Ensayo del metabolito de la cocaína DRI
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- María Mercedes Martin Cárdenas
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1 Ensayo del metabolito de la cocaína DRI Exclusivamente para uso diagnóstico in vitro (3 x 18 ml) 0055 (100 ml Kit) 0056 (500 ml Kit) Indicaciones El ensayo del metabolito de la cocaína DRI de es un inmunoensayo enzimático homogéneo destinado a la determinación cualitativa y semicuantitativa de benzoilecgonina (metabolito de la cocaína) en la orina humana, con un calibrador de 300 ng/ml o de 150 ng/ml. El ensayo únicamente ofrece un resultado analítico cualitativo preliminar. Es necesario utilizar un método químico alternativo más específico con el fin de obtener un resultado analítico confirmado. El método de confirmación preferente es la cromatografía de gases/ espectrometría de masas (). 1,2 Se han de aplicar las consideraciones clínicas y el buen juicio profesional ante cualquier resultado de una prueba de drogas duras, en particular cuando se utilicen resultados preliminares. Las pruebas del metabolito de la cocaína no son capaces de distinguir entre drogas duras y ciertos medicamentos recetados. Resumen y explicación de la prueba La cocaína (benzoilmetilecgonina), se deriva de las plantas de la especie Erythroxylon coca, que se cultiva ampliamente en Sudamérica. 3-5 La cocaína es una droga ilícita muy común y de amplio consumo en EE. UU. 3,4,6 El consumo de cocaína puede producir euforia, excitación, locuacidad, estado de alerta, ansiedad, insomnio, hiperactividad, paranoia, psicosis grave e incluso el suicidio. 3,6,7 La cocaína se metaboliza rápidamente, y menos del 5% se excreta en forma inalterada en la orina. 4,6,7 Los dos principales metabolitos, que resultan de la hidrólisis enzimática y no enzimática, son benzoilecgonina y el éster metílico de ecgonina. 4,6-9 Los metabolitos pueden ser detectados en la orina durante un máximo de 3 semanas después del abuso a largo plazo de cocaína. 10,11 El ensayo del metabolito de la cocaína DRI es un inmunoensayo enzimático homogéneo que utiliza reactivos líquidos listos para usar. 12 El ensayo utiliza un anticuerpo específico, capaz de detectar benzoilecgonina en la orina. Se basa en la competencia entre una droga marcada con la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) y la droga presente en la muestra de orina por un número determinado de sitios de unión del anticuerpo específico. En presencia de la droga libre contenida en la muestra, esta ocupa los sitios de unión del anticuerpo, de modo que la droga marcada con G6PDH puede interaccionar con el sustrato, lo que se traduce en la actividad enzimática. En ausencia de droga en la muestra, el anticuerpo específico se une a la droga marcada con G6PDH, con lo que se inhibe la actividad de la enzima. Este fenómeno da lugar a una relación directa entre la concentración de la droga en la orina y la actividad enzimática. La actividad enzimática de la G6PDH se determina por espectrofotometría a 340 nm, midiendo su capacidad de convertir nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) en NADH. Reactivos Reactivo de anticuerpo/sustrato (R1) Contiene anticuerpo monoclonal de ratón anti-benzoilecgonina, glucosa-6-fosfato (G6P) y nicotinamida adenina nucleótido (NAD) en tampón Tris con azida de sodio como conservante. Reactivo enzimático conjugado (R2) Contiene un análogo de benzoilecgonina marcado con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) en tampón HEPES con azida de sodio como conservante Materiales adicionales necesarios (se venden por separado) Descripción del kit 1664 Calibrador negativo DRI, 10 ml 1388 Calibrador negativo DRI, 25 ml 1588 Calibrador multidroga DRI 1, 10 ml 1589 Calibrador multidroga DRI 1, 25 ml 1591 Calibrador multidroga DRI 2, 10 ml 1592 Calibrador multidroga DRI 2, 25 ml 1594 Calibrador multidroga DRI 3, 10 ml 1595 Calibrador multidroga DRI 3, 25 ml 1597 Calibrador multidroga DRI 4, 10 ml 1598 Calibrador multidroga DRI 4, 25 ml DOAT-2 MAS DOA Total Nivel 2, 6 x 18 ml DOAT-3 MAS DOA Total Nivel 3, 6 x 18 ml DOAT-4 MAS DOA Total Nivel 4, 6 x 18 ml DOAT-5 MAS DOA Total Nivel 5, 6 x 18 ml Precauciones y advertencias 1. Esta prueba está diseñada exclusivamente para uso diagnóstico in vitro. Los reactivos son nocivos por ingestión. 