ADN del cromosoma 21 en el plasma materno se mide directamente;

Transcripción

1 Clinical Chemistry 59: (2013) Q&A Una nueva era en el diagnóstico prenatal: el uso de ADN fetal de células libres en la circulación materna para la detección de aneuploidias cromosómicas Moderadores: Jennifer L. Shea, 1 y Eleftherios P. Diamandis 1,2,3* Expertos: Barry Hoffman, 1,3 Y.M. Dennis Lo, 4 Jacob Canick, 5 y Dirk van den Boom 6 El examen prenatal para la detección de aneuploidias cromosómicas es parte fundamental del cuidado obstétrico de rutina en la mayoría de los países. Habitualmente, la edad de la madre, el peso, la etnicidad, los biomarcadores séricos (incluida la proteína A plasmática gestacional, gonadotropina coriónica humana, -fetoproteína, inhibinaayestriol) y las características sonográficas (es decir, translucencia nucal) se incluyen en un algoritmo de riesgo para determinar la probabilidad de que el feto se vea afectado. Las mujeres embarazadas identificadas como de alto riesgo de acuerdo con el examen prenatal pueden someterse a procedimientos invasivos, tales como amniocentesis y biopsia coriónica, para confirmar el diagnóstico. Los métodos actuales de examen prenatal pueden identificar aproximadamente el 90% de los embarazos afectados por la trisomía 21 (síndrome de Down) con un índice de resultados falso positivos de aproximadamente el 5%. Teniendo en cuenta que la prevalencia de las aneuploidias cromosómicas es generalmente bastante reducida, un índice de resultados falso positivos de aproximadamente el 5% significa que un gran número de mujeres con embarazos no afectados se someten a procedimientos invasivos, lo que pone el feto en un riesgo innecesario de aborto espontáneo. La detección de ADN fetal de células libres en el plasma de mujeres embarazadas hace 14 años abrió la posibilidad de identificar anomalías cromosómicas de forma no invasiva a través de una muestra de sangre única. Aproximadamente un 10% del ADN de células libres en la circulación materna es de origen fetal y esta propiedad se explotó inicialmente para determinar el estado del rhesusdyelsexo del feto. Sin embargo, la aparición de la secuenciación de ADN de nueva generación ha permitido la detección prenatal de aneuploidias cromosómicas, incluida la trisomía 21 de la sangre materna. En resumen, la proporción de moléculas de ADN del cromosoma 21 en el plasma materno se mide directamente; un incremento por encima de un umbral predeterminado es indicativo de la trisomía 21. El resultado clínico deestapruebaprenatalnoinvasivahasidopromisorioyciertos estudios clínicos recientes han demostrado una sensibilidad diagnóstica del 100% y una especificidad diagnóstica del 98 al 99% en comparación con el cariotipado completo mediantemediosinvasivos. Cuandoseutilizacomounprocedimiento de análisis confirmatorio, esta tecnología también tiene el potencial de reducir de forma notable la cantidad de mujeres que se someten a procedimientos de diagnóstico invasivos, lo que genera considerables ahorros en costos. En este artículo, 4 líderes en el área del diagnóstico prenatal no invasivo brindan su opinión sobre este fascinante avance. Puede describir brevemente cómo se ha aplicado la secuenciación de nueva generación (NGS) 7 aladetección de aneuploidias cromosómicas con el ADN fetal de células libres? Existen otras técnicas de laboratorio que se hayan estudiado con este objetivo? Barry Hoffman: La NGS detecta de manera no invasiva aneuploidias cromosómicas del feto de forma previa al nacimiento mediante la determinación de la proporción relativa del ADN del cromosoma afectado en el ADN fragmentado de células libres que circula en la sangre ma- 1 Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto (Departamento de Medicina de Laboratorio y Patología, Universidad de Toronto), Toronto, Ontario, Canadá; 2 Department of Clinical Biochemistry, University Health Network, Toronto (Departamento de Bioquímica Clínica, Red de Salud Universitaria de Toronto), Ontario, Canadá; 3 Department of Pathology and Laboratory Medicine, Mount Sinai Hospital (Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Hospital de Mount Sinai), Toronto, Ontario, Canadá; 4 Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Chinese University of Hong Kong (Instituto de Ciencias de la Salud Li Ka Shing, Universidad China de Hong Kong), Hong Kong RAE, China; 5 Division of Medical Screening and Special Testing, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Women and Infants Hospital, Alpert Medical School of Brown University (División de Exámenes Médicos y Pruebas Especiales, Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Hospital de Mujeres y Niños, Facultad de Medicina Warren Alpert de la Universidad de Brown, Providence, RI; 6 Sequenom, Inc., San Diego, CA. * Dirigir correspondencia para estos autores a: Mount Sinai Hospital, 60 Murray St., 6th Floor, Toronto, Ontario, M5G 1X5 Canadá. Fax ; correo electrónico: ediamandis@mtsinai.on.ca. Recibido para la publicación el 31 de enero de 2013; aceptado para la publicación el 5 de febrero de Abreviaturas no estándar: NGS, secuenciación de nueva generación; MPSS, secuenciación aleatoria masiva en paralelo; PPNI, pruebas prenatales no invasivas; TAT, tiempo de obtención; ISPD, International Society for Prenatal Diagnosis (Sociedad Internacional de Diagnóstico Prenatal). 1151

2 terna. Se requieren varios millones de cifras de secuenciación a un nivel de cobertura apropiado para cuantificar de forma confiable el aumento o la disminución minúsculos de las dosis cromosómicas en la circulación materna debido a aneuploidias fetales y esto se ha vuelto posible solo con la aparición de la tecnología NGS. La secuenciación de todos los fragmentos de ADN circulante se realiza sin selección previa mediante el uso de la secuenciación aleatoria masiva en paralelo (MPSS) en un enfoque no dirigido, o bien se seleccionan primero los fragmentos de ADN del objetivo de interés, en este caso el cromosoma aneuploide junto con el otro, en forma previa a la secuenciación posterior. El último método requiere una secuenciación considerablemente menor, lo que mejora el rendimiento y reduce el costo del reactivo, pero es por consiguiente más complejo ya que requiere una estrategia de selección del ADN de las regiones dirigidas. Algunos de los métodos corrigen la fracción del ADN de células libres en la circulación materna que se origina a partir del feto, ya que esta influye en la magnitud de la dosis cromosómica aneuploide observada respecto del contexto de la contribución disómica materna mucho mayor. Habitualmente, la fracción fetal se encuentra en el