CLONAR-CLONADO-CLONACIÓN

Transcripción

1 CLONAR-CLONADO-CLONACIÓN Se refiere a los procesos (conjunto de métodos) empleados para crear copias idénticas de fragmentos de ADN, copias idénticas de células o copias idénticas de organismos Se pueden clonar organismos células moléculas de ADN CLONADO MOLECULAR: conjunto de métodos que permiten identificar y purificar un fragmento de ADN particular a partir de una mezcla compleja de ADN, y luego reproducirlo en grandes cantidades. PARA QUÉ CLONAR ADN? Aislar y determinar la secuencia de nucleótidos de un gen específico Identificar y analizar las secuencias reguladoras que controlan la expresión (promotor) de un gen Investigar la función de proteína/enzima/rna Identificar mutaciones (x ej. relacionadas con alguna patología de origen genético) 1

2 CLONADO MOLECULAR PASOS BÁSICOS DEL CLONADO MOLECULAR Obtención del ADN a clonar Elección de la fuente de ADN y de la metodología para obtenerlo Purificación del ADN Digestión con las enzimas de restricción apropiadas Obtención del vector Elección del vector apropiado Digestión del vector Ligación Introducción de la molécula de ADN recombinante en la célula huésped (TRANSFORMACIÓN) Identificación de las células que contienen el ADN recombinante (SELECCIÓN) 2

3 La estrategia depende tanto de la información de partida como del objetivo final de mi clonado Con qué información cuento antes de empezar? - Secuencia de la proteína - Ubicación en el genoma (positional cloning) - Secuencia del mrna - Bibliotecas de cdna o genómica - Secuencias de ADN desconocidas o conocidas - Producto de PCR Cuál es la fuente del ADN? -ADN (cromosomal, bibliotecas, etc) -ARN -PCR Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca (teniendo información de la secuencia de ADN) 3

4 Identificar y aislar un gen a partir de una biblioteca (teniendo información de proteína/anticuerpos) Amplificación de secuencias de ADN por PCR 4

5 Amplificación de secuencias de ADN por PCR introduciendo sitios de restricción Mediante el diseño apropiado de los oligos empleados para la amplificación por PCR, se pueden introducir los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción necesarios para el posterior clonado. Amplificación de secuencias de ADN desconocidas o parcialmente desconocidas por PCR No siempre conozco la secuencia completa que quiero amplificar como para poder diseñar oligonucleótidos específicos. Hay estrategias para poder hacerlo (se verán en detalle en la clase de PCR II): - RACE (Rapid Amplification of cdna Ends): Puede ser tanto 5 como 3. - PCR inversa - Uso de oligonucleótidos degenerados 5

6 RT-PCR: Amplificación por PCR cuando el material de partida es ARNm. Trascripción Reversa (RT) seguida de PCR CLONAR/AMPLIFICAR 6

7 VECTORES La elección del vector depende de: Tamaño del inserto Tamaño del vector Sitios de reconocimiento de enzimas de restricción Número de copias Eficiencia del método de transformación Qué tipo de experimentos se realizarán con el inserto clonado: 1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA 2) VECTORES DE EXPRESION- Expresión de genes clonados 3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresión génica HERRAMIENTAS NECESARIAS PARA CLONAR Enzimas de restricción Vectores ADN Ligasa Células huésped Método de transformación Otras enzimas: 7

8 OTRAS ENZIMAS Alkaline phosphatase DNA ligase DNA polymerase I Exonuclease III Polynucleotide kinase RNase A Taq DNA polymerase Removes phosphate groups from 5' ends of DNA (prevents unwanted re-ligation of cut DNA) Joins compatible ends of DNA fragments (blunt/blunt or complementary cohesive ends). Uses ATP Synthesises DNA complementary to a DNA template in the 5'-to-3'direction. Starts from an oligonucleotide primer with a 3' OH end Digests nucleotides progressiviely from a DNA strand in the 3' -to-5' direction Adds a phosphate group to the 5' end of double- or single-stranded DNA or RNA. Uses ATP Nuclease which digests RNA, not DNA Heat-stable DNA polymerase isolated from a thermostable microbe (Thermus aquaticus) DIGESTIÓN DEL INSERTO Y DEL VECTOR Antes de realizar la ligación, el fragmento de ADN que se quiere clonar y el vector donde se va a insertar deben ser digeridos con enzimas de restricción. La elección de las enzimas está relacionada con la estrategia diseñada: vector elegido, procedencia del inserto, etc. Es importante considerar la posibilidad de modificar los extremos generados luego del corte. 8

