MÉTODOS DE DIFUSIÓN Y MÉTODOS DE DILUCIÓN CÁLCULO DE CIM Y CBM

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1 2017

2 TRABAJO PRACTICO N 4: ANTIMICROBIANOS MÉTODOS DE DIFUSIÓN Y MÉTODOS DE DILUCIÓN CÁLCULO DE CIM Y CBM Objetivos - Que el estudiante conozca las distintas técnicas de difusión y dilución que permiten establecer el perfil de sensibilidad antimicrobiana de los - Que el estudiante pueda calcular e interpretar la CIM y CBM En la actualidad la utilización indiscriminada de antibióticos ha producido un aumento en la resistencia de las bacterias. Es importante que el médico suministre el antibiótico cuando es necesario y el correspondiente para eliminar al microorganismo. Para esto se utilizan pruebas para conocer que antibiótico es efectivo para el microorganismo causal el cual se manifestará SENSIBLE.

3 Materiales: Cultivo Puro de un microorganismo Placa con medio de Müeller-Hinton Pinzas metálicas Discos de antibióticos Fig. N 1: foto extraída pág. sites.google.com Fig. N 2: Antibiograma es donde se observan las zonas de inhibición del desarrollo de la bacteria por parte del antibiótico probado. ttomada de la página: Figura N 3: Medición de los halos de inhibición. Tomado de Existen dos tipos de pruebas que miden este aspecto, uno es la técnica de difusión en agar en donde se prueban diferentes antibióticos que están impregnados en discos de papel y se miden los halos de inhibición del desarrollo bacteriano, (fig 2 y 3), y la otra técnica es determinar para conocer la concentración inhibitoria mínima = CIM ó sea cual es la menor concentración del

4 antibiótico capaz de inhibir el desarrollo bacteriano y la concentración bactericida mínima = CBM que es la menor concentración que elimina el % de los microorganismos Fig 4. Realiación de CIM y CBM. Cultivo puro - 24 Hs. Seleccionar 4-5 colonias D) Determinación de la CIM y la CBM Suspensión 0,5 MF en SF estéril. Se coloca la misma cantidad de microorganismo Tubos con diferentes concentraciones de antibiótico CIM Incubación:35-37ºC24 Hs. Atm Normal CBM IMPORTANTE!!!! Para el tratamiento de las infecciones sistémicas la dosis del antibiótico en suero debe ser 3 a 5 veces el valor de la CIM Otra metodología para poder establecer el valor CIM para el microorganismo causal de un foco infeccioso es E-Test o épsilon test el procedimiento consiste en inocular hisopando la suspensión 0,5 MacFarland de la bacteria en 3 direcciones sobre un medio para antibiograma (Müller Hinton) sobre el mismo se aplicará una tira de papel que contiene un gradiente de concentración del antibiótico, se dejará incubar a por 24 hs para posteriormente observar la formación de una elipse de inhibición de crecimiento que corta por su extremo a la tira en una determinada concentración que es el valor CIM

5 Fig 5. Valor de corte del Mic. Tomado de : LO QUE DEBEMOS INTERPRETAR CON VALORES CIM Y CBM MENOR O IGUAL A 2 BACTERICIDA CBM/CIM MAYOR A 2 BACTERIOSTÁTICO ANTIFÚNGICOS: Son los fármacos utilizados específicamente para tratamiento de infecciones por hongos y levaduras (Fig 6), la terapéutica con los mismos ha sufrido una modificación en las últimas décadas, dejándose de lado a los que pueden presentar mayor toxicidad o dificultades en su uso. Además se fueron presentando resistencias. Puede solicitar un mycograma de manera in vitro para estudio de las sensibilidades Su clasificación puede ser en base al espectro, potencia, modo de acción. Algunos antimicóticos son sistémicos o locales, su administración puede ser oral, tópica o parenteral

6 Fig 6. Sitio de acción de los antifúngicos. Tomado de Por lo que resulta importante tener un conocimiento de las distintas sensibilidades a los diferentes antimicóticos para optimizar el tratamiento antifúngico, para lo cual se pueden realizar 2 metodologías : - DILUCIÓN EN CALDO - DIFUSIÓN EN AGAR DILUCIÓN EN CALDO: Se coloca en tubos con un medio de cultivo adecuado ( caldo) para crecimiento de microorganismo (hongo o levadura) se evalúa en diluciones decrecientes del antimicótico a ensayar. Así se establecerá la CIM ( concentración inhibitoria mínima) Se puede, también, evaluar en una microescala, es decir haciendo diluciones del antimicótico en pocillos. DIFUSIÓN EN AGAR: Se inocula en un medio de cultivo sólido agar adecuado para el crecimiento de hongos o levaduras y se depositan discos de papel impregnados del antifúngico a ensayar con una concentración conocida. Después de incubar se observará una zona de inhibición del crecimiento (halo) el tamaño del cual nos determinará si el hongo es sensible, intermedio o resistente para ese antimicótico El CLSI estandarizó el método de difusión en disco

7 La adición de azúcar al medio Müeller Hinton (para evaluación de sensibilidad) favorece el crecimiento de las levaduras y aumenta la definición de los halos de inhibición. Fig 7. Fig 7. Colocación de los discos en la placa de Müller Hinton. TIPOS DE ANTIMICÓTICOS Clasificación de los antifúngicos por su estructura: Polienos Azoles Alilaminas Lipopéptidos Pirimidinas fluoradas Otros Nistatina, natamicina, amfotericina B Imidazol: micomazol, clotrimazol Triazoles: fluconazol, itraconazol, ketoconazol Triazoles de segunda generación: voriconazol, ravuconazol, posaconazol Terbinafina, naftifina Papulacandinas Triterpenos glicosilados Equinocandinas: caspofungina, anidulofungina, micafungina Flucitosina Yoduro de potasio, ciclopirox, tolnaftato, griseofulvin Tanto para los antibióticos como para los antimicóticos los resultados de las lecturas de halos de inhibición las se evalúan extrapolándolos en unas tablas estandarizadas por CLSI donde se interpretan valores cortes por debajo de los cuales los microorganismos son RESISTENTES, rango de sensibilidad intermedia y valores cortes por encima de los cuales se los cataloga de SENSIBLES.

8 Además, se pueden colocar los discos siguiendo determinadas estrategias de ubicación para poner de manifiesto las resistencias (efecto de sinergia, achatamientos, manifestación de mecanismos de inducción). En caso de necesitarse se puede complementar con el valor CIM.