Genética Bacteriana 2016

Transcripción

1 Genética Bacteriana 2016 Guía de Estudio 1) Cómo es la estructura de una célula bacteriana? Cómo está organizado su genoma? R: La célula bacteriana (Gram-) contiene dos membranas externas que encierran el espacio periplásmico y una pared celular, generalmente de péptidoglucano, que le otorga rigidez y protege de los shocks osmóticos. La membrana interna encierra al citoplasma, separándolo del periplasma. En el citoplasma encontramos toda la maqu-naria necesaria para la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. La membrana interna es compuesta por una bicapa lipídica mayormente de fosfolípidos, mientras que la externa contiene una hemimembrana interna similar y una capa externa de lipopolisacárico. Las bacterias Gram+ no tienen membrana externa y la pared de peptidoglicano es más gruesa que la de las Gram-. Si bien no existe un núcleo, como en las células eucariotas, el ADN se encuentra organizado en el nucleoide, que es una masa de ADN y proteínas (80% ADN), que puede ser observado por microscopía. El nucleoide contiene dominios cuyo grado de superenrrollamiento no es afectado por los dominios vecinos. Este grado de independencia sugiere que los dominios están asociados a una matriz que impide que se transfieran las tensiones entre ellos. El cromosoma bacteriano no está tan empaquetado como el de los eucariotas, pero se encuentra asociado a una serie de proteínas que cumplen funciones análogas a las de las histonas, como ser HU, HN-S, Fis e IHF. En la mayoría de los casos conocidos, las bacterias poseen un único cromosoma circular que se replica en forma bidireccional. Pueden contener plásmidos grandes (el factor F o el plásmido Ti, por ejemplo, pueden llegar a tener 200 kpb y pueden servir como vectores para ingeniería genética: BAC). 2) Cómo se multiplican las bacterias? R: Se reproducen asexualmente por división binaria (aunque no es la única forma). Es asexual y en los libros viejos se la llama fisión). Incluso las bacterias que esporulan (Bacillus y Clostridium) lo hacen asexualmente y son un ejemplo del fenómeno de diferenciación celular. 3) Qué es un cultivo líquido? Y uno sólido? Para qué se utiliza cada uno? R: Medio de cultivo líquido: es un medio que no tiene soporte sólido, donde los microorganismos crecen en sus-pensión y los nutrientes difunden libremente, por lo que existe competencia por ellos entre los microorganismos. El medio líquido se puede realizar en tubos de ensayo (pocos ml), Erlenmeyers (decenas o cientos de ml) o en fermentadores de varias escalas. Medio de cultivo sólido: difiere del líquido en el agregado de una matriz inerte que sirve de sostén para el crecimiento bacteriano. Esta matriz es por lo general de ágar, un polímero extraído de algas, de consistencia similar a una gelatina. El crecimiento bacteriano ocurre sobre la superficie del ágar, de forma que los microorganismos no pueden moverse libremente y forman colonias aisladas. Los componentes solubles del medio difunden lentamente, por lo que disminuye considerablemente la competencia entre los microorganismos que comparten el medio de cultivo. El medio sólido se suele realizar en cajas de Petri (de varios tamaños y formas), o en frascos chatos (de Roux, utilizados para células tipo fibroblastos). Cada microorganismo origina una colonia, que en muchos casos, por sus características, permite la identificación del microorganismo que la generó. Los medios de enriquecimiento permiten aumentar la proporción de un microorganismo determinado en una población heterogénea. Para ello debe haber competencia entre las distintas cepas microbianas, de forma tal que aumente la proporción de aquellas para las cuales el medio 1

