CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Especialización CEBI_E1b Técnicas de análisis en biotecnología

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1 CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Especialización CEBI_E1b Técnicas de análisis en biotecnología Macromoléculas Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio CEBI_E1b_2 :

2 La electroforesis es una técnica para separar o resolver moléculas en una mezcla, bajo la influencia de un campo eléctrico (también llamada movilidad electroforética) Las moléculas en solución, bajo la influencia de un campo eléctrico, migran a una velocidad determinada por la relación carga:masa

3 PAGE: polyacrilamide gel electrophoresis 2 condiciones: nativa y desnaturalizante SDS-PAGE: método para separar proteínas sólo por tamaño SDS: sodium dodecyl sulphate El detergente linealiza las proteínas. Así, poseen la misma carga por masa INDEPENDENCIA CONFORMACIÓN ESPACIAL

4 SDS: estructura y función - Detergente aniónico desnaturalizante - Rompe interacciones hidrofóbicas y cubre la superficie de la proteína - Enmascara las cargas positivas con sus cargas negativas - No rompe puentes disulfuro inter o intra- catenarios Se agrega aprox. 1,5 g / g de proteína

5 Tratamiento de la muestra a sembrar: Además del agregado del SDS, la muestra puede ser calentada a 9598 C durante 3-4 minutos, en presencia de DTT (ditiotreitol) o 2mercaptoetanol, que contribuyen a desnaturalizar las proteínas reduciendo enlaces disulfuro y rompiendo estructuras terciarias (plegamientos) y cuaternarias (asociaciones de subunidades). Recordatorio: este método no se utiliza cuando es necesario mantener la estructura nativa de la proteína para otros análisis, o para sacar algún tipo de conclusión comparativa.

6 Por lo tanto, las proteínas en la muestra: Sólo presentan estructura primaria (linealizadas). Serán más largas cuanto mayor sea su masa. Tienen carga neta negativa, por lo que migrarán al polo positivo cuando se las someta a un campo eléctrico. Las proteínas no presentan diferencias en cargas (todas tienen la misma tendencia a acercarse al polo positivo con la misma fuerza) y no presentan diferencias espaciales en su conformación. Resta poner las proteínas en un ambiente que las separe por tamaño, una estructura tridimensional en forma de red o esponja con un determinado tamaño de poro.

7 Entonces, un esquema de lo que sucederá... s-s SDS, calor Proteínas con SDS +

8 Pasos: 1) Preparación del gel y de la muestra (en paralelo) 2) Corrida del gel Requiere conocimiento previo 3) Revelado de las proteínas en el gel, mediante el método de tinción Dependerá del uso

9 Técnica: enlaces interesantes: Como preparar un gel (How to Make an SDS-PAGE gel) Como correr un gel (How to Run an SDS-PAGE gel) Como realizar la tinción (How to Stain an SDS-PAGE gel)

10 Poliacrilamida: polímero de acrilamida. Se produce un gel cuyo tamaño de poro puede regularse cambiando las proporciones de acrilamida y bisacrilamida utilizadas en el momento de la preparación de la mezcla y la polimerización. El gel no es sólido, sino que presenta túneles, poros y una forma de red tridimensional de fibras.

11 Estructuras involucradas en la polimerización: t

12 La polimerización de la acrilamida inicia con la adición del persulfato de amonio (PSA), que forma radicales libres al ser disuelto en agua: El TEMED funciona como agente catalítico adicional para la polimerización. Además, acelera la formación de radicales sulfato.

13 El radical inicia al polimerización de la acrilamida. Sólo se forma un gel rígido cuando se adiciona la bisacrilamida a la mezcla, uniendose así cadenas de poliacrilamida adyacentes.

14 La cantidad de bisacrilamida adicionada es la que controla el grado de entrecruzamiento, y por lo tanto, el tamaño de poro. IMPORTANTE: el efecto del tamaño de poro es OPUESTO al que normalmente se verifica en cromatografía. Si bien en ambos casos las proteínas grandes presentan dificultad para entrar por los poros, en cromatografía eluyen rápidamente. En electroforesis, eluyen lentamente ya que al no entrar facilmente en el gel, el transporte producido por la corriente eléctrica es dificultoso. El tamaño de poro no es simple de controlar como suele serlo en las resinas utilizadas en cromatografía.