2. Los reactivos utilizados en los componentes del ensayo contienen 0.09% azida de sodio. Evite el contacto con la piel y las mucosas. Lave la zona afectada con abundante agua. Solicite atención médica inmediata en caso de contacto con los ojos o ingestión. La azida de sodio puede reaccionar con el plomo o el cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Al verter estos reactivos por el desagüe, hágalo siempre con grandes volúmenes de agua para evitar la acumulación de azidas. Limpie las superficies metálicas expuestas con hidróxido de sodio al 10%. 3. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. Preparación y almacenamiento de los reactivos Los reactivos se suministran listos para su uso; no es precisa ninguna preparación adicional. Los reactivos se han de conservar refrigerados a 2 8 C. Si se conservan a 2 8 C, abiertos o sin abrir, todos los componentes del ensayo son estables hasta la fecha de caducidad indicada en sus etiquetas respectivas. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. Recogida y preparación de las muestras Recoja las muestras de orina en recipientes de vidrio o plástico. Se han de utilizar muestras de orina recién obtenidas. The Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs (Directrices Federales Obligatorias para los programas de pruebas de detección de drogas en entornos laborales) recomiendan que las muestras que no sean objeto de una prueba inicial en un plazo de 7 días desde su llegada al laboratorio deben colocarse en unidades de refrigeración seguras fijadas a temperaturas comprendidas entre 2 C y 8 C. 2 Se ha de tratar por todos los medios de mantener las muestras pipeteadas exentas de cualquier residuo macroscópico, y se recomienda centrifugar las muestras muy turbias antes del análisis. La adulteración puede causar resultados erróneos. Si existen sospechas de adulteración de la muestra, obtenga otra muestra y envíe ambas muestras al laboratorio para su análisis. Manipule todas las muestras de orina como si fueran potencialmente infecciosas. Procedimiento del ensayo Para realizar este ensayo, se pueden utilizar analizadores clínicos de bioquímica capaces de mantener una temperatura constante, pipetear muestras, mezclar reactivos, medir las tasas enzimáticas a 340 nm y cronometrar la reacción con precisión. Antes de realizar este ensayo, consulte la hoja de protocolos de cada analizador específico para conocer los parámetros y/o las instrucciones de uso adicionales. Control de calidad y calibración 13 Las buenas prácticas de laboratorio sugieren el uso de muestras de control con el fin de garantizar un correcto funcionamiento. Utilice controles calibrador para validar la calibración. Se recomienda analizar dos controles; uno con una concentración del 25% por encima del límite seleccionado y otro con una concentración del 25% por debajo del límite seleccionado. Utilice el juego de controles MGC Select DAU Set para el control de corte de calidad del valor de 150 ng/ml y el control MGC Primary DAU para el control de corte de calidad de 300 ng/ml. Asegúrese de que los resultados del control se encuentren dentro de los intervalos establecidos, según lo determinado por los procedimientos de laboratorio y