2 de cultivo es adecuado. Es por ello que los medios de enriquecimiento son líquidos, de forma de facilitar la difusión de nutrientes y/o de inhibidores que se utilicen. El medio sólido sirve para aislar colonias (clones) individuales (purificar). El medio líquido sirve para obtener masa (gran cantidad) de células, por ejemplo, para obtener plásmidos en forma preparativa. 4) Qué diferencia un medio selectivo de medio diferencial. R: Un medio selectivo es aquél donde sólo crecerán determinadas cepas o especies. Es un caso extremo de medio de enriquecimiento, pero dado que la competencia entre microorganismos no es necesaria, se utilizan medios sólidos. Un ejemplo de medio selectivo es el que utiliza un antibiótico que sólo permite el crecimiento de las cepas resistentes. Un medio diferencial es aquel que permite diferenciar al menos una de las distintas cepas/especies de una muestra. Los medios diferenciales son sólidos, para permitir el crecimiento aislado de las distintas colonias, de forma tal que puedan distinguirse. El medio diferencial no impide el crecimiento, simplemente permite diferenciar. (ej. bacterias lac+ vs lac- en presencia de X-gal). 5) Diferencie entre un medio completo y uno definido Para qué los utilizaría? R: Medio completo es el que contiene todos los nutrientes incluyendo fuentes de carbono y nitrógeno necesarias para el crecimiento pero no están bien definidos en su composición que puede variar levemente de partida a partida. Por ej. la triptona del medio LB es un hidrolizado de caseína con tripsina, el extracto de levadura es un extracto soluble de levaduras hidrolizadas. El medio definido, en cambio, contiene componentes y concentraciones de aminoácidos individuales y vitaminas (por ejemplo biotina para E. coli) perfectamente establecidos y constantes. 6) Qué es la técnica de plaqueo en réplica (replica plating)? Para qué sirve? R: Cuando obtenemos sobre la superficie del agar de una caja de petri un número de colonias, cada una de las cuales proviene de un solo microorganismo y debemos analizar su comportamiento en distintos medios de cultivo, existe la posibilidad de replicar dicha placa de petri. Esto implica obtener otra placa con la misma distribución de colonias, cada una de las cuales debe ser genéticamente idéntica a la de la placa madre. Para ello se usa un trozo de terciopelo estéril, que cubre un lado de un cilindro del diámetro de la caja de petri. El cilindro se coloca suavemente sobre la caja de petri a replicar, contactando el terciopelo con las colonias. Algunos microorganismos de cada colonia quedarán adheridos al terciopelo, y este se usa a la manera de un sello en una caja de petri vacía. En esta última, crecerán colonias idénticas a las originales, en la misma posición. Podríamos evaluar, por ejemplo cuales son resistentes a un antibiótico determinado, con lo que bastaría con preparar una placa con dicho antibiótico y hacer la réplica a dos placas, una con y otra sin antibiótico. 7) Qué es una placa (playa o calva) de lisis? R: La difusión limitada que se observa en los medios sólidos también puede ser utilizada para estudiar fagos (vi-rus) bacterianos. Si distribuimos sobre una placa de petri un cultivo denso de bacterias, ellas crecerán cubriendo toda la superficie, lo que llamamos césped. Si antes de sembrar la placa, mezclamos las bacterias con una sus-pensión diluída de fagos, éstos infectarán y lisarán las bacterias y en la superficie del ágar se observará un halo translúcido por cada fago infectivo como consecuencia de la lisis localizada de bacterias. Es decir, las bacterias son el medio de cultivo de los fagos. Esto no sólo permite titular (contar) suspensiones de fagos, también permite trabajar con ellos en forma análoga a lo que hacemos con otros microorganismos. Existe un método análogo para estudiar virus animales, aunque eso se hace sobre monocapas de células en cultivo. Para obtener un número bajo y cuantificable de placas se requiere mezclar un exceso de bacterias con una cantidad mucho menor de viriones (a esto se le llama baja multiplicidad) 2

