Que debo saber del Antibiograma? Interpretación práctica Principales fenotipos de resistencia
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- José Antonio Alvarado Paz
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1 Que debo saber del Antibiograma? Interpretación práctica Principales fenotipos de resistencia Dr. Freddy Roach Poblete Médico Microbiólogo y Parasitólogo clínico Laboratorio clínico Hospital Regional de Antofagasta. En 1929, el médico y bacteriólogo escocés, Alexander Fleming descubre la penicilina.
2 De que vamos a Hablar? 1. Las Bacterias Cronología de la vida en el planeta Cuando apareció la resistencia Genética Bacteriana 2. El Antibiograma CIM CBM Técnicas de estudio de sensibilidad Métodos fenotípicos Métodos bioquímicos Métodos genéticos 3. Lectura interpretada del antibiograma Resistencia intrínseca Lectura interpretada para Gram (+) Lectura interpretada para Gram (-)
3 Dr. John Rudge de la Universidad de Cambridge en el año 2010 redujo la antigüedad de la tierra a millones de años. Las bacterias aparecieron hace unos millones de años. Homo sapiens, se originó hace alrededor de años. Anton van Leeuwenhoek en 1683, observó la 1ra bacteria.
4 Las Bacterias Cuando apareció la resistencia a los antibióticos? La capacidad que tienen las bacterias de generar resistencia a los antibióticos se remonta a hace más de años. La resistencia a los antibióticos es una propiedad natural existente en los genes de las bacterias que precede al uso clínico de los antibióticos. El Resistoma: Las bacterias del suelo y las que causan enfermedad en los humanos intercambian rápidamente genes con resistencia a múltiples medicamentos.
5 Era antibiótica Un evento reciente de aproximadamente 100 años La arsfenamina Fue el primer fármaco que curó una enfermedad infecciosa. Comercializado bajo la marca de Salvarsán en 1910 y denominado la bala mágica. Sintetizado por el bacteriólogo alemán Paul Ehrlich.
6 La mayoría de mecanismos de resistencia están mediados por elementos genéticos móviles: integrones, transposones, plásmidos. Estos pueden transportar uno o varios genes de resistencia. Hey chico! Quieres ser una superbacteria? Clávate esto a tu genoma. Ni la Vancomicina te hará daño!!!
7 Genoma bacteriano: conjunto de elementos genéticos autorreplicativos que tiene una bacteria: 1. Cromosoma 2. Plásmidos 3. Genes "saltarines" Cromosoma bacteriano Toda la información genética de la bacteria está contenida en una única molécula de ADN de doble cadena y circular. Plásmidos ADN extracromosómico, también circular y cerrado. Se replican de forma autónoma y no se integran al cromosoma bacteriano.
8 Genética bacteriana Genes "saltarines" de las bacterias Los transposones (Tn): son segmentos de ADN capaces de saltar desde una posición a otra en el genoma. Pueden transponerse desde el cromosoma a un plásmido o viceversa.
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10 QUE ES EL ANTIBIOGRAMA? Es un método fenotípico de estudio microbiológico realizado en el laboratorio. Consiste en enfrentar un inóculo bacteriano estandarizado a una única o a diferentes concentraciones de antibiótico. La interpretación de los resultados obtenidos permite clasificar a los microorganismos en categorías clínicas: sensibles, intermedios o resistentes. Se traduce como factor predictivo de la eficacia clínica.
11 QUE ES EL ANTIBIOGRAMA? (2) Al realizar el antibiograma se pueden obtener : 1. Resultados cualitativos que indican si la bacteria es sensible o resistente a un antibiótico. 2. Cuantitativos que determinan la concentración mínima de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano en µg/ ml o en mg/l (CMI).
12 Es la concentración más baja de un antibiótico capaz de inhibir el crecimiento del 99,9% de una determinada población bacteriana. La CMI es diferente para cada especie bacteriana y cada antimicrobiano. Las concentraciones mínimas inhibitorias pueden ser determinadas mediante métodos de microdilución en caldo o por difusión tiras de Etest.