orden del 10%; sin embargo, pueden obtenerse resultados lo suficientemente confiables cuando la fracción es de tan solo el 3 al 4%. Otro enfoque es el de enriquecer la fracción fetal; por ejemplo mediante la explotación de las diferencias de metilación entre el ADN fetal y materno antes de la secuenciación para aumentar la señal fetal. Dennis Lo: La mayoría de los estudios publicados sobre el uso de la NGS para la detecciónde aneuploidias cromosómicas se basan en la secuenciación aleatoria, o shotgun. Cuando se vuelven a trazar los datos de secuenciación en relación con el genoma humano de referencia, estos aportan una representación proporcional de cada cromosoma en el plasma materno. Cuando se utiliza para detectar una trisomía fetal, el cromosoma aneuploide mostrará un incremento en la representación del plasma materno en presencia de un feto que padece trisomía. Además de la secuenciación aleatoria, diferentes investigadores han realizado publicaciones sobre los enfoques con base en la secuenciación dirigida, en la cual las secuencias de los cromosomas de interés se capturan de forma selectiva o se multiplican y luego se secuencian. Además de la NGS, ciertos informes han estudiado el uso del índice alélico de marcadores de metilación del ADN y ARN en plasma para la detección prenatal no invasiva de aneuploidias cromosómicas fetales. En mi opinión, estos métodos no son tan definitivos como las estrategias basadas en la NGS, especialmente en términos de solidez y alcance de la población. Jacob Canick: El distintivo hallazgo del profesor Lo en 1997, de que los fragmentos de ADN de origen fetal y materno están presentes en la circulación de las mujeres embarazadas, proporcionó la base biológica para desarrollar una estrategia de NGS para la detección de aneuploidias fetales. La secuenciación simultánea de millones de tales fragmentos de ADN permiten la identificación computarizada del cromosoma de origen para cada fragmento. Por lo tanto, la capacidad de discernir entre una trisomía fetal en un entorno de ADN de células libres y una madre aneuploide es verdaderamente un ejercicio en la imprecisión analítica. Un feto afectado por una trisomía particular tendrá un aumento del 50% en la contribución de dicho cromosoma al total de fragmentos secuenciados, pero el aumento se diluye de acuerdo con la proporción del ADN fetal presente en la muestra de plasma materno. El aumento real provocado por el feto trisómico será, en promedio, la mitad del porcentaje de la contribución del ADN fetal, cualquiera sea este, en esa muestra. Otros métodos moleculares que han sido examinados anteriormente con cierto éxito involucran diferencias epigenéticas entre el ADN fetal y materno (p. ej., metilación) y el ARN (p. ej., transcripción fetal específica en comparación con la materna específica). Sin embargo, el grado de variación epigenética es diferente en las diferentes poblaciones, a tal grado que la llamada cobertura universal que utiliza dichos métodos es difícil de obtener. Dirk van den Boom: Las principales preguntas después de la publicación de Dennis Lo en 1997 se relacionaron con (A) la selección del analito más apropiado (ADN, ARN) para permitir procedimientos de obtención de muestras viables comercialmente; (B) aprovechamiento máximo del 1152 Clinical Chemistry 59:8 (2013)

3 rendimiento del analito seleccionado en los procedimientos de extracción de ácido nucleico; y (C) identificación de la tecnología más apropiada para detectar de forma confiable la aneuploidia fetal en el analito seleccionado teniendo en cuenta que la mayor parte de la información en la sangre o el plasma maternos provienen de la madre. Inicialmente, se investigaron una variedad de métodos, entre ellos métodos basados en ARN, métodos que se basan en las diferencias epigenéticas entre el genoma materno y el fetal, y diferentes tecnologías de detección, que incluyen RCP digital, espectometría de masas y secuenciación. La tecnología NGS es actualmente la tecnología de detección preferida y predominante ya que proporciona la cantidad de puntos de datos necesaria para la detección precisa de una trisomía fetal. En el Sequenom Center of Molecular Medicine (Centro Sequenom de Medicina Molecular), hemos elegido implementar un enfoque hologenómico en relación con la detección de aneuploidia fetal mediante el uso de NGS. El ADN se extrae del plasma materno. La mayor parte del ADN extraído es de naturaleza apoptótico y está altamente fragmentado en tramos continuos relativamente cortos (alrededor de 150 bp). Luego, se prepara un representante de la genoteca del genoma materno y fetal para estos fragmentos. Luego de la multiplicación, varios millones de fragmentos de ADN de la genoteca se secuencian de forma masiva en paralelo. Para cada componente de la genoteca, el proceso genera 36 bases de información de secuencia continua (cifras de secuenciación), suficiente para identificar de forma única el origen cromosómico de la secuencia o el fragmento. Después de finalizar el proceso de secuenciación, todas las cifras de secuenciación generadas por muestra de paciente se vuelven a trazar en relación con su ubicación cromosómica en el genoma humano y se realiza el recuento de la frecuencia de fragmentos que se alinean con cada cromosoma. Con estos datos, ahora puede calcularse la representación relativa de cada cromosoma en comparación con un grupo de cromosomas de referencia. El valor se correlaciona firmemente con el tamaño del cromosoma y es una medida muy precisa y estable ya que se basa en un amplio número de mediciones de marcadores independientes (millones de puntos de datos por muestra y prácticamente cada cifra de secuenciación es un marcador independiente). En este punto, la detección de una trisomía fetal, tal como la trisomia 21, se vuelve bastante simple. El ADN de células libres extraído del plasma de una mujer embarazada que tiene un feto con trisomía 21 contendrá más fragmentos del cromosoma 21 debido a la copia adicional de dicho cromosoma en el genoma fetal y; por tanto, en el ADN fetal de células libres presente en el plasma materno. En el proceso de secuenciación, esto conducirá a una representación excesiva de secuencias del cromosoma 21 en relación con un grupo de cromosomas de referencia. Por lo tanto, una trisomía 21 se identifica como un aumento significativo en la representación del cromosoma 21 en comparación con el plasma de una mujer embarazada con un feto aneuploide. Este caso específico de trisomía 21 puede generalizarse a la identificación de cambios significativos (aumentos o reducciones) en la representación cromosómica de cualquier