15 Las proteínas desnaturalizadas por SDS ingresarán todas al mismo tiempo, y al ser sometidas a un campo eléctrico migrarán al polo positivo. Las moléculas más chicas avanzarán más rápido dentro de la red tridimensional. Por lo tanto, se obtiene un método para separar proteínas por tamaño (masa), independientemente de su conformación tridimensional.

16 Resultado de la corrida: líneas o bandas? En una muestra que contiene sólo una proteína de una secuencia y tamaño determinados, tendremos miles de copias de la misma molécula. Cada una de estas copias recorrerá el gel por diferentes caminos, siendo algunas retenidas durante un poco más de tiempo. Esto genera una banda (y no una línea definida) en el gel.

17 Resultado de la corrida: líneas o bandas? De la misma manera, la técnica SDS-PAGE sólo separa proteínas del mismo tamaño. Por lo tanto, proteínas con diferente secuencia de aminoácidos pero de la misma longitud, correrán juntas en la misma banda, sin poder ser identificadas. Como regla general, esta técnica permite separar moléculas cuyos tamaños difieren hasta en un 10 %, y se utilizan markers o ladders con bandas de peso molecular conocidas como referencia en los geles.

18 Los geles de acrilamida se preparan entre dos placas de vidrio transparente. BIORAD

19 Técnica: Requiere preparar los vidrios en posición vertical, utilizando un spacer standard (1 mm por ej). Esto minimiza el contacto del gel con el aire, ya que el O2 inhibe la polimerización por reacción con los sulfatos. Preparar las mezclas de ambos geles (stack y de corrida o resolutivo), sin agregar PSA ni TEMED. BIORAD

20 Técnica (cont.) Agregar TEMED y PSA, en ese orden, sólo al gel de corrida, mezclar por inversión varias veces y volcar entre los vidrios. Antes de que termine de polimerizar el gel de corrida, agregar TEMED y PSA al gel stacking, y también volcarlo entre los vidrios, sobre el gel de corrida. Poner el peine y dejar polimerizar. Antes de cargar las muestras, sacar los peines con cuidado y lavar los wells con buffer de corrida.

21 La resolución de los geles depende de las cantidades agregadas para la preparación de la mezcla, y se expresa en % de acrilamida (geles de 10, 12, 15%, etc). Para geles de 10% o menos, se usa un gel de stacking de 4%, mientras que para geles mayores al 10%, es recomendable un stacking de 6%. Los geles stacking son laxos para permitir que todas las proteínas corran libremente, hasta encontrarse con el gel de corrida, que es mucho más denso. Esto hace que todas las proteínas de la muestra se encuentren en la misma línea de partida cuando comienzan a correr por el gel de corrida o resolutivo.

22 Se presentan mezclas standard para geles de corrida o resolutivos. El ph del buffer es 8, % 17.5 % 13.5 %

23 Mezcla standard para gel de Solución para la muestra (5X): tiene stacking de 4,5%. El ph del buffer azul de bromofenol para indicar el es 6,8 frente de la corrida y como indicador de ph, y glicerol para darle mayor densidad que el buffer al momento de la siembra en la calle. El azul de bromofenol tiene carga positiva en ph > 4,6, por lo que corre delante de todas las proteínas.

24 Buffer de corrida: es el buffer con el que se llena la cuba y en el que se sumerge el gel. Para una cuba standard de Bio Rad (Protean II) son necesarios 500 ml de una solución del buffer anterior 1X, por lo que deberán diluirse 50 ml del Buffer 10X en agua destilada o milliq. Se corren los geles a 200 volts constantes, hasta que el azul del frente de corrida llegue al borde inferior del gel. Son unos minutos. La progresión de la corrida puede monitorearse también utilizando markers coloreados.