13 Utilizando un inóculo estandarizado de una bacteria. Se prueba un antibiótico mediante concentraciones decrecientes, generalmente diluciones doble seriadas. Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas. Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento.
14 Luego de la incubación adecuada, se observa la turbidez (desarrollo bacteriano). La CIM corresponde al 1er tubo que no presenta turbidez. CIM Si se hace un traspaso a una placa de Agar, todavía habrá desarrollo bacteriano y por lo tanto están inhibidas y no muertas.
15 CBM: Es la mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a < de 0,1 % de la población bacteriana. Es el primer inóculo que, al traspasarlo demuestra que ya no crecen bacterias. CBM Habitualmente, las cifras de CIM y de CBM son muy cercanas, rara vez más allá del doble.
16 El estudio de la sensibilidad in vitro de las bacterias a los antimicrobianos se realiza mediante: 1. Métodos fenotípicos (antibiograma): Por dilución Por difusión - Método por dilución en caldo - Método por dilución en Agar - Método de Kirby-Bauer (Disco placa) - Método Epsilon test 2. Métodos bioquímicos 3. Métodos genéticos.
17 Las técnicas de dilución proporcionan resultados cuantitativos (concentración mínima inhibitoria) Las de difusión cualitativos (sensible, intermedio, resistente). Ambos métodos son comparables ya que hay una correlación directa entre el diámetro del halo de inhibición y la CMI. Resistente Sensible
18 Son la base de casi todos los métodos utilizados en la actualidad. Este método determina la CMI utilizando un medio de dilución en caldo para las diferentes concentraciones del antimicrobiano.
19 Estos novedosos métodos utilizan sistemas de microdilución en medio líquido sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia) Sistema automatizado Vitek 2
20 En el caso de los sistemas más sencillos, la lectura la realiza el tecnólogo médico o microbiólogo, a través de un visor invertido de espejo.
21 Método fenotípico por difusión Método de Kirby-Bauer Las técnicas de difusión emplean discos de papel impregnados con una solución estandarizada para cada tipo de antibiótico, que se disponen sobre la superficie de un medio sólido previamente sembrado con una suspensión bacteriana. Tras un período de incubación, se observa el diámetro de halos formados alrededor de los discos. El tamaño de los halos esta en relación con el grado de sensibilidad del microorganismo. Al medir los halos puede establecerse una correlación con los valores de CMI. Halos pequeños se relacionan con valores altos de CMI (resistentes) y halos grandes con CMI bajas (sensibles).
22 Es una técnica por difusión, permite la determinación directa del valor de la CMI. Utiliza tiras de plástico impregnadas con un antibiótico en concentraciones decrecientes. Al contacto de la tira con el agar, el antibiótico difunde e impide el crecimiento del microorganismo. Después de la incubación se observa una zona de inhibición en forma de elipse: el valor de la CMI es el punto de intersección de la elipse con la tira y está indicado en la escala impresa sobre la superficie de la tira.
23 Consisten en la determinación del mecanismo bioquímico de resistencia. Detección de b-lactamasa con discos impregnados con una cefalosporina cromogénica que cambia de color cuando se hidroliza. Utilizado. para la detección rápida de la resistencia a ampicilina en Haemophilus spp. Neisseria spp. y Moraxella spp. Técnica de aglutinación con látex Partículas sensibilizadas con anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la PBP2a responsable de la resistencia a cloxacilina en Staphylococcus aureus.
24 Los métodos genéticos detectan genes de resistencia, generalmente mediante técnicas de PCR, como en el caso del gen meca que codifica la producción de la PBP2a.
25 Ya obtenida la CIM o el diámetro de inhibición, se clasifica al microorganismo frente cada antibiotico según puntos de corte como S, I o R Los puntos de corte se establecen basados en propiedades microbiológicas, farmacocinéticas y de eficacia clínica, El factor más importante para definir las categorías es la concentración que alcanza un antibiótico en el plasma.