las directrices. Si los resultados de control están fuera de los intervalos establecidos, los resultados de las muestras no serán válidos. Todos los requisitos de control de calidad se han de realizar de conformidad con las regulaciones o requisitos de acreditación locales, estatales y/o federales. Cada laboratorio debe establecer sus propios intervalos de control y su propia frecuencia de calibración. Análisis cualitativo Para el análisis cualitativo de las muestras, utilice el calibrador multidroga en orina DRI 1, que contiene 150 ng/ml de benzoilecgonina, o el calibrador multidroga en orina DRI 2, que contiene 300 ng/ml de benzoilecgonina como nivel. El calibrador se utiliza para distinguir entre muestras «positivas» y «negativas». Análisis semicuantitativo Para el análisis semicuantitativo de las muestras, utilice todos los calibradores: el calibrador negativo, el calibrador multidroga 1, 2, 3 y 4 para crear una curva patrón que le permita analizar los resultados. Resultados y valores esperados Análisis cualitativo Una muestra que presente un cambio en el valor de la absorbancia ( A) igual o mayor que el valor obtenido con el calibrador se considera un resultado «positivo». Una muestra que presente un cambio en el valor de la absorbancia ( A) menor que el valor obtenido con el calibrador se considera un resultado «negativo». Consulte la hoja de aplicación del analizador específico para obtener información adicional. Análisis semicuantitativo Es posible obtener una estimación aproximada de la concentración de la droga en las muestras realizando una curva patrón con todos los calibradores y cuantificando las muestras a partir de dicha curva. Las muestras con resultados por encima de la concentración del calibrador alto (1.000 ng/ml) deben diluirse con orina negativa y analizarse de nuevo. La semicuantificación de los resultados positivos permite a los laboratorios determinar una dilución apropiada de la muestra para su confirmación mediante un método de confirmación, tal como. Además, permite al laboratorio establecer procedimientos de control de calidad y evaluar el funcionamiento del control. Consulte la hoja de aplicación del analizador específico para obtener información detallada. Limitaciones 1. Un resultado positivo en este ensayo solo indica la presencia del metabolito de la cocaína y no está correlacionado necesariamente con la magnitud de los efectos fisiológicos y psicológicos. 2. Un resultado positivo en este ensayo debe ser confirmado por otro método no inmunológico, como CG o. 3. La prueba está diseñada para su aplicación exclusiva a orina humana. 4. Existe la posibilidad de que otras sustancias y/o factores (p. ej., errores de la técnica o del procedimiento) aparte de los investigados en el estudio de la especificidad pudiesen interferir con la prueba y dar lugar a resultados falsos.
2 Características específicas de funcionamiento A continuación se muestran los resultados típicos de funcionamiento obtenidos en los analizadores clínicos de bioquímica Beckman Coulter AU 680 y Thermo Scientific Indiko. 14 Los resultados obtenidos por cada laboratorio pueden diferir de estos datos. Sensibilidad Sensibilidad analítica (límite del blanco): definida como la concentración más baja que se puede diferenciar del calibrador de orina negativa con un 95% de confianza, es de 4,44 ng/ml. Sensibilidad funcional (límite de cuantificación): definida como la concentración más baja que da lugar a un CV = 20%, con un intervalo de confianza superior del 95%, es de 8,5 ng/ml. Precisión Se añadió una solución de benzoilecgonina (1 mg/ml) a cada una de cuatro muestras obtenidas de una mezcla de muestras de orina humana hasta alcanzar concentraciones que abarcan todo el intervalo del ensayo. Se analizó la precisión de las muestras tanto en el modo cualitativo como en el semicuantitativo. Siguiendo un protocolo de precisión del CLSI (EP05-A2), las muestras fueron analizadas en 2 repeticiones por ciclo, 2 ciclos al día durante 20 días, con un total de N = 80. Resultados cualitativos en el AU680 Concentración de la muestra (ng/ml) 150 n.