnicamente validado por OIE u organismo internacionalmente reconocido para detección de anticuerpos frente a Mycoplasma gallisepticum. Kit Elisa IDEXX o su equivalente técnicamente validado por OIE u organismo internacionalmente reconocido para detección de anticuerpos frente a Mycoplasma synoviae. Kit Elisa IDEXX o su equivalente técnicamente validado por OIE u organismo internacionalmente reconocido para detección de anticuerpos frente a Mycoplasma meleagridis. Código IT-LAB-23-v01 Página 3 de 10

4 Todos los reactivos y muestras deben ser mantenidos a temperatura ambiente (18-25 C), por 30 minutos antes de ser usados. 4.2 Requisitos de personal a) Responsable Técnico: Según lo dispuesto en el número 4.2 del Reglamento Específico para la Acreditación de Laboratorios Análisis/Ensayo, el Laboratorio debe contar con un responsable técnico, quien será la contraparte del SAG, en temas técnicos asociados a su actividad como laboratorio acreditado, el cual para los efectos de acreditación para el análisis Elisa-I para Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae y Mycoplasma meleagridis debe cumplir con los siguientes requerimientos: Título profesional calificado en el al área biológica, de una carrera de al menos ocho semestres académicos y capacitado en el uso de la técnica Elisa y en procedimientos, instructivos, manuales y otros documentos relacionados. Haber recibido capacitación en la técnica Elisa-I comprobada mediante certificado correspondiente. b) Analista: El laboratorio deberá contar con analistas en número adecuado de acuerdo a la cantidad de análisis a realizar, quienes deben cumplir el siguiente perfil: Contar con título profesional o técnico compatible con el desarrollo de las funciones asociadas al área de acreditación, obtenido a través de la aprobación de una carrera de al menos 4 semestres. Haber recibido capacitación en la técnica Elisa-I comprobada mediante certificado correspondiente. 4.3 Requisitos específicos El laboratorio debe contar con los siguientes documentos: Código IT-LAB-23-v01 Página 4 de 10

5 Procedimiento/Instructivo Manejo de Muestras involucrados en el alcance de la acreditación. Procedimiento /Instructivo Preparación y Esterilización de Material de Vidrio Procedimiento /Instructivo Eliminación y Descontaminación de Residuos y Materiales Procedimiento /Instructivo Aseo y Limpieza de Laboratorios Procedimiento /Instructivo Control Biológico de Esterilidad en Autoclaves. Procedimiento /Instructivo de Verificación de Equipos Procedimiento /Instructivo Control Material de Lavado Procedimiento /Instructivo Control de Calidad Interno Procedimiento /Instructivo Control de Ambiente Lista Maestra de Equipos e Instrumentos de Medición involucrados en el alcance de la acreditación. Instructivos de Uso de los equipos involucrados en el alcance de la acreditación. Programa de Mantención /Verificación / Calibración de los equipos involucrados en el alcance de la acreditación. 4.4 Medios de Verificación de Requisitos. El laboratorio postulante debe adjuntar a la solicitud de Acreditación, además de los antecedentes establecidos en el numeral 6.1 del Reglamento para la Acreditación de Laboratorios de Análisis /Ensayo SAG, los documentos que a continuación se detallan y que dan cuenta del cumplimiento de los requisitos establecidos por el SAG en este capítulo: Croquis del laboratorio, identificando uso de áreas y ubicación de equipos. Lista de Registros Técnicos relacionados con el alcance de acreditación. Lista de equipos críticos, indicando nombre, marca, modelo, fecha de puesta en servicio, capacidad cuando corresponda, y que incluya la mantención y calibración de estos. Lista de materiales, reactivos y Kits. Formulario de identificación del personal que se desempeña como analista. Certificado de título de los/las analistas identificados, en original o fotocopia legalizada. Código IT-LAB-23-v01 Página 5 de 10