26 Quien establece los puntos de corte para el antibiograma? La interpretación de los resultados del antibiograma se realiza en función de los valores establecidos por diferentes comités, como: a. Clinical and Laboratory Standards Institute en Estados Unidos (CLSI) b. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing en Europa (EUCAST)
27 La Lectura del Antibiograma, es un proceso que consiste en el reconocimiento de los fenotipos bacterianos y de la interpretación de los resultados obtenidos del antibiograma para guiar al clínico en la elección del mejor tratamiento individual. NO confundir, categorización clínica (Sensible, Intermedio o Resistente) o los valores de CIM, con una lectura interpretada del antibiograma. Su objetivo es evitar el posible fracaso terapéutico
28 De su aplicación se obtienen conclusiones como: Favorece la adecuación del tratamiento. Predicción del éxito terapéutico. Condiciona la modificación de las categorías clínicas y la deducción de los valores de sensibilidad de antimicrobianos no incluidos en el antibiograma Vigilancia y detección de nuevos mecanismos de resistencia. Definición y control de las políticas de antimicrobianos.
29 Sin interpretación del antibiograma Adaptado de: Lectura interpretada del antibiograma y su integración en el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos. Rafael Cantón Moreno, Hospital Ramón y Cajal. Vol. 20. Núm. 04. abril 2002.
30 El resultado terapéutico depende de muchas variables, como enfermedad subyacente, condición clínica del huésped, las propiedades farmacológicas del agente antimicrobiano, el sitio de la infección, etc. Los microbiólogos sólo pueden recomendar agentes terapéuticos sobre la base de sus actividades in vitro. El clínico debe tomar la decisión final, teniendo en cuenta su conocimiento sobre todos los factores pertinentes. Debiendo elegir entonces el agente apropiado : El más activo contra el patógeno. El menos tóxico para el huésped. Con las características farmacológicas apropiadas. Más económico.
31 Un requisito esencial para poder realizar una adecuada lectura interpretada es conocer la identidad del microorganismo, tanto el género como la especie. De esta manera podemos identificcar el fenotipo de sensibilidad correspondiente. Hay bacterias que siempre son resistentes a determinados antibióticos y otras que siempre son sensibles. La desviación de estos patrones indica un fenotipo raro o imposible.
32 QUE SON LOS FENOTIPOS DE SENSIBILIDAD O RESISTENCIA? Patrón de comportamiento de los microorganismos, individualizado por género o especie, frente a cada grupo de antibióticos. Se clasifican en habituales, raros e imposibles. Fenotipos habituales son los aislamientos con mecanismos de resistencia epidemiológicamente normales ( Ej. BLEE). Fenotipo raros: mecanismos de resistencia poco frecuentes ( Ej. KPC ). Fenotipos imposibles: No responden a mecanismos de resistencia conocidos y suelen representar problemas técnicos del ATB.
33 Es aquella que se desarrolla en forma natural en ausencia de mecanismo de presión de selección antimicrobiana (no hay exposición previa a antibióticos). La resistencia intrínseca es por tanto especie o género específica y delinea el espectro de actividad del antibiótico.
34 ALGUNAS RESITENCIAS INTRINSECAS
35 Lectura interpretada del antibiograma Cocos grampositivos
36 Lectura interpretada del antibiograma Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM, MRSA) Adquisición de ADN exógeno codificante de una PBP de baja afinidad por betalactámicos, denominada PBP2a y codificada por el gen meca. Penicilina R Ampicilina R Oxacilina R Cefoxitina R AMC R Resistencia homogénea (alto nivel) o heterogénea. R a todos los betalactámicos. Oxacilina y Cefoxitina se usan como marcadores de meca. Este mismo criterio se aplicará en el caso de STACN.
37 Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM, MRSA)
38 Staphylococcus aureus Sensible V/S resistente a meticilina Penicilina R Ampicilina R Oxacilina S Cefoxitina S Penicilina R Ampicilina R Oxacilina R Cefoxitina R AMC R
39 Antibiotico E. faecalis E. faecium Oxacilina Resistente Resistente TMT/SMX Resistente Resistente Cefalosporinas Resistente Resistente Ertapenem Resistente Resistente Aminoglucósidos De bajo nivel De bajo nivel Quinupristina//dalfopristina Resistente Sensible Clindamicina Resistente Sensible
40 Los enterococos adquieren resistencia de alto niveles de betalactámicos por: Mecanismo E. faecalis E. faecium Frecuencia Producción de Betalactamasa Modificación de la PBP /
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42 modificación de la PBP5
43 Enterococcus spp. resistente a vancomicina Resistencia heterogénea que presenta 6 fenotipos: VanA, VanB, Van D, VanG, VanE y VanL. VanA es el más frecuente. Clúster de genes en transposón Tn 1546, que posee genes codificantes de enzimas modificadoras de la afinidad del péptidoglicano por la vancomicina.