25 Luego de la electroforesis, el gel debe ser teñido para detectar las proteínas separadas, o las proteínas transferidas a una membrana para su detección específica posterior (Western blot). Las tinciones mas comunes son Coomassie Blue, PageBlu, o tinción Argéntica (con plata). Recordar que las proteínas se observan como bandas diferentes en el gel, y se utiliza un marcador con proteínas de peso molecular conocido como referencia en una de las calles del gel. La electroforesis en gel es el primer método utilizado para la determinación de pureza en proteínas. Como todo método, puede tener falsos positivos y negativos.

26 El colorante Coomassie Blue es cuantitativo. Puede utilizarse para cuantificar especies diferentes en un gel. Sin embargo, se adhiere con menor afinidad a las proteínas con alto grado de glicosilación. Límite de detección: 100 ng. Se une a las histidinas y aminoácidos aromáticos de las proteínas a detectar. Colorantes comúnmente utilizados: Coomassie Blue R250 (se obtiene mejor resolución), Coomassie Blue G250 (es más sensible), Coomassie Violet R150.

27 Existe también una tinción coloidal de Coomassie Blue, en la cual se usa Coomassie Blue G250 (en lugar de R250) en una solución que también contiene acido fosfórico, sulfato de amonio, y metanol al 20%. Esta tinción es mucho más sensible, aunque no tan cuantitativa como la que utiliza R250. Se recomienda el uso con proteínas de bajo peso molecular, o cuando es necesaria la detección de especies en muy baja concentración. En estos casos también es recomendable aumentar el porcentaje de metanol de los buffers, incluyendo el buffer de transferencia en los Western Blots.

28 La tinción argéntica es muy sensible (detecta impurezas que no se ven por otros métodos) pero no es cuantitativa (tiene diferente afinidad por las distintas proteínas). Límite de detección: 1 ng. El mecanismo químico de la tinción argéntica todavía no se conoce. Es un método muy sensible a suciedad en los vidrios, materiales e impurezas en los reactivos. Hay que trabajar con mucho cuidado, evitar el contacto con el gel y utilizar buffers recién preparados y fríos.

29 PageBlu: solución teñidora de proteínas. Protocolo mucho más simple Más sensible que Coomasie Blue R-250 Única solución. No contiene ác. Acético o metanol Más rápido que CB de Thermo Scientific Útil para Western Blot

30 Tinción PAS específica para glicoproteínas tinción del ácido periódico-schiff-pas para glicoproteínas (Glicoprotein Detection Kit, Sigma) Concentraciones de proteínas entre 1 y 6 mg/ml

31 Tinción PAS Las bandas de proteínas se fijaron al gel de poliacrilamida con ácido tricloroacético al 12,5% (p/v) durante 30 minutos, el exceso de ácido se eliminó por lavado con agua y a continuación los glicanos unidos a la estructura de las glicoproteínas se hicieron reaccionar con ácido periódico al 1% (p/v) en ácido acético al 3% (v/v). El exceso de los iones periodato e iodato se eliminaron lavando con agua (6 veces durante 10 minutos) y a continuación se desarrolló el color por inmersión del gel en el reactivo de Schiff durante 1 h en oscuridad. El gel se decoloró con una solución de Na2S2O5 al 0,5% (p/v) y lavado con agua bidestilada. Benavent, 2007, Tesis Facultad de Ciencias de Madrid

32 Marcadores: muchas opciones en el mercado. Debe cubrir todo el rango de interés. Puede poseer doble utilidad: PAGE y Western blot. de Invitrogen

33 de Thermo Scientific

34 Los geles finalmente son secados, para extraerles la mayor parte de su contenido acuoso. El secado puede hacerse en estufas cerradas, o en secadoras con planchas calientes (80C) y la aplicación de vacío. El secado por aire caliente se realiza en geles contenidos entre dos planchas de celofan, y es ideal para densitometría, escaneado y almacenamiento. La tendencia al quebrado es mucho menor. BIORAD

35 Algunos ejemplos de tinciones...

36 Mas ejemplos...

37 SDS PAGE Gel with MW standards

38 Existen sistemas automatizados para hacer electroforesis de proteínas y ácidos nucleicos, con circuitos capilares microvolumétricos conteniendo una matriz similar a la poliacrilamida. Estos sistemas son automáticos, rápidos, y generan un perfil de absorbancia versus tiempo de cada muestra, similar los picos del HPLC analítico. Luego estos picos son transformados en bandas con la densidad apropiada en un gel virtual emitido por el equipo.