cromosoma. Si bien la prueba de laboratorio MaterniT21 Plus actualmente comercializada por el centro Sequenom Center of Molecular Medicine se enfoca por el momento en los cromosomas 21, 18 y 13, nuestro enfoque hologenómico seleccionado puede aplicarse de forma genérica, de modo que las aneuploidias fetales adicionales pueden detectarse e informarse sin realizar cambios en el método de la prueba mientras se realizan las validaciones clínicas adicionales y demuestran un nivel de desempeño aceptable. A medida que el costo de la NGS se reduzca, esta tecnología eventualmente podría conducir a un cariotipado molecular no invasivo con contenido y desempeño similares a los de la prueba citogenética. Se han evaluado diferentes plataformas de NGS a los efectos del diagnóstico prenatal no invasivo? Existen diferencias notables? Barry Hoffman: Se han evaluado diferentes plataformas de NGS para las pruebas prenatales no invasivas (PPNI), que incluyen las de Illumina, Ion Torrent y Applied Biosystems. Las 3 plataformas multiplican por clonación los fragmentos de ADN, mediante RCP de emulsión o RCP de transferencia de fase sólida, antes de la secuenciación, que presenta el inconveniente de la introducción del sesgo de adenina-timina (AT) guanina-citosina (GC) que luego debe corregirse. Las primeras 2 plataformas usan secuenciación por síntesis con la mediación de la ADN-polimerasa, mientras que la última emplea la síntesis por ligación con la mediación de la ADN-ligasa. Los nucleótidos agregados de forma secuencial a la plantilla de ADN unicatenario por la polimerasa o ligasa están identificados por el analizador para producir la secuencia. En el caso del analizador Ion Torrent, los 4 nucleótidos se agregan de forma cíclica uno por vez, y se detecta el ión de hidrógeno que se libera cuando se incorpora un nucleótido. Las otras 2 plataformas incorporan nucleótidos modificados por fluorescencia a la cadena de ADN para determinar la secuencia. A pesar de estas diferencias, los estudios publicados han demostrado que las 3 plataformas pueden diagnosticar de forma precisa la trisomía 21 de forma no invasiva. Las nuevas tecnologías en el horizonte pueden eliminar la necesidad de multiplicar la plantilla y agregar nucleótidos Clinical Chemistry 59:8 (2013) 1153

4 para determinar la secuencia. Dichos avances reducirán considerablemente los costos de reactivos y el tiempo de obtención (TAT) de la prueba y así facilitarán la aplicación de la NGS a la medicina clínica. Dennis Lo: Hasta el momento, la mayoría de las publicaciones han informado el uso de la plataforma de secuenciación por síntesis. También existen un par de publicaciones que informan el uso de la plataforma de secuenciación por ligación. Los resultados generados mediante el uso de dichas plataformas son generalmente muy semejantes. Sin embargo, los detalles de los protocolos de secuenciación y los análisis de bioinformática afectan la tasa de no llamada (no-call rate) y si los resultados de secuenciación requerirán parámetros clínicos adicionales (p. ej., edad gestacional y edad de la madre) para la interpretación. Dado que ambas plataformas requieren el uso de la multiplicación,se ha observado el sesgo de GC. Para la detección de aneuploidias cromosómicas que involucran cromosomas particularmente proclives a este sesgo (p. ej., cromosomas 13 y 18), se requieren algoritmos bioinformáticos especiales que corrijan dichos efectos y que han demostrado ser muy eficaces. Dos artículos recientes han informado el uso de un secuenciador de molécula única que no requiere un paso de multiplicación para analizar el ADN del plasma materno. Como resultado, el sesgo de GC ya no parece seguir siendo un problema. Sería interesante probar un número de plataformas novedosas de secuenciación de molécula única (p. ej., secuenciación de nanoporos) para esta aplicación. Jacob Canick: En mi opinión, se han probado 2 plataformas de NGS y se demostró su conveniencia para esta aplicación. El trabajo más exhaustivo se ha realizado con el método de secuenciación por síntesis en la plataforma Illumina Hi-Seq Un estudio en 2010, en el cual se realizó la secuenciación por ligación con el sistema SOLiD 3 System de Applied Biosystems, proporcionó evidencia de que este método también sería eficaz. Dirk van den Boom: Si bien existen algunas publicaciones que describen las evaluaciones preliminares de otras plataformas de NGS, como el sistema SOLiD o el sistema Heliscope (Helicos), elegimos implementar la prueba desarrollada en laboratorio MaterniT21 en la plataforma Illumina HiSeq Los principales motivos de esta decisión fueron la alta calidad de los datos y la madurez de la tecnología al momento de nuestro estudio de validación clínica. La idoneidad del volumen de trabajo de laboratorio clínico, la capacidad de la muestra y las consideraciones sobre costos también fueron factores clave en nuestra elección del instrumental para la comercialización inicial. Cuál es el TAT de este método? Dentro de qué período de la gestación debería realizarse esta prueba? De qué forma se compara esto con las prácticas actuales de detección en suero materno? Barry Hoffman: Los TAT de las pruebas de NGS disponibles comercialmente que detectan la trisomía se encuentran habitualmente en el orden de las 1.5 a 2 semanas, ligeramente mayores que los tiempos de notificación de2a5días que se alcanzan habitualmente mediante los exámenes de suero materno tradicionales en el primero o segundo trimestre del embarazo. El resultado de la NGS depende de qué tan bien ha automatizado, simplificado y combinado de forma eficaz e integral el laboratorio de pruebas los pasos discretos requeridos para generar un resultado clínico (selección de objetivo, construcción de genoteca, preparación de la plantilla, secuenciación, procesamiento de datos e interpretación). Otros factores interrelacionados que influyen en el resultado incluyen la rapidez inherente de la tecnología de secuenciación central utilizada, el número de muestras multiplexadas que pueden combinarse en una sola serie, y la calidad y duración de las cifras de secuenciación que a su vez ejercen un impacto en el nivel de cobertura requerido y la alineación con el genoma. Si bien la cantidad absoluta y relativa de ADN fetal en el ADN de células libres circulante de la madre es menor en las primeras etapas de la gestación, ciertos estudios publicados han demostrado que el PPNI puede detectar de forma confiable trisomías fetales ya en la décima semana de gestación. Dicho muestreo al final del primer trimestre se ajusta perfectamente a los elementos de la práctica obstétrica actual y el