IMPLICACIÓN DE DYRK1A, UN GEN CANDIDATO PARA EL SÍNDROME DE DOWN EN LA PATOLOGÍA TIPO ALZHEIMER Y CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS NEUROPATOLÓGICOS Y COGNITIVOS DE PROTOFIBRILLAS CITOTÓXICAS DE PÉPTIDOS DERIVADOS DE PROTEÍNAS AMILOIDES NATURALES EN MODELOS MURINOS DE DYRK1A Investigadores principales: Dra. Mara Dierssen Sotos Centre de Regulació Genòmica Dr. José Ramon Naranjo Orovio Centro Nacional de Biotecnología. Madrid Dr. Salvador Martínez Pérez Institut de Neurociències UMH Duración: 3 años 1
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1. Resumen La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo con una elevada prevalencia en el síndrome de Down (SD), de forma que es un modelo de estados predemenciales de la EA. Sin embargo, todavía se desconocen los factores genéticos y epigenéticos que contribuyen a los trastornos cognitivos de estos pacientes. Dyrk1A es un gen candidato para SD que participa en neurogénesis, diferenciación neural, alteraciones cognitivas y procesos neurodegenerativos. En el núcleo de algunas neuronas del córtex de pacientes con EA se ha observado un incremento de expresión de Dyrk1A, por lo que se podría considerar como un posible factor genético común entre ambas patologías. En este proyecto, nuestro principal objetivo consistió en establecer el papel de Dyrk1A en los procesos cognitivos y neuropatológicos del SD en la EA y en la cascada amiloidogénica. Como objetivo secundario, se estudio la posible acción sinérgica de otros dos genes presentes en el cromosoma 21 (BACE2 y APP) sobre el proceso neurodegenerativo relacionado con la EA. Este es un proyecto multidisciplinario que ha aunado el esfuerzo de expertos en diversas metodologías, como modelos animales, bioquímica, histología o cultivos celulares. 2. Resultados Implicación de Dyrk1A en el proceso neurodegenerativo asociado a la EA El estudio del proceso de envejecimiento en el ratón TgDyrk1A reveló un deterioro neurológico y cognitivo similar al observado en modelos de EA. El deterioro de la marcha es uno de los primeros signos neurológicos del desarrollo de demencia en los pacientes adultos con SD; sin embargo, los signos más notables se refieren al declive de la función cognitiva. Ambos aspectos resultan severamente afectados con la edad en los ratones TgDyrk1A. 3
A nivel neuroquímico se realizó un estudio detallado del sistema colinérgico, relacionado con la retención y la memoria reciente y cuya degeneración es patognomónica en la EA. En los ratones TgDyrk1A el análisis histológico de las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal mostró una acusada pérdida neuronal asociada con la edad. Probablemente, la pérdida de neuronas colinérgicas pueda ser debido a una alteración en el transporte retrógrado de NGF, factor trófico aportado por las regiones diana del sistema colinérgico y necesario para la supervivencia de estas neuronas, y que observamos en la corteza y el hipocampo de los ratones TgDyrk1A (figura 1). Figura 1. Análisis esterológico de las poblaciones colinérgicas en ratones TgDyrk1A jóvenes y viejos Interacción entre Dyrk1A y DREAM como posible mecanismo patogenético Uno de los posibles mecanismos a través de los cuales Dyrk1A podría participar en los procesos neurodegenerativos es a través de la regulación transcripcional. La proteína DREAM- calsenilin-kchip3 es una proteína multifuncional dependiente de calcio, que se expresa principalmente en córtex e hipocampo. DREAM ejerce varias funciones dependiendo de su localización subcelular. En el núcleo, DREAM se une a dominios DRE (Downstream Regulatory Element) para reprimir la transcripción de genes específicos. Con objeto de profundizar en la relación funcional entre Dyrk1A y DREAM, hemos investigado su posible corregulación en modelos transgénicos con sobreexpresión independiente de Dyrk1A o mutantes dominantes activos de DREAM en neuronas. 4