º Neg/n.º Pos 300 n.º Neg/n.º Pos / 0 80 / / 0 80 / 0 112, / 0 80 / 0 187, / / / 80 0 / / 80 0 / / 80 0 / 80 Resultados semicuantitativos en el AU680 Concentración de la muestra (ng/ml) Resultado medio, mg/ ml Número de determinaciones 150 n.º Neg/ n.º Pos 300 n.º Neg/ n.º Pos Precisión intraensayo Precisión total DE ng/ml % CV DE ng/ml % CV 75 80,1 80 / 0 80 / 0 2,1 2,7 2,3 2,9 112,5 115,4 80 / 0 80 / 0 2,0 1,8 2,5 2,2 187,5 202,3 0 / / 0 3,8 1,9 4,8 2, ,9 0 / / 0 4,0 1,6 4,4 1, ,1 0 / 80 0 / 80 8,4 2,1 10,0 2, ,7 0 / 80 0 / 80 14,8 2,9 19,1 3,8 Caracterización del nivel Se prepararon muestras enriquecidas a las mismas concentraciones que los calibradores s y los controles de ± 25% por adición de benzoilecgonina a muestras de orina negativas. Las muestras se analizaron en repeticiones de 21 tanto en el modo cualitativo como en el semicuantitativo. Los resultados muestran que, en modo cualitativo, los niveles de control se detectaron con precisión, sin que la respuesta media del control negativo más 2 DE se solapase con la respuesta media del calibrador, y sin que la respuesta media del control positivo menos 2 DE se solapase con la respuesta media del calibrador. En el modo semicuantitativo, los controles negativos presentaron una recuperación menor que los calibradores s, mientras que los controles presentaron una recuperación mayor que los calibradores s. La precisión fue menor del 5% CV en el modo semicuantitativo. Recuperación de la dilución y linealidad Una muestra de orina de paciente con alta concentración, en torno a ng/ml de benzoilecgonina, se diluyó en serie con orina exenta del analito en incrementos de 10% y se analizó en 5 repeticiones de modo semicuantitativo. Todas las muestras presentaron una recuperación dentro de un error de ± 10% del valor esperado y el valor de R fue de 0,9981. Interferencias Se evaluó el efecto potencial de las sustancias endógenas y exógenas de la orina y del ph en la recuperación de benzoilecgonina con el ensayo del metabolito de la cocaína DRI mediante la adición de cantidades conocidas de sustancias posiblemente interferentes a los niveles positivos y negativos (± 25% del valor ) para ambos niveles s. Se determinó que los compuestos no interfirieron con el ensayo si la tasa de cada muestra negativa se encontró por debajo de su tasa discriminatoria, y si todas las muestras presentaron una recuperación en un 20% de error de sus concentraciones esperadas. No se observó interferencia como consecuencia de la adición de los compuestos hasta las concentraciones que figuran a continuación. Resultados cualitativos (NEG/POS) Compuesto Conc. comp Nivel neg Nivel pos Nivel neg Nivel pos Acetona 1 g/dl NEG POS NEG POS Ácido ascórbico 1 g/dl NEG POS NEG POS Ácido oxálico 100 mg/dl NEG POS NEG POS Aspirina 100 µg/ml NEG POS NEG POS Cafeína 100 µg/ml NEG POS NEG POS Cloruro de sodio 1 g/dl NEG POS NEG POS Creatinina 500 mg/dl NEG POS NEG POS Etanol 1 g/dl NEG POS NEG POS Galactosa 10 mg/dl NEG POS NEG POS -globulina 500 mg/dl NEG POS NEG POS Glucosa 3 g/dl NEG POS NEG POS Hemoglobina 150 mg/dl NEG POS NEG POS Ibuprofeno 100 µg/ml NEG POS NEG POS Intervalo de densidad relativa 1,004 1,039 g/ml NEG POS NEG POS Intervalo de ph 3 11 NEG POS NEG POS Paracetamol 100 µg/ml NEG POS NEG POS Riboflavina 7,5 mg/dl NEG POS NEG POS Seroalbúmina humana 500 mg/dl NEG POS NEG POS Urea 1,25 g/dl NEG POS NEG POS Resultados semicuantitativos (ng/ml) Aciclovir 100 Difenhidramina Ácido acetilsalicílico Doxepina 500 Albuterol Fenciclidina Amikacina Fenelzina 100 Amitriptilina 100 Fenobarbital Amobarbital Fentanilo 10 Amoxicilina Fluconazol 100 Anfetamina Fluoxetina 50 Azitromicina 100 Gabapentina 100 Benzocaína Gentamicina Buprenorfina 10 Hiclato de doxiciclina 100 Bupropión 100 Hidroxicina 100 Cafeína 100 Hiosciamina HCl 100 Carbonato de calcio Ibuprofeno Clonidina 100 Indometacina 100 Clorpromacina 500 Lamotrigina Clorzoxazona Oxazepam Codeína Paracetamol Dapsona 10 Paroxetina 100 Dextrometorfano 100 Prometazina 100 2