3 de manera que la probabilidad de que 2 partículas virales distintas penetren en la misma célula sea insignificante. Después se plaquean las células sobre la caja de Petri. 8) Qué se entiende por "sexo" en organismos procarióticos R: A los bizarras formas de transferencia parcial de ADN entre bacterias de la misma o de distinta especie: transformación, a través de bacterias muertas que actúan como machos (donantes); transducción, a través de sus virus; conjugación, a través de plásmidos y estructuras de secreción que conforman puentes celulares. 9) Describa brevemente el mecanismo de conjugación. Siempre se observa transferencia de información genética cromosómica? R: Se produce entre una bacteria conteniendo un plásmido conjugativo (históricamente denominado Factor F o episoma) llamada F+ y una que no lo contiene. La conjugación es el mecanismo por el cual una bacteria transfiere a otra una hebra simple de ADN. El mecanismo es similar al de replicación por círculo rodante (rolling circle). Primero se genera un corte (nick) en una de las cadenas, más precisamente en la región conocida como orit, por origen de transferencia. En el sitio de corte, una helicasa comienza a separar ambas cadenas, a partir de ese punto comienza la transferencia de una de ellas. La transferencia termina cuando se transfiere la secuencia completa (plásmido, por ejemplo) o cuando se interrumpe el contacto entre la bacteria aceptora y la dadora (transferencia cromosómica). En el caso de los plásmidos, cuando finaliza la transferencia se recircularizan utilizando el orit y la cadena complementaria se sintetiza de novo tanto en la bacteria dadora como en la aceptora. Además del orit, los plásmidos transmisibles contienen una serie de genes que son necesarios para la transferencia, los genes tra. Estos genes codifican para el pilus que es una estructura que protruye de la bacteria dadora y hace contacto con la bacteria receptora y facilita la formación de complejos de secreción tipo III. Además del pilus, otros genes tra codifican para proteínas que no tienen un rol estructural, como ser la endonucleasa que realiza el corte inicial y la helicasa.otro tipo de plásmidos que no son transmisibles, pero si son movilizables se encuentran en la naturaleza. Dichos plásmidos no contienen el juego completo de genes tra, pero sí contienen la región mob, que permite que los genes tra de un plásmido transmisible puedan actuar en trans para transferir a los plásmidos movilizables. La región mob contiene un origen de transferencia y algunas de las enzimas necesarias para la transferencia, como ser la endonucleasa y la helicasa. En el caso más común, sólo se transfiere una copia (en general completa) del plásmido (ej. factor F) por lo que la célula receptor (F-) se convierte en F+. NO hay transferencia de genes cromosómicos ni, por lo tanto, aparición de recombinantes para genes cromosomales; a menos que estos se encuentren transpuestos en el Factor F (sexducción), lo que no es muy común. Esta forma de apareamiento permite transferir horizontalmente (es decir, incluso entre especies distintas como E. coli y Salmonella typhimurium) genes nuevos importantes como pueden ser los genes de resistencia a antibióticos que pueden ubicarse en plásmidos por la susodicha transposición. Se observa transferencia de ADN cromosómico en donantes Hfr (factor F cointegrado al genoma cromosomal) o en sexducción (factor F recombinado = F' conteniendo algún gen cromosomal). 10) Cuál es la diferencia entre una cepa Hfr y una F+? R: Hfr proviene de High frequency recombination. El plásmido F tiene aproximadamente unas 100 kpb y codifica para los genes tra que lo hacen transmisible, manteniendo en general una copia por célula. Las cepas F+, son las que contienen el plásmido F como episoma. Como el plásmido F tiene algunas secuencias homólogas a secuencias cromosómicas (transposones llamados elementos IS), en algunos casos ocurren eventos de recombinación, donde el plásmido F se integra al cromosoma. En estos casos, el orit y los genes tra siguen siendo funcionales, y pro-mueven la transferencia del cromosoma, que puede llegar incluso a ser completa. La transferencia cromosómica es la causa de la 3