Mediante experimentos de RT-PCR cuantitativa empleando sondas específicas TaqMan hemos cuantificado los niveles de expresión basal de DREAM en varias áreas cerebrales de los ratones transgénicos Dyrk1A. Los resultados muestran una reducción significativa de los niveles de DREAM endógeno en hipocampo y estriado que se corrobora a nivel de proteína (figura 2). Figura 2. Interacción DREAM/Dyrk1A. Panel izquierdo: niveles de proteína DREAM en TgDyrk1A. Panel derecho: RT-PCR cuantitativa de los niveles de Dyrk1A mrna en áreas cerebrales de cinco líneas de ratones transgénicos sobreexpresando distintos mutantes de DREAM Al determinar los niveles de Dyrk1A en ratones que sobreexpresan un dominante activo DREAM con tres mutaciones que los hacen insensibles a calcio y camp, se observa una caída significativa de Dyrk1A en hipocampo, mientras que en corteza los valores son similares a sus respectivos controles (figura 2). Estudio de la citotoxicidad inducida mediante protofibrillas APP y tau Desde hace varios años se ha establecido que moléculas relacionadas con la EA como son APP y tau son sustratos de Dyrk1A, sugiriendo que a través de este mecanismo la sobreexpresión de Dyrk1A podría estar favoreciendo la temprana instauración de EA en los individuos con SD. Uno de los objetivos de este proyecto consistía en inducir patología similar a la EA en nuestro modelo TgDyrk1A empleando protofibrillas citotóxicas derivadas de péptidos amiloides y/o tau, considerando las protofibrillas especies intermedias de las fibras maduras. Los ensayos de citotoxicidad (MTT) se realizaron en cultivos primarios corticales de TgDyrk1A a DIV6 empleando protofibrillas 5
de tau y beta-amiloide obtenidas mediante sonicación. Los cultivos TgDyrk1A mostraron una menor resistencia citotóxica, sugiriendo un incremento en la sensibilidad hacia las especies tóxicas implicadas en la EA debido a la sobreexpresión de Dyrk1A (figura 3, panel izquierdo). Figura 3. Toxicidad de especies intermedias sobre cultivos celulares de ratones TgDyrk1A. Panel izquierdo: estudio de viabilidad en presencia de concentraciones crecientes de protofibrillas Abeta. Panel derecho: efecto de la exposición a protofibrillas sobre la neuritogénesis en cultivos de células PC12. A pesar de que diversos estudios han determinado que las fibras maduras de tau podrían interferir en el proceso de neuritogénesis, el efecto de las especies intermedias no ha sido todavía establecido. Los experimentos iniciales, analizando la morfología de células PC12 transfectadas con EGFP, sugieren que las protofibrillas de tau podrían interferir en el proceso de elongación de las dendritas durante la neuritogénesis (figura 3, panel derecho). Estudio del desarrollo cortical y la implicación de la sobreexpresión de Dyrk1A En una patología neurodegenerativa de las características del SD, es necesario conocer los factores estructurales y funcionales que pueden constituir elementos predisponentes de la neurodegeneración asociada a la edad. Por ello, para entender el proceso neurodegenerativo en el síndrome de Down, resulta relevante el estudio del desarrollo del SNC desde la neuritogénesis hasta la formación de las estructuras cerebrales. El estudio del efecto de la sobreexpresión de Dyrk1A sobre la neuritogénesis realizado en cultivos primarios corticales reveló una menor complejidad dendrítica y una reducción en la longitud de los segmentos terminales axónicos debido este último a un enlentecimiento en la velocidad de 6
crecimiento. La velocidad del crecimiento axónico depende de la efectividad en la interacción entre el citoesqueleto de actina y los microtúbulos. En las neuronas TgDyrk1A, la fracción de microtúbulos aparecía más retraída sin llegar a integrarse en el cono axónico apuntando a una interacción con los filamentos de actina menos efectiva. Estos resultados sugieren que Dyrk1A podría estar actuando sobre proteínas reguladoras de la dinámica del citoesqueleto como la proteína tau, afectando a la reorganización de los microtúbulos con consecuencias en el crecimiento de las ramificaciones durante la neuritogénesis, Por otro lado, el estudio de la densidad sináptica en diferentes edades de cultivo mostró una importante afectación de la sinaptogénesis en las neuronas TgDyrk1A. Estos resultados sugieren una incapacidad en las neuronas TgDyrk1A para el desarrollo total de los contactos sinápticos con implicaciones posiblemente en la correcta conectividad y funcionalidad neuronal. Además, el estudio morfológico de las espinas TgDyrk1A maduras (DIV20) mostró una disgenesia que se caracterizaba por ser más inmaduras y aparecer en menor número, similar al fenotipo observado en las dendritas corticales de individuos con SD. El análisis electrofisiológico de cultivos maduros reveló una significativa reducción en la frecuencia de disparo de las neuronas. Las espinas dendríticas son estructuras inestables sometidas a cambios constantes de morfología en función de la actividad neural y los factores ambientales. Estos cambios estructurales dependen de la reorganización del citoesqueleto de actina, ya que los monómeros de ésta se difunden desde la dendrita para incorporarse a los filamentos de actina presentes en la espina dendrítica. En nuestros cultivos estudiamos la dinámica de la actina en las espinas mediante la técnica de recuperación de la fluorescencia tras exposición intensa al láser (FRAP, fluorescente recovery after photobleaching) con la ayuda de microscopía confocal. Las espinas 7
