17-OH-Progesterone ELISA

Transcripción

1 Instrucciones de Uso 17-OH-Progesterone ELISA Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa de 17-OH-progesterona en plasma y suero humano. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) [email protected] D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa de 17-OH-progesterona en plasma y suero humano. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La hormona esteroide 17-OH-progesterona (17-OHP) se produce en la corteza adrenal y en las gónadas. Efectos gestagénicos del 17-OHP son pequeños. Pero esta hormona posee un significado clínico debido a que representa el precursor de 11 -desoxicortisol (compuestos, CpS). CpS se forma a través de la hidroxilación de carbono C21. La actividad enzimática de 21-hidroxilasa en la corteza adrenal puede ser entonces monitoreada mediante el análisis de los nivels de 17-OHP en sangre. Deficiencias en la 21-hidroxilasa, comunmente encontradas en hiperplasia adrenal congénita, conllevan a la secreción de 17-OHP y consecuentemente al incremento de sus niveles en sangre. Deficiencias en la 11-hidroxilasa, conllevan a incrementos moderados de los valores de 17-OHP. El análisis de este esteroide es importante para el diagnóstico diferencial de hiperplasia adrenal congénita. En mujeres adultas no embarazadas, los niveles de 17-OHP en sangre dependen de la fase del ciclo menstrual. Como la progesterona, 17-OHP es secretado por los folículos maduros y cuerpo luteo. Las concentraciones son generalmente más altas después de la ovulación. Adicionalmente, los valores de 17-OHP están influenciados por el ritmo diario, el cual se relaciona con la secreción adrenal de cortisol. Los valores máximos se encuentran en muestras recolectadas entre medianoche y 8 de la mañana. En hombres adultos, hay pocas indicaciones de fluctuaciones similares de 17-OHP. Durante el embarazo, grandes cantidades de 17-OHP son producidas por el bebe, la placenta y corteza adrenal. La hormona es secretada en la sangre fetal y maternal. Los valores de 17-OHP en sangre maternal decrecen considerablemente después de la semana 32da de embarazado, alcanzando valores hasta 4 veces mayores que aquellos correspondientes a la fase luteal del ciclo menstrual. 17-OHP puede encontrarse también en el corbón umbilical de los recién nacidos. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) está basado en el principio de la competencia. Una cantidad desconocida de antígeno presente en la muestra y una cantidad fija de antígeno marcado enzimáticamente compiten por los sitios de unión de los anticuerpos que recubren los pozos. Tras la reacción del sustrato los pozos se lavan para detener la reacción de competencia. Después de la reacción del sustrato la intensidad del color desarrollado es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de la muestra. Los resultados de las muestras se pueden determinar directamente usando la curva estándar. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. Version / 6

3 9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Suero, Plasma (EDTA) Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado. Almacenamiento: 2-8 C -20 C (Alícuotas) Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Estabilidad: 7 dias 3 meses Evite congelar y descongelar repetidamente. 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 20 ml ENZCONJ 1 x 2.0 ml 6 x 1.0 ml CAL A-G 2 x 1.0 ml CONTROL x 50 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Placa de Microtitulación Tiras separables. revestido con IgG anti-conejo (cabra, policlonal), 17-OH-Progesterona Antisuero. Conjugado Enzimático Coloreado en Amarillo. Listo para usar. Contenido: 17-OH-Progesterona, conjugado con HRP, Solución buffer fosfatada, estabilizadores. Estándar A-G 0; 0.15; 0.5; 1.5; 3.0; 7.5; 20 ng/ml 0.45; 1.5; 4.5; 9.1; 22.7; 60.6 nmol/l Listo para usar. Estándar A = Estándar cero (suero libre de esteroides). Contenido: 17-OH-Progesterona, Suero humano, estabilizadores. Control 1+2 Listo para usar. Por concentraciones / rangos de aceptancia vea las etiquetas. Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) Contenido: Solución buffer fosfatada, Tween, estabilizadores. Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB, Solución buffer, estabilizadores. Solución de Parada TMB Listo para usar. 1 M H2SO4. 3 x FOIL Folio Adhesivo 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 5; 25; 50; 100; 500 µl 2. Vortex 3. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 4. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 5. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 6. Agua bidestilada o desionizada 7. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro Version / 6

4 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Preparación de componentes liofilizados o concentrados Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad 15 ml WASHBUF CONC agregue 300 ml agua bidest. 1:20 Mezcle vigorosamente. 2-8 C 4 semanas Dilución de Muestras Las muestras que se sospeche que contienen concentraciones mayores que la del estándar más alto tienen que ser diluidas con Estándar A. Version / 6

