Cultivos Celulares. Docente a cargo: Laura ALCHÉ. CEBI_E3_4 : Aplicaciones industriales de los cultivos celulares

Transcripción

1 CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Articulación CEBI_E3 Cultivos Celulares Docente a cargo: Laura ALCHÉ CEBI_E3_4 : Aplicaciones industriales de los cultivos celulares

2 ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD 1.- Viabilidad: alteración de permeabilidad de membrana y/o perturbación de las vía metabólicas se correlacionan con la proliferación o supervivencia. 2.- Supervivencia: la retención de la capacidad de división. 3.- Metabolismo: basados en la microtitulación, miden respuesta metabólica (enzimas, RNA, DNA). 4.- Transformación: sobrevida, en un estado alterado. 5.- Irritabilidad: una respuesta análoga a la inflamación, alergia, irritación in vivo, difícil de cuantificar in vitro (citoquinas en cultivos organotípicos).

3 ENSAYOS DE VIABILIDAD - Dependen de la integridad de la membrana, medida por la captación de un colorante para el cual la célula es normalmente impermeable (azul tripán, eritrocina). - Dependen de la liberación de un colorante liberación de un colorante, que normalmente es captado y retenido por células viables (rojo neutro, diacetil-fluoresceína).

4 ENSAYOS DE MICROTITULACIÓN

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6 ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN - Son útiles para determinar el efecto de compuestos sobre la proliferación celular, con una curva de crecimiento completa. - Para tomar una muestra pequeña, el tiempo debe ser elegido dentro de la fase log, preferentemente en la mitad, de las células control.

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8 APLICACIONES INDUSTRIALES DE LOS CULTIVOS CELULARES

9 ESCALADO EN SUSPENSIÓN

10 ESCALADO EN SUSPENSIÓN EN CULTIVO CONTINUO

11 PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN Anclaje dependiente Cell factories (600 cm cm 2 ). 2 x 10 5 cels/cm 2 Vial extraído del banco de trabajo, 1-5 x 10 5 cells/ml Frasco tipo T (25 cm cm 2 ) cels/cm 2 Microcarriers (3-15 gr/ml). 2 Botellas roller (850 cm x cels/cm 2 cm 2 ). 2 x 10 5 cels/cm 2 Escalado en rollers ( cm 2 por lote). 2 x 10 5 cels/cm 2 Fibra hueca ( cm 2 por lote). 3 x 10 5 cels/cm 2 Cell cube ( cm 2 por lote). 2 x 10 5 cels/cm 2

12 ESCALADO EN SUSPENSIÓN EN CULTIVO CONTINUO: FIBRA HUECA

13 PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN Fibra hueca Batería de fibras hueca y porosa en su interior, colocadas en paralelo. Las células se concentran y aumenta la densidad celular, en los intersticios de las fibras huecas. El medio de cultivo fluye en contrasentido desde el exterior del reactor o a través de una carcasa.

14 PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN Fibra hueca Ventajas: Se puede llegar a muy altas densidades. El producto se separa de las células. Desventajas: Limitaciones de transferencia de oxígeno y nutrientes, poco control del ambiente.

15 ESCALADO EN MONOCAPA

16 PLATAFORMAS DE PRODUCCION Cell cube system Consiste en: Un oxigenador. Una bomba de circulación. Una bomba de flujo de medio Módulos (1 a 4) con una superficie de cm2 cada uno. Controlador Electrodos de O 2, electrodos de ph, sensores de O 2, sistemas de flujo de gases.

17 PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN Microcarries Permiten: Alta área de superficie de cultivo por unidad de volumen (30 cm 2 por ml con 4 mg de microcarriers). Cultivar células en sistema compacto, importante cuando se trabaja con patógenos (fiebre amarilla, rabia, etc). Tiene todas las ventajas de un sistema en suspensión. 1 Lt de microcarriers puede equivaler a 50 rollers. Disminución de mano de obra. Es usualmente utilizado para producción de virus (herpes, polio, rabia, influenza, FMD, etc). Se pueden controlar los parámetros del cultivo simplemente sacando una muestra (observación microscópica, mediciones de ph, 0 2, etc).

18 PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN Microcarries SE USAN EN UNA CONCENTRACIÓN DE mg/ml FINAL. SE PUEDE ALCANZAR UNA DENSIDAD CELULAR DE 5-10 x 10 6 CELLS/cm 2 1 mg de microcarries = 6 cm 2, un reactor de 1000 Lts puede tener una superficie de alrededor de 2 millones cm 2 de superficie. Pueden usarse en frascos spinner o frascos con agitación, en botellas rollers. Desventajas: Difícil escalado En algunos casos las células no se pegan bien a los carriers. Hay que probar diferentes superficies y optimizar. Daño causado por remolinos microscópicos Son más sensibles que los cultivos en suspensión.

19 PLATAFORMAS DE PRODUCCIÓN Microcarries Requerimientos: Superficie adecuada para el pegado de las células. La densidad de microcarriers debe ser mayor que la del medio de cultivo. Propiedades ópticas adecuadas para poder observarlas al microscopio. No tóxicos No rígidos.