concepto novedoso de la primera visita de rutina al hospital a fines del primer trimestre del embarazo, en la cual se evalúa al feto para detectar anomalías anatómicas, se realiza una revisión para detectar trisomías y se evalúa la probabilidad de preeclampsia de aparición temprana. Dennis Lo: El TAT es de aproximadamente 7 a 10 días. La prueba puede realizarse desde las 10 semanas de gestación en adelante. Este plazo es altamente compatible con las prácticas actuales para el suero materno. Por ejemplo, las mujeres embarazadas pueden examinarse primero mediante ultrasonido para realizar la evaluación de la translucencia nucal de sus fetos y las pruebas de suero materno en el primer trimestre. Las mujeres clasificadas como de alto riesgo mediante dichas pruebas luego pueden derivarse para someterse a una prueba de NGS mediante el uso de ADN de plasma materno. De forma similar, el plazo también es compatible con el examen de suero materno del segundo trimestre y la prueba integrada Clinical Chemistry 59:8 (2013)

5 Jacob Canick: En un estudio en el cual el centro Sequenom Center for Molecular Medicine realizó pruebas en casi 2000 muestras de pacientes en 9 semanas, dispusimos que todas las muestras se prueben en tiempo real y el TAT fue inferior a los 10 días para 18 de los últimos 20 grupos de 90 series de muestras. Esto es similar al TAT típico para el análisis de cariotipado completo de las muestras del líquido amniótico y biopsia coriónica. La mayor parte de dicho tiempo está utilizado por la tecnología de NGS y bioinformática, que debería poder reducirse dentro de los próximos años. Si bien se espera que el examen del suero materno (con o sin ultrasonido fetal) presente un TAT de no másde2a3días hábiles, en la mayoría de los casos una vez que la muestra se encuentra en el laboratorio de pruebas, la ejecución de los análisis de marcadores múltiples y la notificación de los resultados de los exámenes habitualmente demoran 1día. Dirk van den Boom: En nuestro centro, actualmente tenemos un promedio de 7días hábiles tras el ingreso de una muestra. Este TAT se basa en la experiencia del laboratorio con más de muestras clínicas. A través de un estudio clínico de diseño y ejecución independientes, validamos la utilidad e imprecisión de la prueba que abarca el período de 10 a 22 semanas de gestación. La detección no invasiva de aneuploidias fetales a través del análisis del ADN fetal de células libres del plasma materno es una prueba directa y no utiliza marcadores indirectos, que podrían confundirse con otras variables clínicas, como etnicidad, tabaquismo, edad gestacional o diabetes mellitus insulino dependiente. Como resultado, la tecnología de esta prueba posibilita la sensibilidad y especificidad diagnósticas que se ven notablemente mejoradas en las pruebas de detección bioquímica en suero empleadas. Está disponible comercialmente esta prueba en la actualidad? De ser así, cuál es su costo? Barry Hoffman: Actualmente se ofrece comercialmente el PPNI del ADN fetal de células libres en el plasma materno para detectar la trisomía 21,18y13en los EE. UU. a través de ciertos proveedores, incluidos el centro Sequenom Center for Molecular Medicine (MaterniT21 Plus ), Ariosa Diagnostics Inc. (Harmony Prenatal Test ) y Verinata Health (Verifi ). Estas pruebas están dirigidas a los embarazos de alto riesgo de trisomía 21 y están disponibles comercialmente a petición de un médico de los EE. UU. En ciertos casos, se encuentran disponibles pruebas relacionadas para aneuploidia del cromosoma sexual (XO y, recientemente, XXY, XXX y XYY) como en la asignación de género. El costo de las pruebas de trisomía varían de $795 a $2760. En Asia y Europa, se han formulado diferentes acuerdos de comercialización para ofrecer pruebas similares. En Canadá, la prueba prenatal Harmony Test se lanzó en enero de Dennis Lo: Esta prueba está comercialmente disponible ahora. Los costos se han estimado aproximadamente en $1000 a $3000 por prueba. Jacob Canick: Sí. Como se indicó anteriormente, en los EE. UU. existen actualmente 3 laboratorios comerciales que ofrecen las pruebas de aneuploidia en plasma materno basadas en el ADN. LifeCodexx AG de Konstanz, Alemania, ofrece ahora pruebas en países europeos donde se habla alemán y en China, Beijing Genomics Institute y Berry Genomics están aceptando muestras. Natera, Inc., de San Carlos, California, ha anunciado su intención de ofrecer pruebas hacia finales de Los precios de lista para las pruebas ofrecidas en EE. UU. varían de $795 a $2700, con ciertos programas de seguro de salud vigentes. En su opinión, cree que esta prueba eventualmente estará disponible en la mayoría de los laboratorios clínicos o solo la ofrecerán centros especializados? Barry Hoffman: Actualmente, el PPNI para trisomía 21 en Norteamérica solo está disponible a través de laboratorios nacionales o regionales especializados operados por los proveedores comerciales y esto es probable que continúe igual en el futuro próximo. Sin embargo, a medida que las pruebas moleculares evolucionan y se vuelven más generalizadas, se puede imaginar el desarrollo de paquetes completos de pruebas genéticas prenatales, automatizadas de forma integral y destinadas a (en constante ampliación) grupos de anomalías seleccionadas que estarían adecuadamente accesibles para su implementación en laboratorios clínicos que busquen ofrecer un servicio prenatal. La transición de las pruebas de proveedores a laboratorios clínicos requeriría un modelo de negocios alternativo impulsado por derechos de licencia y la venta de kits registrados (reactivos). También puede debatirse que la difusión de las pruebas a los centros locales o regionales se adapta mejor a la naturaleza sensible al tiempo de las pruebas y la compleja infraestructura especializada existente más allá de la prueba misma que se requieren para ofrecer un servicio de detección prenatal de calidad. Esta infraestructura incluye asesoramiento previo y posterior a la prueba, el seguimiento de las pruebas invasivas, la amplia comunicación con el paciente y el cuidador, y el análisis estadístico de la base de datos para determinar el desempeño clínico de la prueba en relación con los puntos de referencia. El requerimiento para dicha infraestructura excluye la posibilidad de que la mayoría de los laboratorios de ser- Clinical Chemistry 59:8 (2013) 1155

