DEMOSTRACIÓN IN VITRO DE LA CAPACIDAD MICROBICIDA DEL DESINFECTANTE CLORINA F MEDIANTE TÉCNICAS DE CONTACTO Y DE DIFUSIÓN EN DISCO

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1 DEMOSTRACIÓN IN VITRO DE LA CAPACIDAD MICROBICIDA DEL DESINFECTANTE CLORINA F MEDIANTE TÉCNICAS DE CONTACTO Y DE DIFUSIÓN EN DISCO SARÚ, Silvana GOTTERO, Susana. Universidad Tecnológica Nacional, Facultad Regional Villa María. Laboratorio de Química y Microbiología. F.R.V.M-UTN. Avenida Universidad 450 (5900) Villa María. Córdoba. Argentina. Telefax: int s: lab_quimica@frvm.utn.edu.ar - silvanasaru@hotmail.com Resumen El producto Clorina F es un desinfectante de origen nacional, de naturaleza orgánica, elaborado a partir de monocloramina que posee amplia aplicación en la industria de la alimentación, potabilización, desinfección de hospitales, medicina veterinaria, industria de bebidas carbonatadas, hotelería, restaurantes, etc. Químicamente es un polvo cristalino blanco de alta concentración de paratoluensulfoncloramina de sodio sinergizado. Posee acción antiséptica y germicida, cuyo efecto se produce en dos fases: la primera es su intrusión en el microorganismo y la segunda su destrucción. En la primera fase el cloro presente se combina con el sodio formando cloruro de sodio, provocando una reacción en la periferia del microorganismo y acelerando su intrusión en el protoplasma del mismo. La segunda fase se basa en la capacidad del grupo amino que permite la liberación de oxígeno promoviendo la acción microbicida (destruye el microorganismo por oxidación). Esta combinación permite una acción desinfectante más regular, prolongada e intensiva que los clorados comunes. Se evaluó la acción microbicida utilizando cepas tipificadas de bacterias pertenecientes al Cepario del Laboratorio de Microbiología de la Universidad Tecnológica Nacional Facultad Regional Villa María y cepas de hongos clasificadas por la cátedra de Micología de la Universidad Nacional de Río Cuarto. Las bacterias ensayadas corresponden a la familia (Escherichia coli, Salmonella spp., Kelbsiella oxytoca, Shigella sonnei, Serratia marcescens), a la familia Pseudomonaceae (Pseudomonas aeruginosa), a la Micrococcaceae ( Staphylococcus aureus) y a la familia Bacillaceae (Bacillus cereus, Bacillus subtilis). Las cepas de hongos ensayadas corresponden a las especies Cladosporium spp., Geotrichum spp. y Alternaria alternata. La técnica utilizada consiste en poner en contacto durante un tiempo controlado la suspensión de la cepa a ensayar con soluciones de Clorina F en concentraciones determinadas por el fabricante para ejercer su poder desinfectante. Además, se evaluó, usando la Técnica de Difusión en Disco, la capacidad bactericida del desinfectante con la finalidad de observar la sensibilidad de ésta con relación a la anterior. Estos ensayos de sensibilidad antimicrobiana consisten en colocar discos de papel de filtro de 5 mm de diámetro impregnados en solución de Clorina F en placas de Agar Nutritivo previamente sembradas con la cepa a ensayar. Se mide el tamaño de los halos de inhibición después de 24 horas de incubación a 37 C. Se demostró en condiciones controladas de laboratorio la sensibilidad entre las técnicas de contacto y de difusión en disco para la determinación del poder desinfectante del producto Clorina F. Características y propiedades del desinfectante Clorina F 1 Aspecto físico: Es un polvo cristalino blanco con el 80% de pureza. Acción Química: Químicamente es un paratoluensulfocloramina de sodio sinergizado. Acción Bromatológica: Es aplicable en la reducción de la Demanda Biológica de Oxígeno (DBO) y de la Demanda Química de Oxígeno (DQO) en aguas servidas, dado que la liberación de oxígeno baja la carga microbiana permitiendo controlar industrialmente el gravísimo problema del tratamiento de efluentes. Propiedades y Beneficios: Es un germicida no selectivo que posee una rápida y prolongada acción. Es rápidamente soluble en agua, no genera resistencia bacteriana y no presenta toxicidad a las dosis recomendadas. Su aplicación no tiene limitaciones en la naturaleza del material a desinfectar.