4 alta frecuencia de recombinación de estas cepas y de allí su nombre Hfr. La cointegración del plásmido (la cual se produce, usualmente, por entrecruzamiento via recombinasa (rec A combinada con recbcd) entre el cromosoma y el factor F en regiones con secuencias homólogas, usualmente transposones duplicados en ambos ADNs o, más raramente, como producto de una transposición sin resolución). Resolución quiere decir: separación de los 2 círculos cointegrados después de que se produjo la copia o transferencia del transposón entre el círculo de ADN dador al receptor). 11) Qué es un F' y cómo se origina? R: Un F' es un plásmido derivado del F que contiene fragmentos de ADN cromosómico. Cuando un plásmido F se escinde de una cepa Hfr (resolución), en general ocurre por recombinación entre los sitios IS flanqueantes (los mismos que permitieron la integración). Hay casos en que los eventos de recombinación ocurren entre secuencias más lejanas (otros elementos IS o secuencias homólogas) y el plásmido que se escinde es mayor que el original y contiene el fragmento cromosómico que estaba contenido entre las secuencias que recombinaron. Estos plásmidos F se denominan F. También se pueden generar plásmidos F por otros mecanismos como ser la transposición. Un F es una forma natural (in vivo) de clonado molecular en un vector plasmídico, sin uso de enzimas de restricción, muy usada por los genetistas bacterianos. Los genetistas bacterianos suelen utilizar, para ello, un virus que es, al mismo tiempo, un transposón llamado fago μ. 12) Cómo determinaría orden y distancia entre genes utilizando la técnica de "apareamiento interrumpido"? R: Cuando una cepa Hfr conjuga con una cepa F-, el ADN se transfiere desde el orit. Puede llevar más de una hora y media la transferencia completa, lo que generalmente no ocurre. El ADN transferido puede recombinar con el cromosoma de la cepa aceptora. Dado que en la suspensión, la interrupción de la conjugación ocurre durante todo el proceso, la frecuencia de recombinantes cae exponencialmente con la distancia al orit. La frecuencia de recombinación para un marcador es entonces una medida de la distancia al orit. Para determinar el orden entre dos marcadores se analizan la cantidad de recombinantes dobles. Cuanto mayor es la frecuencia de aparición de los dobles recombinantes, menor es la distancia entre ellos (menor es la frecuencia de recombinantes entre ellos). Por lo tanto, se hace cronometrando la aparición de recombinantes en una conjugación entre una Hfr y una F-que se interrumpe artificialmente con una licuadora a distintos intervalos y que implique la transferencia de alelos diferenciables de los genes a estudiar. 13) Algunos bacteriófagos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de ciclos dentro de su hospedador. Explíquelos y ejemplifique. Qué es un profago o un provirus? R: Existen fagos en los cuales el proceso de infección puede tomar por dos vías antagónicas, lisis o lisogenia. En el ciclo lítico, las funciones tempranas y tardías codificadas por el fago son activadas en forma programada originando un gran número de partículas virales y provocando finalmente la lisis. En el ciclo lisogénico, la mayor parte de los genes virales son reprimidos, el ADN viral se cointegra al genoma bacteriano formando un provirus (llamado pro-fago en bacterias) y se multiplica silenciosamente en la bacteria. Hay procesos externos, como el daño al ADN que producen la activación del ciclo lítico. Esta cointegración puede ser mediada por enzimas de recombinación codificadas por los virus como es el caso de la integrasa del fago λ que, a diferencia de la recombinasa del huésped, pro-duce recombinación específica de sitio (una secuencia de ADN llamada attb, presente entre los operones gal y bio de E. coli. Como esto es muy distinto a la recombinación homóloga tradicional, se lo denomina recombinación ilegítima. El virus HIV (y otros retrovirus eucarióticos) también tienen una fase proviral. Si bien el mecanismo es más complejo, los retrovirus son capaces de transducir genes 4

5 cromosomales (por ejemplo se ha estudiado mucho la transducción de oncogenes entre células eucarióticas, al igual que lo hacen los fagos en bacterias). 