5 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 25 µl de cada Estándar, Control y muestra en cada pocillo respectivo de la Placa de Microtitulación. 2. Pipetee 200 µl de Conjugado Enzimático en cada pocillo. 3. Cubra la placa con el folio adhesivo. Agite cuidadosamente. Incube 60 min a TA (18-25 C). 4. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 250 µl de Buffer de Lavado diluido. Remueva el exceso de solución golpeando suavemente la placa invertida sobre toallas de papel. 5. Para añadir la solución de Substrato y de Paro utilice de ser posible una pipeta de 8 canales. El Substrato y la solución de Paro debe añadirse respetando los mismos intervalos de tiempo. Utilice un sobrevolumen para evitar la formación de burbujas. 6. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 7. Incube 30 min a TA (18-25 C). 8. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 µl de Solución de Paro en cada pocillo. Mezcle brevemente el contenido agitando la placa. 9. Mida la densidad óptica con un fotómetro a nm (Longitud de onda de referencia: nm) dentro de los 30 min de haber agregado la Solución de Paro. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, Aplique cada señal de los estándares (los duplicados con un valor obviamente fuera de límites debe omitirse y emplearse el valor único más plausible). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. Conversión: 17-OH-Progesterona (ng/ml) x 3.03 = nmol/l Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar 17-OH- Progesterona (ng/ml) DOMedio DO/DOmax (%) A B C D E F G (OD) OH-Progesterone ELISA (ng/ml) Version / 6

6 14. VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Los sujetos aparentemente sanos presentan los siguientes valores: 17-OH-Progesterona (ng/ml) Mujeres Hombres Fase Medio Intervalo N Medio Intervalo N Fase folicular Fase luteal después de la estimulación ACTH 1.4 < 3 17 Embarazo (3er trimestre) Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Los siguientes componentes sanguíneos no tienen un efecto significativo (+/-20%) en los resultados hasta las concentraciones declaradas: Hemoglobina Bilirrubina Triglicéridos 16. PRUEBAS FUNCIONALES Especificidad Analítica (Reactividad Cruzada) Sensibilidad Analítica (Límite de Detección) Precisión Linearidad Recuperación Comparación del Método versus GCMS 8.33 mg/ml 0.33 mg/ml 45.5 mg/ml Substancia Reactividad Cruzada (%) 17-OH-Pregnenolona 1.7 Progesterona Desoxi-Cortisol 1.3 Desoxicorticosterona 0.12 Cortisol Pregnenolona DHEA Reactividad cruzada de otras substancias testeadas % DHEA-sulfato, Danazol, Estrona, Estriol, Cholesterol Señal media (Estándar-Cero) - 2DS 0.03 ng/ml CV (%) Intervalo (ng/ml) Intra-Ensayo Inter-Ensayo Dilución en Serie hasta Intervalo (%) Intervalo (ng/ml) 1: Recuperación después Intervalo (%) Medio (%) del enriquecimiento Ensayo IBL = 1.31 x GCMS 0.45 r = 0.94 n = 22 Version / 6

7 17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Sahin Y and Kelestimur F. 17-Hydroxyprogesterone responses to gonadotrophin-releasing hormone agonist buserelin and adrenocorticotrophin in polycystic ovary syndrome: investigation of adrenal and ovarian cytochrome P450c17alpha dysregulation. Hum. Reprod., 12: (1997) 2. Liovic M et al. CYP17 gene analysis in hyperandrogenised women with and without exaggerated 17- hydroxyprogesterone response to ovarian stimulation. J. Endocrinol. Invest., 20: (1997) 3. Oriola J et al. Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gene. Clin. Chem., 43: (1997) 4. Ibanez L et al. Ovarian 17-hydroxyprogesterone hyperresponsive-ness to gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist challenge in women with polycystic ovary syndrome is not mediated by luteinizing hormone hypersecretion: evidence from GnRH agonist and human chorionic gonadotropin stimulation testing. J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: (1996) 5. Bernini GP et al. 17-Hydroxyprogesterone response to ACTH in bilateral and monolateral adrenal incidentalomas. J. Endocrinol. Invest., 19: (1996) J. Assist. Reprod. Genet., 13: (1996) 6. Glock Jl et al. The relationship of corpus luteum volume to relaxin, estradiol, progesterone, 17- hydroxyprogesterone and human chorionic gonadotropin levels in early normal pregnancy. Early Pregnancy, 1: (1995) 7. Berkow R, Fletcher AJ, Beers MH.Congenital Adrenal Hyperplasia. In The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, pp , Merck & Co., Inc., 16th edition Chrousos GP, Loriaux DL, Mann DL, Cutler GB. Lateonset 21-Hydroxylase deficiency mimicking idiopathic hirsutism or polycystic ovarian disease. Ann. Int. Med. 96: 143 (1982). 9. Schnakenburg K, Bindlingmaier F, Knorr D. 17-hydroxy-progesterone, androstendione, and testosterone in normal children and in prepubertal patients with congenital adrenal hyperplasia. Eur. J. Pediatr. 133: 259 (1980). Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: [email protected] WEB: Symbols Version 4.5 /