39 Recomendaciones: Utilizar geles SDS-PAGE para determinar pureza en muestras, cuando sea necesaria una cuantificación. Optar por métodos coloidales cuando se busque una proteína de bajo PM. Aumentar el porcentaje de metanol en los buffers de tinción cuando haya que detectar proteínas de bajo PM, para fijarlas mejor. Tricina: su uso es necesario con proteínas pequeñas o péptidos. Muy alta resolución. Más complejos de preparar. Geles mas duros y difíciles de almacenar. Ver protocolo adjunto (Schägger, Nat. Protocols, 2006,1:16)

40 Recomendaciones: Utilizar geles de plata para detectar impurezas en mínima concentración. Se recomienda utilizarlos para el seguimiento y desarrollo de métodos de purificación. No analizar muestras con alta concentración de proteínas. Las cantidades que mejor se observan en geles de Coomassie Blue están entre 200 y 2000 ng. Para geles de plata, entre 25 y 200 ng. No comparar cuantitativamente proteínas con diferente grado de glicosilación.

41 Por lo tanto, el paso n 1 antes de realizar el gel: No analizar muestras con alta concentración de proteínas Determinación de concentración de proteínas Existen varios métodos (Bradford, Lowry, Biuret, etc). Se entrará en detalle más adelante en el curso Conocer el tipo de proteínas para realizar tinciones diferenciales

42 Geles de agarosa Uso más general: separar ADN, o ARN por tamaño Migran hacia el polo positivo porque ya cargadas eléctricamente Proteínas: sii alto peso molecular Aplicaciones: - luego de digestión con enzimas específicas - análisis de productos de PCR De esta forma, separo fragmento linealizados, y la conformación de doble hélice no es un problema

43 Preparación: 0,7 y 2% agarosa. 3% si fragmentos pequeños. Más simple que PAGE

44 Buffers de corrida: - TAE (Tris/ acetate/ EDTA) - TBE (Tris/ borate/ EDTA) - SB (Sodim borate) Tinción: bromuro de etidio (se intercala entre las bases), SYBR Green (Sigma), plata. Revelado: al UV. Comparando intensidad y posición respecto al marcador, puedo cuantificar y conocer el PM, respectivamente

45 Geles de agarosa Protocolo útil: gel: desarrollo de la técnica

46 en geles de agarosa. Esquema

47 Fragmentos de DNA separados en gel de agarosa Ladders (en kb), a) por Enz. Restricc, b) marcadores

48 Geles de agarosa Desarrollos específicos: Sistema de electroforesis por microchip para análisis de ADN/ARN MCE-202 MultiNA (Shimadzu, Biotech- Jenck S.A.) Alta reproducibilidad, detecciones de hasta 6 pb, automatización

49 P St res an tai da ne rd d Sh s ar k Sa lm on Tr ou t Ca tfi sh St ur ge Ac on tin & M yo si n & M yo si n Ac tin St ur ge on Sa lm on Tr ou t Ca tfi sh P St res an tai da ne rd d s Sh ar k Se pueden separar proteínas en geles de agarosa? Myosin Heavy Chain Actin Tropomyosin Myosin Light Chains Myosin Heavy Chain Actin Tropomyosin Myosin Light Chains 10 Poliacrilamida BIORAD Agarosa

50 Estimación del peso molecular (12 mm) 25 (17 mm) 20 (22 mm) 15 (27.5 mm) 10 (36 mm) Size (kd) Distance migrated (mm) BIORAD