14) Compare transducción generalizada y especializada. R: En la transducción, un bacteriófago (virus) transfiere DNA desde la bacteria en la cual se reprodujo a la bacteria que infecta. El virus debe tener la característica de no producir la lisis del hospedero al cual transfiere el material genético, es decir la partícula viral debe ser defectiva. Existen diferentes tipos de transducción, ellas son: Los fagos que las realizan tienen estrategias diferentes de encapsidación. Los fagos que permiten la transducción generalizada (por ej. P1) no son capaces de reconocer específicamente el ADN que encapsidan por lo que son capaces de transducir cualquier segmento de ADN cromosómico, sin importar su secuencia. Es decir que, potencialmente, pueden transferir cualquier segmento cromosómico del tamaño apropiado. Es decir, que es aquella en que cualquier porción del genoma del hospedante del virus puede hacerse parte de la partícula viral madura reemplazando al ADN viral. Transducción Especializada o Restringida. Se define a ésta cuando el virus sólo puede transferir determinados genes bacterianos cercanos a su sitio de integración genómica. Los fagos que permiten t.e. son aquellos que pueden pasar por una fase lisogénica (por ej. el fago λ) integrándose en un sitio preciso del genoma (entre los operones gal y bio en el caso de λ) y tienen mecanismos de reconocimiento de ADN al encapsidar (tipo secuencia cos del fago λ) por lo que sólo son capaces de transportar genes vecinos al sitio de integración que accidentalmente permanecen unidos al genoma viral en el entrecruzamiento que se produce al resolver el cointegrado (como primer paso hacia la activación de la fase lítica). Además, en la t.g. el segmento de ADN donante se incorpora por recombinación homóloga reemplazando al alelo nativo (la célula sigue siendo monoploide). En la t.e. el ADN donante se integra como si fuera un profago y se produce un diploide parcial. Nota: todo esto se puede resumir en un cuadro. 15) Cómo sería afectada en su capacidad de dar colonias transducidas una cepa bacteriana rec-(deficiente en los sistemas de recombinación celulares) al infectarla con un lisado transductor del bacteriófago λ? y por el fago P1? R: La inducción del fago λ requiere de la proteína RecA. RecA se activa por daño cromosómico (por formación de ssdna que es sustrato de RecA) y, a su vez, esta interactúa con el represor del ciclo lítico. Esto produce la derre-presión de las funciones líticas y el ciclo lítico comienza. El fago λ se integra como profago al genoma bacteriano en sitios específicos, attb. Requiere además funciones celulares como IHF y la integrasa que es una recombinasa específica de secuencia (la secuencia attb) de λ, pero NO requiere RecA. Esto implica que no se vería afectada la capacidad de transducir si la cepa aceptora es RecA-. En el caso del fago P1, la capacidad de transducción se vería afectada, ya que el fago P1 transduce fragmentos de ADN cromosómico de la cepa dadora que tienen que recombinar con las porciones homólogas de la cepa aceptora. 16) Pueden recombinar los virus entre sí? Qué mecanismos están involucrados? R: Sí. En los casos de virus con genoma de ADN de doble cadena: recombinación homóloga usando las enzimas de la célula huésped. En los virus a ADN de simple cadena, la recombinación puede realizarse entre las formas replicativas (que son de doble cadena). Hay mecanismos de (pseudo)recombinación en virus a ARN cuya explicación excede lo que se pretende enseñar en la materia. 17) Describa algunas aplicaciones de la utilización de fagos para la ingeniería genética. R: El fago λ es un vector ampliamente utilizado en ingeniería genética en el que el ADN conteniendo los genes codificantes para lisogenia fueron artificialmente reemplazados por ADN (por ej. humano) que es transducido sin posterior lisogenización a bacterias (que 5

6 no tienen otra opción que ser lisadas) para su clonado molecular, con-servación y multiplicación. 18) Qué es la transformación bacteriana? Se logra únicamente en forma artificial o también ocurre en poblaciones naturales? R: La transformación bacteriana es un proceso por el cual las bacterias incorporan ADN del medio. Se logra en condiciones de competencia, es decir, cuando las bacterias son competentes para la transformación. La competencia puede ser natural, lo que se observa en algunas especies o puede ser inducida en laboratorio. La transformación natural implica, entre otras cosas, el ingreso de ADN de simple cadena en la célula receptora después de un reconocimiento por receptores ubicados en la periferia celular, un reemplazo alélico en las colonias recombinantes. En la transformación artificial (también llamada transfección), las células son forzadas a permeabilizar el ingreso de ADN (que suele ser de doble hebra como por ejemplo un plásmido) mediante mecanismos artificiales. E. coli, por ejemplo, no es una bacteria que intercambia ADN por transformación en la naturaleza y es la bacteria que más se transforma (= transfecta) en el laboratorio. 