44 Enterococcus spp. resistente a vancomicina Genotipo vana, vanb Genotipo vana Es el único que presenta alto nivel de resistencia a vancomicina y teicoplanina Genotipo VanB Presenta resistencia inducible a vancomicina (CMI mg/l) y sensibilidad a teicoplanina. E. faecium con fenotipo vana, se asocia también a resistencia de alto nivel a aminoglucósidos y betalactámicos. Fenotipo vana Teicoplanina R Vancomicina R
45 Enterococcus spp. resistente a vancomicina Cepa control Fenotipo vana Fenotipo vanb Fenotipo vanc Vancomicina s Teicoplanina s Vancomicina R Teicoplanina R Vancomicina R Teicoplanina S Vancomicina R Teicoplanina R E. faecalis, E. faecium E. faecalis, E. faecium E. gallinarum, E. casseliflavus. Alto nivel de resistencia. Bajo nivel de resistencia
46 Lectura interpretada del antibiograma Bacilos gramnegativos
47 Fenotipos de resistencia cromosómica Intrínseca SHV AmpC Proteus: presenta disminución de la sensibilidad a Imipenem debido a alteración de las porinas.
48 CLASIFICACION DE LAS BETALACTAMASAS Las clasificaciones más utilizadas son las de Ambler y la de Bush- Jacoby-Medeiros. Ambler Cuatro clases de β-lactamasas en función de sus secuencias aminoacídicas (estructura molecular). Bush-Jacoby-Medeiros Separa las β-lactamasas en función de su perfil hidrolítico y la inhibición de su actividad (ácido clavulánico, EDTA, aztreonam). Distingue cuatro categorías y múltiples subgrupos
49 CLASIFICACION DE LAS BETALACTAMASAS Manual de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana, Stephen J. Cavalieri, (et al.)
50 Betalactamasas (clase A / 2be) Sensibilidad disminuida a cefalosporinas de amplio espectro (BLEE). Enzimas de clase A (Ambler) y grupo 2be (Bush, Jacoby y Medeiros). TEM, SHV, CTX-M son las más habituales. 1ª descrita en Alemania (1983) en Klebsiella ozaenae. Los genes que los codifican se encuentran en Plásmidos facilitando su diseminación. Presentan co-resistencia con quinolonas, aminoglucósidos, cotrimoxazol.