2 Dosis recomendadas de Clorina F en polvo 1 Área hospitalaria: Aplicaciones generales: 2 gramos por litro de agua. Quirófano, Servicios Especializados y Material Contaminado: 5 gramos por litro de agua. Ambiental: 2 gramos por litro de agua promueven una desinfección rápida y total. Una concentración de 5 gramos por litro reafirma la acción en lugares de alta contaminación. Potabilización y/o desinfección de aguas: 20 gramos de Clorina F cada 500 litros de agua. Objetivos Observar la eficiencia del producto Clorina F en soluciones con dosis recomendadas por el fabricante para desinfectar superficies sucias. Demostrar la capacidad microbicida del desinfectante Clorina F en soluciones con dosis recomendadas, mediante Técnicas de Contacto y de Difusión en Disco, utilizando cepas bacterianas y cepas de hongos tipificadas. Comparar la sensibilidad de la Técnica de Contacto en tubos con relación a la Técnica de Difusión en Disco. Materiales y Métodos Las cepas bacterianas utilizadas pertenecen al cepario del Laboratorio de Microbiología de la Universidad Tecnológica Nacional Facultad Regional Villa María. 1. Familia : Escherichia coli, Salmonella spp, Klebsiella oxytoca, Shigella sonnei, Serratia marcescens. 2. Familia Pseudomonaceae: Pseudomonas aeruginosa. 3. Familia Micrococcaceae: Staphylococcus aureus. 4. Familia Bacillaceae: Bacillus cereus, Bacillus subtilis. Las cepas de hongos fueron clasificadas como Alternaria alternata y Cladosporium spp. por la cátedra de Micología de la Universidad Nacional de Río Cuarto. La cepa de Geotrichum spp. fue clasificada en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Tecnológica Nacional Facultad Regional Villa María. Para el cultivo de los microorganismos ensayados se utilizaron Caldo Tripteína Soja (TSA) (Biokar) y Agar Nutritivo (Biokar) preparado de acuerdo a las indicaciones del fabricante y esterilizados a una atmósfera de presión durante 20 minutos. a) Determinación de la Contaminación de Superficies Sucias 4 Se humedece la superficie correspondiente con hisopos estériles embebidos en agua peptonada al 0,1% Se agita el hisopo en 10 ml de Agua peptonada al 0,1%. (Directo) Se siembra 1 ml del directo y 1ml de una dilución 10-1 en Placas con Agar Nutritivo (por duplicado). Se realiza una pulverización en la superficie a analizar con una solución de Clorina F de 2g/l. Se deja actuar el desinfectante durante 20 minutos. Se toma una segunda muestra de la superficie desinfectada con un hisopo embebido en agua peptonada al 0,1%. Se agita el hisopo en 10 ml de Agua peptonada al 0,1%. (Directo) Se siembra 1 ml del directo y 1ml de una dilución 10-1 en Placas con Agar Nutritivo (por duplicado). Se incuban las placas en estufa de cultivo a 37 C durante 24 horas. Interpretación de resultados: Los resultados se expresan en unidades formadoras de colonias (ufc) por cm 2 de superficie.