19) Se pueden mapear genes por transformación? R: Sí; en forma similar a la transducción, la eficiencia de cotransformación es una medida de la cercanía de dos loci determinados. Contrariamente a los mapeos utilizando cepas Hfr, pero en forma similar a la transducción, la transformación es útil para los mapeos finos. Al igual que en la transducción generalizada, el % de cotransformación de 2 genes es inversamente proporcional a su distancia. Estos métodos de mapeo genético en bacterias han sido totalmente reemplazados, en la actualidad, por métodos de mapeo físico por lo que se les prestará menor importancia a la que se le da en los libros de texto. 6

7 Guía de problemas 1) Los genes para la síntesis del aminoácido prolina en Yersinia pestis se encuentran organizados en el genoma como se muestra en la siguiente figura. A B C D E Para determinar la organización transcripcional de este locus se dispone de mutantes por inserción de un gen de resistencia a antibiótico que es polar sobre los genes río abajo, es decir que posee un terminador de la transcripción en su extremo 3. Sobre cada mutante se miden las actividades enzimáticas de todos los genes del locus. Las actividades se expresan como porcentajes de la actividad de la cepa parental o silvestre, los datos son: Mutante 1: Mutante 2: Mutante 3: Mutante 4: Mutante 5: 100% actividad de A, 0% actividad de B 50% actividad de C, D y E 0% actividad de A y B 50% actividad de C, D y E 100% actividad de A y B 0% actividad de C, D y E 100% actividad de A, B, C y D 0% actividad de E 100% actividad de A, B y C 0% actividad de D y E a) Marque en la región genómica la posición de el/los promotor/es e indique que gen se encuentra interrumpido en cada mutante. Por otro lado se sabe que, debido a que es un operón anabólico, la síntesis del mismo se induce en ausencia de prolina. Se posee una mutante en el gen regulatorio del operón y la misma es auxótrofa para prolina. Qué le indica este resultado? 2) Se realiza un experimento de transformación con una cepa bacteriana donante resistente a cuatro antibióticos: A, B, C y D. La cepa receptora es sensible a las cuatro drogas. La población de células receptoras tratada se divide y se siembra en placas de medios suplementados con varias combinaciones de las drogas. Los resultados fueron: 7

8 a) Uno de los genes está claramente alejado de los otros tres, los cuales parecen estar estrechamente ligados. Cuál es el gen distante? b) Cuál es el orden de los tres marcadores que están ligados? 3) Una cepa F - a - b - c - d - Str R normalmente da revertantes a +, b +, c + o d + a una frecuencia aproximada de 1 colonia revertante por cada 10 7 células sembradas en el medio selectivo correspondiente. A partir de esta cepa se aisló un clon con las mismas auxotrofías (a - b - c - d - ) y con la misma tasa de reversión hacia a + y d + pero con una frecuencia de aparición de revertantes c+ y b+ no detectables. Se utilizó esta cepa como receptora en un experimento de apareamiento con la Hfr a + b + c + d + Str S. La figura muestra los resultados obtenidos usando medios selectivos que carecen de a, b, c ó d. N recomb. a+ strp r b+ c+ d min. Luego se tomaron 100 colonias d +, 100 b + y 100 c + de las placas de 30 minutos y se ensayó su genotipo para los otros dos marcadores. Los resultados se resumen en la tabla: Explique los resultados obtenidos. d + b + c + d b c ) Se desea construir en la bacteria C, una mutante por inserción de un gen de resistencia a kanamicina en el gen glgb. Se cuenta con una cepa mutante en glgb por inserción con kanamicina en la bacteria A. El problema es que los fagos que infectan la cepa A no infectan la cepa C. El laboratorio vecino trabaja en el mismo gen glgb y posee la región genómica del mismo (que incluye a glgb) en un episoma con resistencia a ampicilina, replicativo y conjugativo per se en la cepa B. El fago que infecta la cepa A también infecta la B y el plásmido es suicida en la cepa C. Qué debería hacer para construir la mutante en la cepa C? 5) Suponga que Ud. ha aislado independientemente, 2 cepas mutantes arg -, desde una cepa parental de E. coli que ya era met - y strp r. Ud. aparea sus dos mutantes (1 y 2) con una Hfr sensible a streptomicina y que no requiere de arginina ni de metionina para crecer. Utilizando la técnica de apareamiento interrumpido Ud. obtiene las curvas de tiempo de entrada que se muestran en la figura. 8