6 vicio clínico ofrezcan las pruebas prenatales moleculares no invasivas. Dennis Lo: Dado que la NGS aún involucra instrumentos bastante costosos y requiere un amplio soporte bioinformático, considero que podría hacerse más eficiente la oferta a través de centros especializados, cada uno de los cuales respondería a las necesidades de una región geográfica particular. Jacob Canick: El nuevo método entraña la necesidad de plataformas de secuenciación avanzadas y costosas, sistemas de recopilación de información y almacenamiento, y bioinformática, así como el aporte científico y técnico altamente especializado, con redundancia incorporada para garantizar la falta de errores en la notificación de resultados clínicos. Asimismo, las cuestiones de propiedad intelectual han dado como resultado demandas y contrademandas entre entidades comerciales. Si bien se depende de los resultados de esas demandas, parece poco probable que en el futuro cercano varios de los laboratorios clínicos validen y o- frezcan esta prueba como un servicio clínico. Eventualmente, los avances en la bioingeniería sin dudas simplificarán, acelerarán y reducirán los problemas de costos, de modo que estos e incluso otros métodos genómicos más complejos lleguen a estar disponibles para la mayoría de los laboratorios. Dirk van den Boom: En este punto, las pruebas de NGS aún presentan una complejidad bastante alta en el volumen de trabajo así como los en los requisitos de infraestructura informática y bioinformática, y requieren una inversión de capital considerable. La adecuada validación analítica y clínica de las pruebas de NGS para el uso en el diagnóstico prenatal no resulta insignificante y demanda una amplia obtención de muestras. Por lo tanto, considero que solo los centros especializados deberían ofrecer esta tecnología hasta que se encuentren disponibles sistemas de pruebas simples de usar y de instalar que no comprometan la precisión. Una declaración de posición publicada recientemente por la International Society for Prenatal Diagnosis (Sociedad Internacional de Diagnóstico Prenatal, ISPD) en 2011 indicaba que el uso de la NGS para la detección avanzada de la trisomía 21 debería realizarse solo en las poblaciones de alto riesgo. Se han realizado avances en el último año para respaldar la detección generalizada también en la población de bajo riesgo? Barry Hoffman: Cuando la ISPD emitió esta recomendación, estaba siendo prudente en tanto que los estudios clínicos a la fecha habían validado la prueba solo en los embarazos de alto riesgo para el síndrome de Down. Desde entonces, numerosos estudios en embarazos de alto riesgo han confirmado que el PPNI del ADN de células libres en el plasma materno puede detectar 99% de los embarazos con trisomía fetal 21, a un índice de resultados falso positivos de 1%, pero el desempeño en la detección de trisomías 18 y 13 ha sido menos sólido. La ISPD también reconoció que solo debido a que la prueba demuestra un rendimiento casi perfecto en las poblaciones de alto riesgo no implica que se alcanzaría el mismo rendimiento necesariamente en una población con riesgo ordinario. A fines de noviembre de 2012, se publicó el primer estudio que evaluaba el rendimiento de la detección de la trisomía 21 y 18 mediante el uso de la secuenciación selectiva de cromosomas en una población ordinaria de 2049 mujeres. El estudio concluyó que el PPNI del ADN fetal de células libres en el plasma materno de una población de riesgo ordinario fue tan eficaz como se informó previamente en los grupos de alto riesgo. Se encuentran en curso otros estudios que evalúan el rendimiento de la prueba en una población ordinaria de mujeres sometidas a exámenes de detección de aneuploidias y se esperan los resultados en los próximos 6 a 12 meses. La validación de la prueba para las poblaciones con exámenes ordinarios simplificarán la decisión de las mujeres y cuidadores de elegir el PPNI de ADN fetal circulante de células libres en la circulación materna como el enfoque preferido a realizar para la detección prenatal de aneuploidias. Dennis Lo: El principal determinante biológico de la precisión de las pruebas de aneuploidia fetal que utilizan la secuenciación del ADN en plasma materno es la concentración fraccional del ADN fetal en el plasma materno. Según tengo entendido, no existe evidencia de que las mujeres clasificadas como de alto riesgo mediante pruebas de detección convencionales presenten un perfil de concentración de ADN fetal fraccional diferente del de las mujeres con bajo riesgo. Por tanto, confío en que la prueba de NGS debería presentar el mismo desempeño analítico en las poblaciones con bajo riesgo. La cuestión es más bien económica, dado que hay muchas más mujeres con bajo riesgo en comparación con las de alto riesgo. Se espera que con la futura reducción en el costo de la secuenciación y los procesos relacionados, tal consideración económica se vuelva un problema menor. Por lo tanto, soy optimista de que en el mediano a largo plazo las pruebas del ADN en plasma materno para la detección de aneuploidias se convertirán en una prueba de primera línea. Jacob Canick: El problema de ofrecer una prueba de detección de ADN a todas las mujeres embarazadas 1156 Clinical Chemistry 59:8 (2013)

7 debería abordarse mediante la formulación de 2 preguntas: Existe una base biológica o científica para esperar un rendimiento diferente en la población general en comparación con la población de alto riesgo, y existen motivos no científicos más pragmáticos para esperar antes de la implementación de exámenes de detección de la población? Hemos examinado si existen covariables para este tipo de pruebas (variables indirectas que afectan los resultados), algunas de las cuales están relacionadas con la cuestión de las diferencias en los embarazos de bajo y alto riesgo, y la respuesta ha sido que no de forma regular. Por ejemplo, la razón por la cual se denominan de alto riesgo no cambia la fracción fetal ni el resultado de la prueba (puntuación z) que se asigna a los pacientes euploides o con trisomía 21. Asimismo, los marcadores fenotípicos específicos que se utilizan actualmente (es decir, los diferentes marcadores séricos y el marcador ecográfico fetal, translucencia nucal) no se encuentran relacionados o están relacionados de forma débil con la fracción fetal o la puntuación z. Actualmente, los motivos más importantes para no usar la NGS a fin de evaluar a la población general son prácticos: costo y TAT excesivos, falta de certezas acerca del reembolso del seguro e insuficientes instalaciones para las pruebas. Dirk van den Boom: La utilidad de la NGS se ha validado ampliamente en las mujeres embarazadas con alto riesgo de aneuploidia fetal. Esto incluye a las mujeres de edad materna avanzada, con antecedentes familiares de aneuploidia fetal, resultados de detección en suero positivos o hallazgos