3 Resultados semicuantitativos (ng/ml), cont. Escopolamina Norfluoxetina HCl Espironolactona Ofloxacina 100 Estavudina 1,0 Omeprazol 100 Heparina de litio Propoxifeno Levofloxacina 100 Ranitidina 100 Lidocaína Risperidona 100 Loratadina 500 Secobarbital Meperidina Terbinafina Mesoridazina Tiopental Metadona Tioridazina Metilfenidato 100 Tobramicina Metoclopramida Tolmetina Metronidazol 100 Tramadol 500 Morfina 200 Trazodona Nalbufina Trimetoprim Naltrexona Vancomicina Naproxeno Venlafaxina Especificidad Se evaluó la reactividad cruzada de la droga original, de sus metabolitos, y de las drogas/ fármacos comúnmente encontradas en las muestras mediante la adición de cantidades conocidas de cada sustancia a orina exenta de benzoilecgonina. Se consideró que un compuesto que produjo resultados negativos en comparación tanto con el calibrador de 150 ng/ml como con el de 300 ng/ml no presenta reactividad cruzada. Los siguientes compuestos originales y metabolitos, analizados con el ensayo del metabolito de la cocaína DRI, dieron lugar a un resultado positivo en las concentraciones que se indican a continuación, con la excepción del éster metílico de ecgonina, que dio lugar a un resultado negativo. Compuesto Nivel de 150 ng/ml Concentración, µg/ml Nivel de 300 ng/ml Concentración, µg/ml Benzoilecgonina 0,15 0,30 Cocaína Cocaetileno Ecgonina Éster metílico de ecgonina Los compuestos no relacionados estructuralmente y/o las drogas/fármacos utilizados de forma concomitante produjeron un resultado negativo en comparación tanto con el calibrador de 150 ng/ml como con el de 300 ng/ml a las concentraciones que se indican a continuación. Aciclovir 100 Ibuprofeno Ácido acetilsalicílico Indometacina 100 Albuterol Lamotrigina Amikacina Levofloxacina 100 Amitriptilina 100 Lidocaína Amobarbital Loratadina 500 Amoxicilina Meperidina Anfetamina Mesoridazina Azitromicina 100 Metadona Benzocaína Metilfenidato 100 Buprenorfina 10 Metoclopramida Bupropión 100 Metronidazol 100 Cafeína 100 Morfina 200 Carbonato de calcio Nalbufina Clonidina 100 Naltrexona Clorpromacina 500 Naproxeno Clorzoxazona Norfluoxetina HCl Codeína Ofloxacina 100 Dapsona 10 Omeprazol 100 Dextrometorfano 100 Oxazepam Difenhidramina Paracetamol Doxepina 500 Paroxetina 100 Escopolamina Prometazina 100 Espironolactona Propoxifeno Estavudina 1,0 Ranitidina 100 Fenciclidina Risperidona 100 Fenelzina 100 Secobarbital Fenobarbital Terbinafina Fentanilo 10 Tiopental Fluconazol 100 Tioridazina Fluoxetina 50 Tobramicina Gabapentina 100 Tolmetina Gentamicina Tramadol 500 Heparina de litio Trazodona Hiclato de doxiciclina 100 Trimetoprim Hidroxicina 100 Vancomicina Hiosciamina HCl 100 Venlafaxina