9 N o recomb. arg + + strp r met + + strp r min. N o recomb. met + + strp r arg + + strp r min. Dibuje un mapa genético que explique las diferencias observadas entre ambos cruzamientos. 6) En un experimento de transducción generalizada se obtienen fagos a partir de una cepa de Proteus vulgaris de genotipo cis + leu + thr + y son usados para transducir (a baja multiplicidad de infección) a una cepa receptora de genotipo cis - leu - thr-.inicialmente la población receptora así transducida es plaqueada en medio mínimo suplementado con treonina y leucina obteniéndose muchas colonias. a- Cuáles son los posibles genotipos de estas colonias? Se realiza plaqueo en réplica de estas colonias en tres medios diferentes: 1- MM + thr 2- MM + leu (MM= medio mínimo) 3- MM b- En teoría, qué genotipos podrían crecer en estos tres medios? Se obtuvieron los siguientes resultados: Medio % de colonias respecto al total observado en la placa con thr + leu c- Cuáles son los genotipos de las colonias obtenidas? d- Dibuje un mapa mostrando el orden de los tres genes y señale el par más próximo. 9

10 7) El genoma de la bacteria Escherichia coli jejuni ha sido completamente secuenciado. A pesar de que su genoma es casi idéntico al de E. coli, esta bacteria presenta un locus cromosómico diferencial llamado Aep1, cuya organización genómica se detalla en la figura, y para el cual no se tiene ninguna información (ni experimental ni por homología de secuencia) acerca de la función de las proteínas que codifica: P Q R S Para comenzar a analizar el locus Aep1, se generaron mutantes polares por inserción de un cassette de resistencia a kanamicina en los genes p, q y s, y en cada uno de estos mutantes se midió la expresión de todos los genes del locus Aep1 por Western blot usando anticuerpos generados contra las correspondientes proteínas recombinantes. Los resultados son: Expresión Inserción en p q r s Gen p 0% 0% 0% 100% Gen q 100% 0% 0% 100% Gen r 100% 100% 0% 100% Gen s 0% 0% 0% 0% a) Indique una posible manera de generar uno de estos mutantes por inserción (detalle los pasos de construcción, selección y evaluación del mutante), suponiendo que usted dispone de todas las herramientas moleculares que necesite. b) Aconsejaría la utilización de trasposones para generar estas mutantes? Justifique. c) Cómo es la organización transcripcional del locus? Donde están él o los promotores? d) A partir de esta organización transcripcional, puede decir algo de la funcionalidad de los genes estudiados? e) Como sería el patrón de expresión de los genes en una mutante por inserción del mismo cassette en el gen r? 8) Un investigador está interesado en mapear y estudiar 3 genes a, b y c involucrados en la biosíntesis de aminoácidos. Se sabe que los productos de los genes a, b y c catalizan las siguientes reacciones, en las que X es un compuesto que puede ser sintetizado por ambas cepas de bacteria creciendo en un medio mínimo (MM): Para realizar el estudio dispone de 2 cepas de bacterias: Hfr a + b + c + Str S y otra F - a - b - c- Str R con las cuales realizó un experimento de conjugación interrumpida obteniendo los siguientes resultados: 10

11 a) En qué medios se seleccionaron cada uno de los genotipos de bacterias del gráfico anterior? b) A qué distancia del origen de transferencia de la cepa Hfr utilizada mapean los genes a, b y c? c) Grafique y explique los resultados que hubiera tenido en el experimento de conjugación interrumpida si el genotipo de la cepa dadora hubiese sido: i) Hfr a + b + c + Str R ii) Si el origen de transferencia de la cepa Hfr se encontrara entre el gen b y el c. 11