TgDyrk1A muestran una alteración en la dinámica de la actina en las espinas dendríticas que estaría afectando a procesos asociados a la plasticidad sináptica (figura 4). Los resultados obtenidos en cultivos corticales mostraron que Dyrk1A ejerce un papel relevante en el desarrollo de las neuronas corticales tanto durante la neuritogénesis como en la sinaptogénesis. Sin embargo, era importante determinar si la sobreexpresión de Dyrk1A modifica a su vez el desarrollo y arquitectura cortical in vivo. El estudio morfológico de la corteza en diferentes estadios embrionarios no reveló alteraciones estructurales relevantes en el ratón TgDyrk1A en comparación con el control, indicando un desarrollo morfológico normal de la neocorteza. Sin embargo, a E11.5 en los embriones TgDyrk1A, se observó un incremento de imágenes mitóticas, indicando un aumento de células en proliferación en la región ventricular acompañado de un menor número de neuronas diferenciadas, sugiriendo un retraso en la maduración de esta región. El estudio de la proliferación neuronal en los embriones TgDyrk1A mediante inyecciones de BrdU a la madre gestante, reveló un retraso proliferativo en las etapas tempranas (E12.5) que no se mantenía en estadios posteriores (E14.5). Entre E12.5 y E18.5 se forman las proyecciones córtico-talámicas y tálamo-corticales en el prosencéfalo de los ratones. El hecho de que en el tálamo dorsal a E12.5 se observara una reducción en el número de células proliferativas (BrdU positivas) y de células calbindina positivas, sugería un retraso en el nacimiento de las interneuronas GABAérgicas. Los resultados obtenidos sugieren un retraso en el desarrollo cortical de los animales que sobreexpresan Dyrk1A. Posiblemente el retraso en la proliferación observado tanto en la corteza como en el tálamo estará afectando al establecimiento de las conexiones córtico-talámicas, fundamentales para la correcta integración y procesamiento de la información (figura 5). 8
Figura 5. Proyecciones tálamo-corticales en embriones TgDyrk1A Desarrollo de cortezas cerebrales quiméricas El transplante de progenitores neuronales de ratones transgénicos GFPbeta-actina a E14 en córtex e hipocampo de embriones TgDyrk1A a E14 mostró un gran número de células ectópicas en el hipocampo (CA), sugiriendo que la información posicional o las interacciones celulares que regulan la migración están alteradas por la sobreexpresión de Dyrk1A (figura 6). Figura 6. Progenitores neuronales control integrados en el cerebro de ratones TgDyrk1A 9
Estudio de la neurodegeración en un modelo murino de sobreexpresión de APP y BACE2 Con el fin de conocer el papel que la acción sinérgica de la sobreexpresión de dos genes presentes en el cromosoma 21 podrían tener sobre el proceso neurodegenerativo, se realizó el análisis conductual del modelo transgénico TgAPP/BACE2. La proteína de membrana APP sufre una sucesión de procesos proteolíticos que en condiciones patológicas promueven la producción del péptido beta-amiloide que tiende a acumularse extracelularmente formando las placas seniles patognomónicas de EA. Por otro lado, BACE2 es una secretasa que podría participar en el procesamiento del APP. En nuestro trabajo, no se observó ni deterioro cognitivo asociado a la edad ni diferencias significativas en la cantidad de péptido beta-amiloide presente en hipocampo y corteza de los ratones TgAPP/BACE2. Estos resultados muestran que la sobreexpresión de APP per se no es suficiente para inducir el proceso neurodegenerativo y que posiblemente BACE2, a pesar de estar involucrado en el procesamiento de APP, no estaría implicado en la vía amiloidogénica. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Los datos obtenidos en este proyecto implican a Dyrk1A en la aparición temprana de procesos degenerativos observados en los individuos con SD. Así, la sobreexpresión de Dyrk1A incrementa la vulnerabilidad cerebral al desarrollo de fenómenos patológicos relacionados con la EA, como la degeneración colinérgica o la citotoxidad del péptido amiloide y de las formas hiperfosforiladas de tau. Sin embargo, los fenotipos observados no engloban en su totalidad el cuadro patológico de esta enfermedad, por lo que probablemente Dyrk1A podría estar actuando en sinergismo con otros genes del cromosoma 21 que se encuentren sobreexpresados de manera similar en el SD. Si bien se desconocen las causas que desencadenan la precocidad en la aparición de los signos patológicos de la EA en las personas con SD, el hecho de que se trate de un cerebro previamente alterado podría hacerlo más vulnerable y sensible a los mecanismos 10