ecográficos. Además de la ISPD, el American College of Obstetricians and Gynecologists (Colegio Americano de Obstetras y Ginecólogos) y la Society for Maternal Fetal Medicine (Sociedad de Medicina Materno Fetal) emitieron un dictamen del comité conjunto donde recomendaban ofrecer las pruebas de ADN fetal de células libres a los pacientes con mayor riesgo de aneuploidias. El California Technology Assessment Forum (Foro de Asesoramiento Tecnológico de California) también realizó recientemente una evaluación independiente y recomendó que el uso del ADN fetal de células libres como una prueba de detección prenatal avanzada de aneuploidia fetal de trisomía 21 y 18 en mujeres de alto riesgo cumpla con los 5 criterios de seguridad, eficacia y mejoras en los resultados de salud. Se ha publicado recientemente un estudio inicial con un enfoque dirigido combinado con NGS para la detección de la trisomía fetal. Este estudio incluyó un grupo de muestras algo limitado de mujeres con bajo riesgo y personalmente considero que se necesitará mayor validación clínica antes de que dicha prueba pueda aplicarse de forma general en un escenario de detección. En este punto, los enfoques basados en exámenes séricos actualmente disponibles aún son más rentables para la población general con bajo riesgo (a pesar de su desempeño más deficiente) y pueden identificar las complicaciones del embarazo que actualmente no se detectan mediante el ADN fetal de células libres. Se ha aplicado esta tecnología a otras aneuploidias cromosómicas además de la trisomía 21? Qué ocurre con las enfermedades que surgen de mutaciones de punto único? Barry Hoffman: Ciertos estudios publicados han demostrado el potencial de la NGS para detectar un amplio espectro de anomalías moleculares en el ADN fetal de células libres circulante, que incluyen aneuploidias cromosómicas, eliminaciones, inserciones, polimorfismos de nucleótido único y variaciones en el número de reproducciones. Se debe optimizar la tecnología para identificar cada tipo de anomalía, con problemas tales como la duración de las transcripciones secuenciadas y el desarrollo de algoritmos bioinformáticos especializados estrechamente relacionados con la calidad y confiabilidad del resultado. Es imaginable que la NGS sustituirá a las matrices basadas en chip en la detección de anomalías fetales y no hay nada que impida el desarrollo de plataformas de secuenciación multimodales capaces de detectar de manera confiable todos los tipos de anomalías moleculares del ADN y las variaciones en una única ejecución. Actualmente, se ha aplicado comercialmente la tecnología a la detección de aneuploidias del cromosoma del sexo, tal como Turner (monosomía X) y Klinefelter (XXY), yalas pruebas de incompatibilidad Rh. Dennis Lo: Además de la trisomía 21, esta tecnología se ha aplicado a las trisomías 13 y 18, así como al síndrome de Turner. También existen datos que demuestran que la prueba de secuenciación puede usarse para detectar el síndrome de Down causado por una translocación robertsoniana, así como microeliminaciones cromosómicas. En el último caso, se debería incrementar el nivel de la secuenciación. Hemos demostrado que el enfoque de secuenciación puede usarse para el diagnóstico prenatal no invasivo de enfermedades monogénicas (p. ej., -talasemia), que incluyen casos provocados por mutaciones de punto. Para dichas aplicaciones, un enfoque de secuenciación dirigido parece ser más rentable. Jacob Canick: Es interesante notar que la trisomía 21, la aneuploidia más común en el nacimiento, también parece ser la más fácil de identificar de las aneuploidias de importancia clínica mediante la NGS del ADN de plasma materno. Las trisomías 18 y 13, y la monosomía X, han sido más difíciles de identificar con el mismo Clinical Chemistry 59:8 (2013) 1157

8 nivel de desempeño que la trisomía 21, pero el desempeño en dichas aneuploidias es ahora lo suficientemente alto para permitir el uso clínico de la NGS para sus pruebas. Sin embargo, los resultados positivos de la prueba de cualquiera de estas aneuploidias incluida la trisomía 21, no son suficientes para efectuar un diagnóstico definitivo. Aún se recomiendan las pruebas de diagnóstico invasivas para todos los resultados de NGS positivos a fin de garantizar la identificación de todos los fetos euploides con resultados falso positivos. Dirk van den Boom: El estudio de validación clínica de la prueba MaterniT21 Plus incluyó casos con trisomía fetal 18 y 13 además de la trisomía 21. Ambos se detectaron con una alta precisión diagnóstica. Asimismo, nuestra tecnología para la detección de aneuploidias fetales utiliza un enfoque que en principio puede realizar una evaluación hologenómica. A medida que se encuentren disponibles otras muestras de trisomías fetales, además de la 21, 18 o 13, para la validación clínica, podrá evaluarse el desempeño de la prueba actual que utiliza la NGS y se podrá decidir si deberían informarse esas otras trisomías. Por ejemplo, también se han publicado recientemente resultados iniciales de aneuploidias fetales del sexo mediante NGS. Varios grupos de investigación han publicado estudios preliminares de eficacia para la detección dirigida de mutaciones de punto único en ADN fetal de células libres, particularmente en los casos indicados por antecedentes familiares o estado de portador de los padres. Dennis Lo y su equipo han sido pioneros recientemente en la tarea de evaluar la detección de mutaciones de punto único de forma más genérica mediante la secuenciación de un genoma fetal completo a partir del ADN fetal de células libres. Si bien este trabajo es altamente fascinante, la posible implementación comercial requerirá mayores avances en la reducción de los costos de secuenciación relacionados y, ciertamente, la validación analítica y clínica más allá de lo que se ha alcanzado hasta la fecha. Puede aplicarse a los gemelos esta tecnología? Qué ocurre con los embarazos de donante de fecundación in vitro? Barry Hoffman: La gestaciónmúltiple es actualmente una contraindicación del PPNI de ADN fetal de células libres en plasma materno y está específicamente descartado por el examen por ultrasonido antes de solicitar la prueba. Cuando se detecta la presencia de gemelos, una alternativa es la evaluación tradicional mediante biomarcadores bioquímicos y por ecografía, aunque está bien establecido que el desempeño del examen tradicional en la gestaciónmúltiple se considera menos eficiente que en los embarazos únicos. Sin embargo, no existe una razón a priori por la cual el análisis molecular del ADN fetal de células libres circulante para detectar un