20 COMPARACIÓN DE DIFERENTES METODOS DE CULTIVO Botellas roller área de superficie 490 cm 2 / botella Microcarriers Fibra hueca área de superficie densidad normal Superficie área/l Equivalente en botellas roller Tamaño Superficie área fibra hueca Equivalente en botellas roller 6000 cm 2 / g peso seco 5 g/l cm 2 60 roller 40 x 40 x 4,5 cm cm 2 19 roller

21 SCALING UP Anclaje dependiente, comparación de superficies Area de crec (cm2) maximo volumen (ml) N cells/cm2 N cells tot Volumen de trabajo (ml) Volumen/ superficie Frascos T ,50E+06 22,5 0,30 Frascos T ,25E+07 67,5 0,30 Rollers ,70E ,21 Cellstacks a 40 pisos ,27E ,39 CellCubes ,70E ,10 Microcarriers ,00E ,50 Fibra hueca ,50E ,002

22 MEDIOS DE CULTIVO Libres de suero Por qué eliminar el suero animal? (+) Simplifica formulación del medio de cultivo (+) Inhibidores de proteasas presentes en el suero (+) Protección contra daño mecánico. (-) Incremento de la carga proteica (-) Composición no definida/ variable/ estandarización (-) Riesgo de contaminación (-) Disponibilidad/ Costo

23 MEDIOS DE CULTIVO Libres de suero (+) Facilidad de purificación (+) Composición definida (+) Aspectos regulatorios y de seguridad (-) Crecimiento celular (-) Formulación del medio de cultivo caso a caso (-) Estabilidad del producto de interés (-) Disponibilidad/ Costo

24 MEDIOS DE CULTIVO Libres de suero Suplementos utilizados para sustituir las funciones esenciales del suero: Hidrolizados proteicos, BSA, extractos: Composición química no definida, origen y fuente poco claro, componente de origen animal Compuestos utilizados en la formulación de medios libres de suero: Insulina, Transferrina, Selenio, Etanolamina, lípidos.

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27 CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES EN PROCESOS DE PRODUCCIÓN - Procesos en los cuales el objetivo es la producción de una sustancia, generalmente una molécula bioactiva y también virus, y en los cuales las células cumplen la función de medio de producción; - Procesos en los cuales el objetivo es la producción de las propias células, generalmente organizadas en tejidos u órganos (desarrollo de la ingeniería de tejidos y cultivo de stem cells).

28 CÉLULAS DE MAMÍFERO Conceptos básicos Por qué células eucariotas superiores? Modificaciones post- traduccionales: glicosilación, metilación, carboxilación, fosforilación, enlaces disulfuro. Estructura 3D compleja Secreción al medio de cultivo.

29 CÉLULAS DE MAMÍFERO Conceptos básicos Principales Ventajas: - Con respecto al cultivo de células primarias y modelos animales: REPRODUCIBILIDAD. - Con respecto a sistemas microbianos: Genéticamente capaces de secretar proteínas correctamente ensambladas y con las modificaciones post-traduccionales correctas, por ej. fidelidad en los patrones de glicosilación: secreción, degradación y actividad biológica.

30 CÉLULAS DE MAMÍFERO Conceptos básicos Las más usadas por la industria: - CHO K1: Aisladas de un ovario de hamster, células epiteliales que se pueden adaptar a crecimiento en suspensión. Proteínas recombinantes - BHK-21: Células de hamster bebé, fibroblastos que pueden ser adaptadas a crecer en suspensión. Utilizada comúnmente para propagación de virus. - VERO: Aisladas de riñón de mono africano, fibroblastos. Para propagación de virus y producción de vacunas. - NSO: Células de mieloma de ratón utilizadas para la producción de anticuerpos monoclonales.

31 CÉLULAS DE MAMÍFERO Conceptos básicos Células en suspensión vs Células anclaje dependiente Suspensión Anclaje dependiente Facilidad de escalado Fácil Difícil Necesidad de adaptar No Sí Características de la original Poca mayor Optimización de reactor y medio de cultivo Sí Sí, más crítico

32 PRODUCTOS DE CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES 1.- Anticuerpos monoclonales 2.- Fármacos naturales 3.- Fármacos recombinantes 4.- Hormonas 5.- Vacunas virales

33 CÉLULAS DE MAMÍFERO Conceptos básicos Productos que se obtienen: Anticuerpos monoclonales: anti TNF, anti cáncer, etc. Proteinas recombinantes: insulina, EPO, interferón beta, G-CSF, interferón alfa, hormona de crecimiento humana, etc. Vacunas tradicionales: Aftosa, diarrea viral bovina, rabia, etc. Vacunas de nueva generación: Vivas delecionadas, recombinantes, A DNA. Ejemplos: vacuna ADN contra salmones, Vacuna recombinante contra E2 del virus de la fiebre porcina, Vacuna ADN terapéutica cáncer canino.

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36 PRODUCTOS RECOMBINANTES COMO TERAPÉUTICOS HUMANOS CUIDADOS 1.- Que no desencadenen respuesta inmune; 2.- Seleccionar el tipo de célula en el cual se va a expresar el gen; 3.- Monitorear cuáles son las modificaciones posttranscripcionales y/o post-traduccionales que pueden condicionar su actividad biológica o su antigenicidad.

37 PRINCIPALES APLICACIONES DEL USO DE CULTIVOS CELULARES EN VIROLOGÍA Producción de virus Obtención de stocks de virus para purificación de partículas virales o subcomponentes: Producción de vacunas Virus vivo Virus inactivado Virus recombinante Subunidades Producción de antígenos virales para diagnóstico Producción de vectores virales Producción de virus entomopatógenos para el control de plagas agrícolas

38 Cuando el objetivo es la producción de las propias células

39 CULTIVO DE CÉLULAS TRONCALES HEMATOPOYÉTICAS O STEM CELLS

40 STEM CELLS DE EMBRIÓN: las de ratón han sido usadas in extenso para estudiar diferenciación, porque desarrollan una variedad de diferentes tipos celulares (músculo, hueso, nervios). STEM CELLS MULTIPOTENCIALES DE ADULTO: se aíslan de médula ósea, hígado, cerebro, músculo y cordón umbilical.

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