6 Documentos que acrediten la capacitación tanto del/la responsable técnico como de los/las analistas en la técnica de ELISA correspondiente. Instructivos especificados señalados en el numeral 4.3 de este Instructivo. Sin perjuicio de lo anterior, el cumplimiento de los requisitos descritos tanto en el Reglamento Específico de Acreditación como en este Instructivo, serán confirmados por el Servicio en la visita de verificación por los medios que considere idóneos para tal efecto. Con este fin, el SAG podrá someter al Responsable Técnico y a uno o más analistas identificados por el postulante, a una evaluación teórica y/o práctica. 5. Análisis /Ensayo 5.1 Preparación de las muestras. Diluya las muestras 1/500 con el diluyente de muestras antes de realizar el análisis (es decir, diluya 1 µl de la muestra con 500 µl. de diluyente). Nota: NO DILUYA LOS CONTROLES. Asegúrese de cambiar las puntas de las pipetas cada vez que tome una muestra. Mezcle bien las muestras antes de agregarlas a la placa recubierta con antígeno Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae y Mycoplasma meleagridis. 5.2 Captación y Envío de la muestra Las muestras enviadas a un Laboratorio Acreditado para análisis de Mycoplasma meleagridis mediante Elisa-I, serán responsabilidad de un Médico Veterinario Acreditado o de un Médico Veterinario Oficial del SAG. En todos los casos, la muestra siempre debe ir acompañada del Protocolo Oficial de Toma de muestras del Proyecto Nacional de Vigilancia en Aves el cual debe ser completado con todos los datos que en dicho protocolo se solicitan. 5.3 Recepción y manejo de la muestra/contramuestra El Laboratorio debe anotar todas las muestras en un libro de Registro de muestras, destinado exclusivamente a las muestras de ELISA-I. En este caso no se utilizarán contramuestras. Las muestras de suero o sangre no pueden ser congeladas, deben ser mantenidas en refrigeración entre 4 y 8 C hasta su análisis. El analista determinará la aptitud de las muestras, las cuales no deben presentar contaminación ni hemólisis. En relación al envase, no debe haber tubos rotos y extravasación de sueros y deben estar adecuadamente identificadas. Código IT-LAB-23-v01 Página 6 de 10

7 5.4 Metodología Procedimiento de la Técnica Los reactivos deben estar a temperatura ambiente y luego agitarse con inversión y con un movimiento circular. 1. Tome la placa (o placas) recubierta (s) con antígeno correspondiente (Mg, Ms y Mm.) y anote la posición de las muestras en una hoja de trabajo. 2. Dispense 100 µl de control negativo NO DILUIDO en los pocillos A1 y A2. 3. Añada 100 µl de control positivo NO DILUIDO en los pocillos A3 y A4. 4. Añada 100 µl de muestra diluida en los pocillos correspondientes. 5. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, siempre que la temperatura esté dentro del rango de 18 a 25 C 6. Lave cada pocillo de tres a cinco veces con unos 350 µl de agua destilada o des-ionizada. 7. Añada 100 µl de conjugado (anti-pollo de Cabra, anti-pavo de Cabra y peroxidasa de rábano en cada pocillo.). 8. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, siempre que la temperatura esté dentro del rango señalado en paso 5. 9 Repita el paso Dispense 100 µl de la solución de substrato TMB en cada pocillo. 11. Incube durante 15 minutos a temperatura señalada en punto Añada 100 µl de la solución de frenado a cada pocillo para detener la reacción. 13. Calibre el lector en blanco con aire. 14. Mida y anote la densidad óptica a 650 nm. A (650). 5.5 Cálculo y Expresión de los resultados Para que el ensayo sea válido, la diferencia entre la absorbancia promedio del control positivo y del control negativo (CPx CNx) debe ser mayor que La absorbancia promedio del control negativo debe ser menor o igual que La presencia o ausencia de anticuerpos frente a Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae y Mycoplasma meleagridis, se determina por medio de una relación entre el valor de Absorbancia (650) de la muestra con el promedio del control positivo. El control está estandarizado y representa concentraciones significativas de anticuerpos anti- Mycoplasma meleagridis, en el suero de pollo y pavo. Código IT-LAB-23-v01 Página 7 de 10