incremento en la proporción de trisomía 21 fetal en el plasma materno no podría aplicarse a las gestaciones múltiples. Sin dudas, la validación de la prueba en dichos embarazos se verá obstaculizada por la rareza de los fetos afectados y las complejidades relacionadas con la monocigosidad y la dicigosidad; sin embargo, el ADN fetal relacionado con el entorno materno deberá ser mayor y así aumenta la fracción fetal y la confiabilidad del análisis, particularmente en el caso de gemelos monocigóticos con ADN idéntico y placentas con pérdida. Asimismo, la cigosidad de los gemelos será evidente a partir de dichas pruebas. En principio, el análisis del ADN fetal de células libres n la circulación materna debería realizarse de la misma forma en los embarazos de donante de óvulos así como en las concepciones espontáneas. Los datos limitados disponibles actualmente del ensayo MELISSA recientemente informado demuestran que esto es verdadero. Los 36 embarazos de reproducción asistida que se incluyeron en este ensayo prospectivo sobre la precisión de la prueba Verifi en una combinación real de embarazos se evaluaron de forma correcta. Dennis Lo: La tecnología puede aplicarse en los gemelos. Hemos demostrado que la tecnología también puede permitir determinar la cigosidad de los embarazos gemelares. Además, para los gemelos dicigóticos, la secuenciación de ADN en plasma materno puede permitir la medición de la cantidad de ADN liberado por cada gemelo, que podría tener interesantes aplicaciones clínicas y de investigación. La tecnología puede aplicarse a los embarazos de donante de fecundación in vitro. Jacob Canick: Un estudio de nuestro grupo y un estudio del grupo de Diana Bianchi indican que las pruebas de NGS para detectar aneuploidias identificarán los embarazos gemelares en los cuales uno de los fetos o ambos se vean afectados. Si bien estos resultados se basan en menos casos que la documentación sobre embarazos únicos, parece que los embarazos gemelares tienen, en promedio, una mayor fracción fetal que los embarazos únicos, lo que contribuye a un mejor desempeño de la prueba. Bianchi y colegas han abordado brevemente la cuestión de los embarazos logrados mediante fecundación in vitro y no han encontrado diferencias en el desempeño, aunque no proporcionaron datos. Dirk van den Boom: Sí, el concepto de tecnología subyacente de la prueba MaterniT21 Plus es adecuado para la aplicación en los embarazos gemelares. La capacidad para detectar una trisomía fetal en el plasma 1158 Clinical Chemistry 59:8 (2013)

9 materno está principalmente impulsada por la relativa cantidad de ADN fetal en comparación con el ADN materno. En los estudios de validación publicados, la fracción fetal presentó un promedio del 13% y el mayor componente prácticamente siempre fue de naturaleza materno. En los embarazos gemelares donde solo una de las gestaciones es trisómica, el exceso del cromosoma respectivo aún puede detectarse siempre que la fracción fetal real se encuentre por encima del umbral de detección. El feto no trisómico añade solo una pequeña cantidad al componente materno euploide. Hemos realizado informes de más de 700 gestaciones gemelares. Como en el caso de los gemelos, la prueba MaterniT21 Plus puede aplicarse a los embarazos de donante de fecundación in vitro. El análisis de la representación cromosómica subyacente a la detección no invasiva de la trisomía fetal en plasma materno, en principio, no se ve afectado por los óvulos del donante. En su opinión, considera que esta prueba eventualmente se utilizará como una prueba de diagnóstico independiente para la detección prenatal y reemplazará al examen del suero materno por completo? O será simplemente un complemento de los procedimientos de detección actuales? Barry Hoffman: No hay duda de que el PPNI del ADN fetal de células libres en plasma materno es una prueba muy superior al examen de trisomía tradicional que usa biomarcadores bioquímicos y por ecografía. Sin embargo, el primero también es considerablemente más costoso. Es de esperar que los individuos que pueden pagar las pruebas moleculares, ya sea en forma privada o a través el seguro, recurrirán a esta como la prueba inicial. Sin embargo, resulta poco probable que los programas de detección prenatal financiados por el gobierno tengan los fondos para pagar la aplicación universal de las pruebas moleculares a todas las mujeres que se someten a una detección prenatal. Una solución neutral en términos de costos a este dilema es la prueba de contingencia, por la cual primero se realiza la detección tradicional y la prueba molecular solo se ofrece a aquellos que tuvieron resultados positivos en la detección. El desempeño de dichos enfoques de detección para esa prueba molecular solamente y la demora de un resultado final serían aceptables si se prestara la atención debida a acelerar las muestras con resultados positivos en la detección inicial a la segunda etapa de la prueba. En Ontario, los análisis financieros preliminares han demostrado que la detección de contingencia es neutral en términos de costos cuando el índice de resultados positivos de la detección inicial tradicional está fijado en el 5%. El valor de corte del índice de resultados positivos puede aumentarse a medida que disminuye el costo de la prueba molecular. Dennis Lo: Para la detección del síndrome de Down en suero materno, considero que la prueba de secuenciación es definitivamente superior y probablemente reemplace el enfoque tradicional eventualmente. Sin embargo, como se analizó anteriormente, en el corto plazo, los gastos relacionados con la prueba de secuenciación la harían quizás más rentable si primero se realizara la detección convencional y luego se derivara a las mujeres clasificadas como de alto riesgo a realizarse las pruebas de secuenciación. Jacob Canick: Espero que la NGS eventualmente se convierta en una prueba de primera línea para todas las mujeres embarazadas. Resulta claro que para las trisomías comunes, la prueba ya tiene un desempeño superior a los métodos actuales de detección prenatal. El índice de detección alcanza el 100% y el índice de resultados falso positivos es considerablemente inferior al 1% con índices de error relativamente bajos. Como prueba de primera línea, el valor diagnóstico de un resultado positivo para el síndrome de Down sería próximo al 50%. Esto significa que uno de cada 2 procedimientos de diagnóstico invasivos daría como resultado la identificación de un feto con síndrome de Down. Los valores diagnósticos serían inferiores para las demás trisomías, dado que su prevalencia en la población es menor. Aún queda la