4 Exactitud Se analizaron ochenta y ocho muestras de orina con la prueba del metabolito de la cocaína DRI en el analizador clínico de bioquímica Beckman Coulter AU680 y mediante. Los resultados son los siguientes: Resultados cualitativos estratificados DRI Negativo bajo por (menos del -50%) Negativo por (entre -50% y el ) Nivel de 150 ng/ml por CG/ EM (entre el y el alto por CG/ EM (más del Porcentaje de concordancia con % Negativo % Nivel de 300 ng/ml % Negativo % Análisis semicuantitativo: la concordancia general entre el ensayo del metabolito de la cocaína DRI en el Beckman Coulter AU y el método de fue del 99,0% en el nivel de 150 y del 95% en el nivel de 300. DRI Resultados semicuantitativos 150 ng/ml 300 ng/ml a DRI c b 46 a La misma muestra indicada en el análisis cualitativo anteriormente (1 a ). b La misma muestra indicada en el análisis cualitativo anteriormente (2 c ). c mostró que fueron positivos valor a 399 y 375 ng/ml, el método DRI produjo negativos valor a 294 y 253 ng/ml. Resumen de los resultados cualitativos discordantes por Valor Resultado DRI (ng/ml) Principal droga presente por 100 POS 88 Benzoilecgonina 300 POS 299 Benzoilecgonina 300 POS 279 Benzoilecgonina 300 NEG 375 Benzoilecgonina Resultados semicuantitativos estratificados DRI Negativo bajo por (menos del -50%) Negativo por (entre -50% y el ) por CG/ EM (entre el y el alto por CG/ EM (más del Porcentaje de concordancia con Nivel de 150 ng/ml % Negativo % Nivel de 300 ng/ml % Negativo % Resumen de los resultados semicuantitativos discordantes por Valor Resultado DRI (ng/ml) (ng/ml) Principal droga presente por (POS) 88 Benzoilecgonina (NEG) 399 Benzoilecgonina (POS) 299 Benzoilecgonina (POS) 279 Benzoilecgonina (NEG) 375 Benzoilecgonina Análisis cualitativo: la concordancia general entre el ensayo del metabolito de la cocaína DRI en el Beckman Coulter AU y el método de fue del 99,0% en el nivel de 150 y del 97% en el nivel de 300. Resultados cualitativos DRI 150 ng/ml 300 ng/ml a DRI b c 46 a Los resultados de mostraron que esta muestra fue negativa a 88 ng/ml. b Fueron resultados positivo límite por DRI y negativo límite por (299 ng/ml y 279 ng/ml). c El método DRI obtuvo un resultado negativo valor a 253 ng/ml. mostró que es un resultado positivo valor a 375 ng/ml. 4
5 Bibliografía 1. National Institute on Drug Abuse (NIDA). Urine Testing for Drugs of Abuse. Research Monograph 73 (1986). 2. National Institute on Drug Abuse. Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs. Federal Register Vol. 73, No 228, 2008: Gawin FH, Ellinwood EH Jr. Cocaine and other stimulants: Actions, abuse, and treatment. N. Engl. J. Med. 1988, 318: Jatlow, Pl. Drugs of abuse profile: Cocaine. Clin. Chem. 1987, 33 (suppl): 66B-71B. 5. Bouknight LG, Bouknight RR. Cocaine - A particularly addictive drug. Postgrad. Med.1988; 83: , Benowitz, NL, Clinical pharmacology and toxicology of cocaine. Pharmacol. & Toxicol.1993; 72: Jones RT. The pharmacology of cocaine. In: Grabowski, J.ed. Cocaine: Pharmacology, Effects and Treatment of Abuse. NIDA Research Monograph. 1984; 50: Ambre J. Urinary excretion of cocaine and metabolites in humans: A kinetic analysis of published data. J. Anal. Toxicol. 1985; 9: Ambre J, Ruo Tl, Nelson J, Belknap S. Urinary excretion of cocaine, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in humans. J. Anal. Toxicol. 1988; 12: Weiss RD. Gawin, FH. Protracted elimination of cocaine metabolites in long-term, highdose cocaine abusers. Am. J. Med. 1988, 85: Burke WM, et al. Prolonged presence of metabolite in urine after compulsive cocaine use. J. Clin. Psychiatry. 1990; 51: Rubenstein KE, Schneider RS, and EF Ullman. Homogeneous Enzyme Immunoassay: A New Immunochemical Technique. Biochem Biophis Res Commun 47: 846 (1972). 13. Data on traceability are on file at Microgenics, a part of Thermo Fisher Scientific. 14. Data on file at Microgenics, a part of Thermo Fisher Scientific. Microgenics Corporation Fremont Blvd. Fremont, CA EE. UU. Servicio técnico y de asistencia al cliente en EE. UU.: Thermo Fisher Scientific Oy Ratastie 2, P.O. Box Vantaa, Finland Tel: Fax: Para conocer las actualizaciones de este folleto, visite: Otros países: Póngase en contacto con su representante local de Thermo Fisher Scientific _ES
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