8 La concentración relativa de anticuerpos en la muestra se determina a través del cálculo del cociente de la absorbancia de la muestra con respecto a la del control positivo = M/P. 1. (CNx) = Promedio para el control negativo. CNx = A (650) pocillo A1 + A (650) pocillo A (CPx) = Promedio para el control positivo. 3. Cociente M/P M= Muestra P= Positivo. CPx = A (650) pocillo A3 + A (650) pocillo A4 2 M/P= Promedio de la muestra - CNx CPx - CNx 4. Título: Relacione el cociente M/P en una dilución de 1:500 con un título final: Log10 del título: 1.09 (Log10 M/P) Interpretación de los resultados Las muestras de suero que tengan cocientes M/P inferiores o iguales a 0.5 deben considerarse negativas. Los cocientes M/P superiores a 0.5 (títulos superiores a 1076) deben considerarse positivas e indican que ha habido inmunización u otro tipo de exposición al antígeno. Cada laboratorio debe establecer su propio criterio de diagnóstico con respecto al título de anticuerpos de acuerdo con las instrucciones y uso de Software del fabricante. Todas las muestras de suero que resulten positivas deben ser enviadas al Laboratorio Oficial SAG Lo Aguirre para su confirmación mediante la técnica de IHA (Inhibición de la hemoaglutinación). Estas muestras deben ir adjuntas al Protocolo Oficial del SAG y deben enviarse con la respectiva cadena de frío y no más allá de tres días después de obtenido el resultado. 6 Registro y envío de Resultados Los resultados deben ser registrados en el Protocolo Oficial de Toma de Muestras del Proyecto Nacional de Vigilancia en Aves, el cual debe ser firmado por el responsable técnico del laboratorio. Los resultados serán comunicados al, al MVO del sector en el cual se tomaron las muestras, al Nivel Central SAG y al MVA de la empresa cuando Código IT-LAB-23-v01 Página 8 de 10

9 corresponda, mediante el envío de una copia del protocolo, un fax o un correo electrónico, adjuntando el resultado en el formato digital correspondiente al programa Adobe Acrobat Profesional o por cualquier otro medio que sea instruido por la División de Protección Pecuaria. El responsable técnico del laboratorio acreditado debe enviar los resultados en el Protocolo Oficial de Toma de Muestras del Proyecto Nacional de Vigilancia en Aves, al MVO y este último, una vez que verifique los datos remitidos en el protocolo, despachará cada una de las copias de acuerdo a lo señalado en el Programa de Control de Mycoplasma sp. en planteles comerciales de Aves. Cabe señalar que el laboratorio acreditado debe mantener una copia de los resultados para sus registros. El Laboratorio Acreditado enviará mensualmente, a la oficina sectorial del SAG, un resumen de los diagnósticos realizados durante el mes, con copia al Subdepartamento Laboratorios. Los resultados de los análisis de la prueba confirmatoria IHA realizada por el Laboratorio Oficial SAG serán enviados al nivel central, al MVO del sector SAG correspondiente al lugar de la obtención de la muestra y al Laboratorio acreditado que envió el suero positivo a ELISA- I. 7 Supervisión a los Laboratorios Acreditados Todo laboratorio acreditado será supervisado mediante visitas de auditorias de seguimiento al menos una vez al año. Sin embargo, deberá estar dispuesto a recibir auditorias adicionales a la de seguimiento, en cualquier momento. El Laboratorio Acreditado, deberá enviar cada 3 meses al Laboratorio Oficial, 20 muestras de suero que ya hayan sido procesadas, incluyendo positivos y negativos, para ser analizados oficialmente por el SAG. En el caso de no haber concordancia con los resultados, se programará una visita de supervisión para verificar la conducción del test ELISA -I. Si producto de las acciones de supervisión, el Departamento de Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias detecta faltas en el desempeño del Laboratorio Acreditado, que afecten negativamente el resultado del Programa Oficial asociado a su acreditación, el SAG, de conformidad con lo dispuesto en la cláusula sexta del correspondiente convenio de acreditación, podrá instruir al Laboratorio Acreditado mediante una carta suscrita por el/la jefa del Departamento Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias o un Jefe de oficina, el cese inmediato de prestaciones de servicios ejecutados en el alcance de su acreditación. Código IT-LAB-23-v01 Página 9 de 10