9 Extremo 5 protruding 5' overhangs: La enzima corta asimétricamente dentro del sitio de reconocimiento, generando un extremo 5 saliente (protruding) simple hebra. Ej: Bam HI genera un extremo de este tipo al digerir el ADN. Extremo 3 protruding 3' overhangs: La enzima corta asimétricamente dentro del sitio de reconocimiento, generando un extremo 3 saliente (protruding) simple hebra. Ej: Kpn I genera un extremo de este tipo al digerir el ADN. 9

10 Extremos romos Romo (Blunt): La enzima corta las dos hebras del ADN en sitios exactamente opuestos, generando extremos romos, sin ninguna base saliente. SmaI genera un extremo de este tipo al digerir el ADN. Convertir un extremo 5 protruding en romo Se pueden usar las enzimas Klenow o T4 DNA polimerasa para rellenar con dntps los extremos salientes. Se usa para ligar fragmentos que poseen extremos que so son compatibles. 10

11 Convertir un extremo 3 protruding en romo La enzima T4 DNA polimerasa tiene actividad 3-5 exonucleasa. En presencia de dntps en exceso, convierte un extremo 3 saliente en romo. LIGACIÓN DIGESTION DEL INSERTO DIGESTION DEL VECTOR 11

12 LIGACIÓN La DNA Ligasa puede unir extremos romos Fragmentos de ADN con extremos romos generados por la misma enzima o por diferentes enzimas pueden ser ligados. Si se ligan fragmentos provenientes de la digestión con distintas enzimas, no se regenera ninguno de los dos sitios originales. SmaI -CCC GGG- -CCCGGG- -AAATTT- DraI -AAA TTT--CCCTTT- -AAAGGG- Las ligaciones que reconstituyen los sitios (CCCGGG or AAATTT) pueden ser re digeridas con estas enzimas Los productos de ligación mixtos (CCCTTT + AAAGGG) no pueden ser re digeridos. 12

13 Cualquier extremo complementario puede ser ligado, aún si provienen de la digestión con dos enzimas diferentes BamHI -G GATCC- -CCTAG G- BglII -A GATCT- -TCTAG A- Resultado -GGATCT- -CCTAGA- La secuencia regenerada ya no es más palindrómica y no puede ser digerida ni por BamHI or BglII FOSFATASA ALCALINA La Fosfatasa alcalina remueve el grupo 5' fosfato del ADN y ARN. Es activa a PH alcalino 13

14 FOSFATASA ALCALINA Para qué se usa en el clonado molecular? Para remover los grupos 5' fosfato de los vectores que han sido digeridos con enzimas de restricción, lo que previene la capacidad de re-ligarse de los vectores. Esto facilita la capacidad de ligación a otros fragmentos de ADN digeridos. Especialmente útil cuando se hace la digestión con una sola enzima. FOSFATASA ALCALINA 14

15 LIGACIÓN Extremos del DNA Requerimientos Comentarios Romo (blunt) Extremos salientes diferentes Alta concentración de DNAs y ligasa Se obtienen muchos clones no-recombinantes. Los sitios pueden ser eliminados. Clonado de copias en tandem Se obtienen muchos clones recombinantes. Se conservan los sitios. Clonado direccional. Extremos salientes iguales Tratamiento del vector con fosfatasa alcalina Se conservan los sitios. Clonado no-direccional. Clonado de copias en tandem 15