pregunta de las pruebas no informativas originadas por las muestras que tienen, por ejemplo, una fracción fetal muy baja o errores metodológicos, pero a dichos pacientes se les puede ofrecer la detección estándar como alternativa. Mis expectativas respecto de las pruebas de primera línea dependen razonablemente de las mejoras continuas en el rendimiento y el costo que se alcancen durante los próximos años. Dirk van den Boom: El uso del ADN fetal de células libres permite la sensibilidad y especificidad de diagnóstico que pueden superar la detección sérica actual de aneuploidias fetales. Sin embargo, el examen bioquímico en suero materno para detectar indicaciones además de la aneuploidia fetal no podría, en principio, reemplazar el examen del suero materno. Por otra parte, tan importante como lo anterior, aún existirá la necesidad de realizar una evaluación para detectar anomalías congénitas del tubo neural fetal que actualmente la NGS no puede realizar o no realiza. Un artículo del año 2012 publicado en Nature por Fan y cols. y un artículo del año 2012 publicado en Science Translational Medicine por Kitzman y cols. describen la determinación no invasiva hologenómica fetal de sangre materna. Qué implicaciones prevé que se desprenderán de este hallazgo? Clinical Chemistry 59:8 (2013) 1159

10 De qué forma contribuirá esto a las prácticas clínicas actuales? Barry Hoffman: La manipulación dirigida del análisis molecular del ADN fetal de células libres en la circulación materna para una anomalía específica, o incluso un grupo limitado de anomalías, es moderadamente directa en términos de las normas éticas y la práctica clínica actual. A medida que la cantidad de anomalías incluidas en las pruebas moleculares aumente, también lo hará la dificultad en la presentación coherente de los hallazgos al médico que las solicita, el especialista en genética, los padres, el feto (eventualmente) y afines. Sin embargo, la secuenciación no invasiva hologenómica fetal es la prueba abierta definitiva. Sin lugar a dudas es una fascinante obra maestra de la técnica, pero sumamente devastadora, en la medida en que la aplicación clínica de la información requerirá un marco de ejecución completamente nuevo en términos éticos, educativos, técnicos y médicos, ninguno de los cuales aún está en práctica. Implicará tiempo, recursos, nuevos conocimientos y un arduo trabajo alcanzar el máximo potencial de la NGS al nivel hologenómico en la clínica. Dennis Lo: Mediante el uso de un enfoque basado en genotipificación paterna, haploescritura materna y secuenciación de ADN en plasma materno, Kitzman y colegas han confirmado nuestro enfoque y demostrado que el método es escalable y sólido, incluso al aplicarse a un nivel más profundo de secuenciación. El artículo de Fan y colegas también confirmó el concepto general pero presentó la pregunta adicional de si la genotipificación del ADN del padre podría evitarse y si se podrían deducir directamente los alelos fetales paternos heredados que no estaban presentes en el genoma de la madre en los datos de secuenciación del ADN en plasma materno. Estos artículos combinados demuestran la viabilidad de la secuenciación no invasiva del genoma fetal. Si bien este desarrollo es muy fascinante en términos tecnológicos y científicos, podría ser mucho más rentable para las aplicaciones clínicas realizar la secuenciación dirigida del locus genómico seleccionado involucrado en las enfermedades monogénicas comunes en una población particular, como se realizó recientemente. Esto también facilitaría la orientación y reduciría la complejidad ética de la introducción de dichas pruebas clínicamente. Jacob Canick: Ambas publicaciones, que muestran que los genomas fetales y maternos pueden secuenciarse por completo a partir de las muestras de plasma materno, se basan en un estudio preliminar de Dennis Lo y colegas de 2010, que demuestra que los genomas completos de la madre y el feto están presentes en los fragmentos de ADN en la circulación materna y que dichos fragmentos presentan una proporción relativa constante. La implicación de los hallazgos es clara. El potencial aquí es identificar varias de las alteraciones genéticas únicas del feto, heredadas y de reciente formación, sin tener que usar técnicas de muestreo fetal invasivas y riesgosas. El plazo de implementación clínica de estos hallazgos se desconoce actualmente pero 10 años es quizás una estimación razonable. Dirk van den Boom: En forma común a otras tecnologías posiblemente problemáticas en la atención médica, el uso y la implementación deben ir acompañados de las consideraciones éticas adecuadas, así como la validación clínica y analítica apropiadas. Si bien las pruebas actuales se concentran en la detección de las trisomías 21, 18 y 13, un cariotipo no invasivo similar en el nivel de la información a las matrices de hibridación genómicas comparativas realizadas en líquido amniótico están dentro del alcance a medida que las tecnologías de secuenciación evolucionan. El PPNI es extremadamente poderoso y permitirá el diagnóstico de diversas alteraciones que actualmente solo pueden detectarse mediante la obtención de muestras con procedimientos invasivos. Es importante que se aplique esta nueva tecnología para mejorar los resultados sanitarios. Serían de particular interés las enfermedades que permiten el tratamiento en el útero así como la identificación prenatal de enfermedades metabólicas, que podrían permitir ajustes alimentarios al momento del nacimiento, en forma previa a la aparición de los síntomas. Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas a la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e interpretación de estos; (b) redacción o revisión del artículo en relación con su contenido intelectual; y (c) aprobación final del artículo publicado. Declaración de los autores o posibles conflictos de interés: Tras la presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de declaración del autor. Declaraciones o posibles conflictos de interés: Empleo o liderazgo: E.P. Diamandis, Clinical Chemistry, AACC; Y.M.D. Lo, Clinical Chemistry, AACC; D. van den Boom, Sequenom. Papel del consultor o asesor: Y.M.D. Lo, Sequenom. Propiedad de acciones: Y.M.D. Lo, Sequenom; D. van den Boom, Sequenom. Honorarios: No se declara. Financiamiento de la investigación:y.m.d. Lo, Sequenom. Testimonio de expertos: No se declara. Patentes: Y.M.D. Lo, diversas patentes y aplicaciones de patentes en el área del diagnóstico prenatal no invasivo. Otras remuneraciones: Y.M.D. Lo, Life Technologies. Previously published online at DOI: /clinchem Clinical Chemistry 59:8 (2013)