3 b) Técnica de Contacto 2,3 : Consiste en poner en contacto durante un tiempo controlado la suspensión de la cepa a ensayar en soluciones de Clorina F en concentraciones de acuerdo a las dosis recomendadas por el fabricante 1. Se realiza una suspensión de la cepa a ensayar en 5 ml de Caldo TSA con una turbidez comparable al patrón 1 de la escala de Mc Farland (300x10-5 microorganismos por ml). Se siembra 0,1 ml de la suspensión anterior en 5ml de una solución de Clorina F a concentraciones de 2 gramos por litro y 5 gramos por litro respectivamente. Se agregan dos gotas de tíosulfato de sodio al 0,1% para inactivar el Cloro. Se deja actuar el producto Clorina F durante 2 y 5 minutos respectivamente. Se siembra 0,1 ml de solución en 5 ml de Caldo TSA. Los tubos se incuban a 37 C durante 24 horas. Interpretación de resultados: Positivo: Se observa turbidez en el Caldo TSA después de la incubación por el desarrollo microbiano. Esto significa que el desinfectante Clorina F no pudo ejercer su poder microbicida. Negativo: Se observa ausencia de turbidez en el Caldo TSA después de la incubación. Esto significa que el producto Clorina F fue efectivo en su acción microbicida. c) Técnica de difusión en disco 2, 6 Se realiza una suspensión en caldo TSA de la cepa a ensayar con una turbidez comparable al patrón 0,5 de la escala de Mc Farland (150 x 10-6 microorganismos /ml). Se siembra en superficie 0,1 ml de la suspensión anterior en placas con 20 ml de Agar Nutritivo. Se empapan discos de papel de filtro de 5 mm de diámetro en una solución de Clorina F durante 5 minutos y se colocan en la placa (tres discos por placa). Se incuban las placas en estufa de cultivo a 37ºC durante 24 horas. Interpretación de resultados: En caso de existir inhibición del crecimiento se observa un halo de inhibición alrededor del disco. Este se mide desde el extremo del disco hasta el final del halo de inhibición, se multiplica por dos y se suma el diámetro del disco. Resultados y Discusión Los resultados obtenidos por el método de Determinación de la Contaminación de Superficies Sucias se presentan en la Tabla 1. Cabe destacar que estas superficies no fueron limpiadas antes de la desinfección, por lo que estos resultados remarcan la necesidad de la limpieza previa para lograr una mayor eficiencia del producto Clorina F como desinfectante. Tabla 1. Determinación de la eficiencia de la desinfección con Clorina F Superficie 1 ( mesada del laboratorio) 2565 cm 2 Superficie 2 (baldosa del piso del laboratorio) 900 cm 2 Antes de la desinfección con Clorina F Después de la desinfección con Clorina F Eficiencia de la desinfección 328 ufc/ cm ufc/ cm ufc/ cm ufc/ cm 2 47,56% 54,63%

4 Después de la aplicación de la Técnica de Contacto a cepas bacterianas se obtuvieron los resultados expuestos en la tabla 2. Tabla 2. Determinación de la sensibilidad de las cepas bacterianas al desinfectante Clorina F mediante la Técnica de Contacto Cepa Familia Concentración de Clorina F Escherichia coli Klebsiella oxytoca Salmonella spp. Serratia marcescens Shigella sonnei Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Bacillus cereus Bacillus subtilis Pseudomonaceae Micrococcaceae Bacillaceae Bacillaceae Tiempo de Resultado Contacto De acuerdo con los resultados obtenidos la cepa más sensible perteneciente a la familia fue Serratia marcescens, ya que fue inhibida con soluciones de Clorina F de 2 gramos por litro y 5 gramos por litro durante 2 y 5 minutos de contacto. La cepa más resistente fue Salmonella spp. que sólo fue inhibida por la solución de Clorina F al 5% en 5

5 minutos de contacto. Staphylococcus aureus mostró igual sensibilidad al desinfectante que Escherichia coli y Klebsiella oxytoca, sólo desarrolló después del contacto con la solución de Clorina F al 2% durante 2 minutos. Pseudomonas aeruginosa sólo fue resistente al producto Clorina F en una concentración de 2 g/l. Mientras que, las especies esporuladas Bacillus cereus y Bacillus subtilis, fueron resistentes al desinfectante en ambas concentraciones y tiempos ensayadas. Los resultados obtenidos mediante la aplicación de la Técnica de Contacto concuerdan con los 3, 4,5 obtenidos por otros autores en nuestro país. Tabla N 3. Determinación de la sensibilidad de las cepas de Hongos al desinfectante Clorina F mediante la técnica de contacto Cepa Geotrichum spp. Alternaria alternata Cladosporium spp. Concentración de Clorina F Tiempo de Contacto Resultado 10 minutos - 10 minutos - Nº de ensayos minutos minutos Nº de ensayos minutos Se observó que Alternaria alternata fue inhibida por el producto Clorina F a una concentración de 5 gramos por litro después de 10 minutos de contacto, mientras que el crecimiento de Cladosporium spp. no fue afectado por el desinfectante a una concentración de 5g/l en 10 minutos de contacto. En este último se observó, que en las tres experiencias realizadas, la nohomogeneidad de la suspensión a probar, podría ser una de las causas de la ausencia de desarrollo obtenida en tiempos y concentraciones menores del desinfectante, descartándose un efecto inhibitorio del mismo. De los hongos ensayados, Geotrichum spp. mostró mayor sensibilidad al desinfectante Clorina F. Los resultados obtenidos usando la técnica de Difusión en Disco se observan en la tabla 4. Sólo se probó con bacterias y los halos de inhibición no fueron superiores a 16 mm de diámetro en las cuatro concentraciones de Clorina F probadas (2, 5, 10 y 20 gramos/litro). Tabla 4. Determinación de la sensibilidad de las cepas bacterianas al desinfectante Clorina F mediante la Técnica de Difusión en Disco Concentración de Clorina F en el Disco Cepa 2 g/l 5 g/l 10 g/l 20 g/l Escherichia coli Bacillus cereus Klebsiella oxytoca Shigella sonnei Halo de inhibición en mm.