patológicos. En este trabajo se ha demostrado que Dyrk1A no sólo tiene un papel relevante durante la etapa adulta, sino que a nivel embrionario participa en procesos de neuritogénesis, sinaptogénesis y establecimiento de conexiones corticales. El conjunto de estas evidencias convierten a Dyrk1A en una molécula a tener en cuenta a la hora de establecer nuevas estrategias terapéuticas. Así, la actuación sobre su expresión y/o actividad podría modular parte de los procesos patogénicos de la EA en los individuos con SD. De hecho, hemos iniciado un primer ensayo clínico piloto con tratamiento con un inhibidor de Dyrk1A, la epigalocatequina del té verde con el fin de mejorar la función cognitiva a través de la normalización de la actividad de Dyrk1A. 4. Publicaciones Benavides-Piccione R, Dierssen M, Ballesteros-Yáñez I, Martínez de Lagrán M, Arbonés ML, Fotaki V, DeFelipe J, Elston GN. Alterations in the phenotype of neocortical pyramidal cells in the Dyrk1A+/- mouse. Neurobiol Dis. 2005, 20: 115-22. I.F. = 4.518 Ferrer I, Barrachina M, Puig B, Martínez de Lagrán M, Martí E, Avila J, Dierssen M. Constitutive Dyrk1A is abnormally expressed in Alzheimer disease, Down syndrome, Pick disease, and related transgenic models. Neurobiol Dis. 2005, 20: 392-400. I.F. = 4.518 Martinez de Lagran M, Bortolozzi A, Millan O, Gispert JD, Gonzalez JR, Arbones ML, Artigas F, Dierssen M. Dopaminergic deficiency in mice with reduced levels of the dual-specificity tyrosine-phosphorylated and regulated kinase 1A, Dyrk1A(+/-). Genes Brain Behav. 2007, 6: 569-78. I.F. = 3.795 11
Arqué G, de Lagrán MM, Arbonés ML, Dierssen M. Age-associated motor and visuo-spatial learning phenotype in Dyrk1A heterozygous mutant mice. Neurobiol Dis. 2009, 36: 312-9. I.F. = 4.518 Dierssen M, Herault, Y, Estivill, X. Aneuploidy: from a Physiological Mechanism of Variance to Down Syndrome. Physiol Rev. 89: 887-920, 2009. I.F. = 37.726 Lott IT, Dierssen M, Down syndrome: Neurological Complications and Cognition. The Lancet Neurology, 2010, 9: 623-33. I.F. = 18.126 Fillat C, Dierssen M, Martinez de Lagran M, Altafaj X. Insights from Mouse Models to Understand Neurodegeneration in Down Syndrome. CNS & Neurolog Disord-Drug Targets, 2010, 9: 429-38. I.F. = 3.571 Azkona G, Levannon D, Groner Y, Dierssen M. In vivo effects of APP are not exacerbated by BACE2 co-overexpression: behavioural characterization of a double transgenic mouse model. Amino Acids. 2010, 39: 1571-80. Azkona G, Amador-Arjona A, Obradors-Tarragó C, Varea E, Arqué G, Pinacho R, Fillat C, de la Luna S, Estivill X, Dierssen M. Characterization of a mouse model overexpressing BACE2 reveals a new role for BACE2. Genes Brain Behav, 2010, 9: 160-72. I.F. = 3.795 Toiber D, Azkona G, Ben-Ari S, Torán N, Soreq H, Dierssen M. Engineering DYRK1A overdosage yields Down syndrome-characteristic cortical splicing aberrations. Neurobiol Dis. 2010, 40: 348-59. I.F. = 4.518 12
Martínez de Lagrán Benavide-Piccione R, Ballesteros-Yanez Y, Calvo M, Morales M, Fillat C, De Felipe J, Ramakers GJ, Dierssen M, Single overexpression of Dyrk1A recapitulates the dendritic abnormalities of Down syndrome patients. (Submited to Cerebral Cortex) I.F. = 6.979 Basson MA, Echevarria D, Petersen Ahn C, Sudarov A, Joyner AL, Mason IJ, Martinez S, Martin GR. Specific regions within the embryonic midbrain and cerebellum require different levels of FGF signaling during development. Development, 2008, 135, 889-898 I.F. = 7.194 Perez-Balaguer A, Puelles E, Wurst W, Martinez S. Shh dependent and independent maintenance of basal midbrain. Mechanisms of Development 2009, 126: 301-313 I.F. = 2.827 Moreno-Bravo JA, Perez-Balaguer A, Martinez S, de Puelles E. Dynamic expression patterns of Nkx6.1 and Nkx6.2 in the developing mes-diencephalic basal plate. Developmental Dynamics 2010, 239:2094-2101 I.F. = 2.833 13