51 Betalactamasas (clase A / 2be) Sensibilidad disminuida a cefalosporinas de amplio espectro (BLEE). Son capaces de hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y monobactamas. No afectan las cefamicinas o carbapenems. Son inhibidas por el ácido clavulánico. Se informará todas las cefalosporinas resistentes (excepto cefoxitina) Fármacos de elección: carbapenems (infecciones graves), asociaciones con inhibidores de las betalactamasas, si S. Para ITU: fosfomicina, amoxicilina/ácido clavulánico. AMP AMC TIC PRL P-TZ CZ CXM FOX CAZ CTX FEP AZT IMP MEN R >128 S 8/4 R >128 R >128 R >128 R >128 R >128 S 4 0,12 S (R) 32 I (R) 8 S (R) 4 S (R) S 0,12 S 0,03
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53 Prueba confirmatoria para BLEE La doble difusión con discos: de cefotaxima y ceftazidima de 30 μg y AM/CL a una distancia de 20-30mm. Se ve la sinergia de sensibilidad y si aumentan los halos más de 5mm con AM/CL es BLEE. Positivo BLEE Positivo BLEE negativo
54 Betalactamasas (clase C / 1) Hiperproductor de AmpC. Resistencia a amoxicilina/clavulánico y sensibilidad disminuida a cefalosporinas: Son Serin-Betalactamasa Pertenecen al grupo 1 de la clasificación de Bush. La producción de AmpC puede ser constitutiva o inducible, Los niveles de producción dependen del grado de expresión del gen blaampc. Cuando el gen blaampc se expresa de forma constitutiva puede hacerlo a niveles basales bajos, confiriendo un fenotipo de resistencia salvaje. Hiperexpresión de blaampc por mutaciones en el atenuador y/o promotor de blaampc,
55 Betalactamasas (clase C) Hiperproductor de AmpC. Resistencia a amoxicilina/clavulánico y sensibilidad disminuida a cefalosporinas: AMP AMC CAR TIC PRL P- TZ R >128 R 32/16 R >128 R >128 R >128 I 32/4 CZ CXM FOX CAZ CTX FEP AZT IMP MEN R >128 R >128 R 64 R 32 I S 16 0,5 R 32 S 0,12 S 0,06 R a amino y acilureidopenicilinas, amoxi-clavulánico, R cefas de 1ª, 2ª y 3ra generación, cefoxitina R aztreonam. Sensible a cefepima y carbapenems. Las cefalosporinas de cuarta generación no se ven afectadas. P/TZ suele ser Intermedia ya que la piperacilina se hidroliza menos por el AmpC.
56 Betalactamasas (clase C) Tipos de AmpC 1. AmpC cromosómicas Enterobacter spp C. freundii, Serratia spp Providencia spp Morganella spp. 2. AmpC plasmídicas : E. Coli Klebsiella spp.
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58 Hiperproductor de AmpC. Tratamiento Desde punto de vista clínico la alternativa más razonable es usar Cefepima. En caso de infecciones grave, podría considerarse el uso de carbapenémicos. En el caso de sensibilidad a Cefalosporinas de 3ra G, se aconseja informar la posibilidad de que se produzca un fracaso terapéutico, por la selección de mutantes AmpC desreprimidos estables, particularmente con Enterobacter spp. y C. freundii. Piperacilina/Tazobactam variable, se informará según CMI.
59 AM P AM C TIC PR L P- TZ CZ CX M FOX CAZ CTX FEP AZ T IMP MEN R S R I S I/R S S S S S S S S TEM- 1 R R R R R R I S S S s S S S TEM- 1 Hiper R R R R R S S S S S S S S S IRT R I R R I S S S S S S(R) S S S OXA-1 R R R R I R R R R I (R) S R S S AmpC Hiper R S R R S R R S S (R) I (R) S(R) S( R) S S BLEE
60 Las bacterias presentan múltiples mecanismos de resistencia, los cuales recién estamos comenzando a conocer y entender. Muchas de estas resistencias están presentes en los genes de las bacterias desde antes de la era antibiótica. No debe validarse el resultado de un antibiograma, sin realizar previamente una lectura interpretada de este. Actualmente existen métodos automatizados, que no reemplazan al tecnólogo o microbiólogo que realiza el la lectura interpretada del ATB. Para interpretar correctamente el Antibiograma, debemos conocer los fenotipos y las resistencias naturales de las bacterias.
61 BIBLIOGRAFÍA Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;. M100-S19. Wayne, PA: CLSI; European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST): Expert rules in antimicrobial susceptibility testing, Disponible en: Cantón R. Lectura interpretada del antibiograma: ejercicio intelectual o necesidad clínica? Enferm Infecc Microbiol Clin. 2002;20: ATLAS DEL ANTIBIOGRAMA, Juan Ignacio Alós, Rafael Cantón, Luis Martínez, Jordi Vila. Biomérieux. GUÍA TERAPÉUTICA ANTIMICROBIANA, J. Mensa, J. m. Gatell, J. E. García, E. Letang. E López, F. Marco. Editorial Antares Barcelona Manual de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana, Stephen J. Cavalieri, (et al.) LECTURA INTERPRETADA DEL ANTIBIOGRAMA, capitulo 4, Carmen torres. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica 2002:20(7):
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