6 La cepa más resistente fue Bacillus cereus, la cual también resultó resistente utilizando la Técnica de Contacto en los tiempos y concentraciones ensayados. Por otra parte, se observa en la Tabla 4, que el halo de inhibición de Shigella sonnei es mayor que el que presentan Escherichia coli y Klebsiella oxytoca, coincidiendo una vez más con los resultados obtenidos mediante la Técnica de Contacto, en la que se observó una mayor resistencia de Shigella sonnei con respecto a Escherichia coli y Klebsiella oxytoca a una concentración del desinfectante de 2 gramos por litro. En cuanto a los halos de inhibición, se observó, que una vez encontrada la concentración inhibitoria mínima para dos de las cuatro cepas ensayadas, un aumento en la concentración de la solución de Clorina F no modificó dichos halos. Conclusiones 1. Se demostró la eficacia del producto Clorina F para desinfectar superficies sucias. En las dos superficies ensayadas, utilizando dosis recomendadas y con un tiempo de contacto de 20 minutos se obtuvo un importante porcentaje de reducción de la carga microbiana inicial (47,56% y 54,63% respectivamente). 2. Con respecto a la aplicación de la Técnica de Contacto, las bacterias más sensibles fueron de la familia, mientras que las más resistentes fueron géneros esporulados de la familia Bacillaceae, que no desarrollaron después de 10 minutos de contacto con una dosis de desinfectante de 5 gramos por litro. En cuanto a la aplicación de la Técnica de Contacto a cepas de hongos, los resultados obtenidos, indican una resistencia al producto Clorina F superior a la observada en bacterias, pero debido a la dificultad de obtener suspensiones homogéneas, los ensayos dieron falsos negativos en las dosis inferiores y en los tiempos de contacto menores. 3. La Técnica de Difusión en Disco fue menos efectiva que la Técnica de Contacto para detectar cepas sensibles al producto Clorina F, esto se debió a que los halos de inhibición fueron pequeños en las cepas ensayadas (entre 14 mm y 16 mm). Sin embargo, la aplicación de la Técnica de Difusión en Disco permitió confirmar los resultados obtenidos, ya que, en correspondencia con la Técnica de Contacto, las cepas de esporulados no mostraron halos de inhibición a una concentración del producto Clorina F de 10 gramos por litro y además, en ambas técnicas, se observó una resistencia mayor al producto Clorina F en la cepa ensayada de Shigella sonnei con respecto a Escherichia coli y Klebsiella oxytoca. De esta manera, se pudo demostrar la sensibilidad y correlación entre ambas técnicas de laboratorio. Referencias 1. Cibsa. Catálogo de especificaciones del producto Clorina F 2. Collins. M. Métodos Microbiológicos. Editorial Acribia. Zaragoza. España Estudios de la capacidad bactericida, fungicida y acción potabilizante del producto Clorina F realizados en Universidad Nacional de Buenos Aires (Facultad de Farmacia y Bioquímica). Enero Estudios de la capacidad bactericida, fungicida y acción potabilizante del producto Clorina F realizados en Laboratorio de Bacteriología del Hospital Muñiz Estudios de la capacidad bactericida, fungicida y acción potabilizante del producto Clorina F realizados en la Universidad Nacional de Cuyo. Marzo Koneman. Diagnóstico Microbiológico. 3 era edición. Editorial Panamericana