Efectos biológicos de las quinasas VRK en cáncer de mama en función de los fenotipos HER2/erbB2 y Receptor de estrógeno

Transcripción

1 Convocatoria de Ayudas a la Investigación en Cáncer de Mama Fundación Sandra Ibarra de Solidaridad frente al Cáncer MEMORIA FINAL DEL PROYECTO Efectos biológicos de las quinasas VRK en cáncer de mama en función de los fenotipos HER2/erbB2 y Receptor de estrógeno Investigador responsable Pedro Alfonso LAZO-ZBIKOWSKI TARACENA SALAMANCA Febrero 2010

2 Resumen del proyecto El cáncer de mama desde un punto de vista de su pronóstico y estrategias terapéuticas se decide en base fundamentalmente a dos marcadores, el receptor de estrógeno y/o progesterona, o el receptor erbb2 (HER2). El primero es un indicador de mejor pronóstico pues permite la utilización de terapias basadas en inhibidores específicos con los antiestrógenos (tamoxifeno o derivados más recientes). Por otra parte los tumores de mama erbb2 positivos son de más difícil manejo clínico. Nuestro laboratorio identifico en los últimos años una nueva familia de proteínas humanas, VRK, que son moduladoras de las rutas de señalización por MAP-quinasas, las cuales son un elemento en la señalización de erbb2. Nuestro estudio en cáncer de mama nos han permitido identificar una correlación inversa entre niveles de erbb2 y VRK lo que sugiere una interacción funcional entre estas dos rutas. En este proyecto utilizando diversas técnicas moleculares hemos podido identificar que la proteína VRK2 controla el nivel de activación de transcripción de elementos de respuesta a suero (SER) en respuesta a factor de crecimiento epidermal (EGF) o su receptor que está sobreexpresado en cáncer de mama. Altos niveles de VRK2 inhiben la señal, y bajos niveles la permiten. Se ha realizado un análisis sistemático de la ruta de señalización para identificar el posible mecanismo de acción. VRK2 inhibe la respuesta transcripcional no solo de ErbB2, sino también de oncogenes activados como Ras G12V (común a muchos carcinomas) o B-Raf V600E (característica de melanoma). Hemos identificado que VRK2 bloquea la señal por medio de una interacción directa con una proteína de ensamblaje, KSR1, que es común a todos los elemento de la ruta. Este efecto afecta a la ruta de respuesta a factores de crecimiento o mitogénica, pero no a la ruta de supervivencia. De este modo en tumores ErbB2 positivos, altos niveles de VRK2 frenarían su expansión y esta es probablemente la razón de su regulación negativa en estos tumores. En el mismo trabajo hemos identificado una correlación positiva con ER, que identifica un subgrupo de peor pronóstico y que será objeto de un futuro estudio. VRK2 permite identificar subgrupos de pacientes con cáncer de mama, a partir de los marcadores ya utilizados, pero su significación clínica necesita de un seguimiento clínico de varios años. RESULTADOS Correlación inversa entre la proteína VRK2 y erbb2 en cáncer de mama humano Como punto de inicio se determino la posible correlación de los marcadores de cáncer de mama con utilidad clínica como ErbB2, receptor de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PR) con las proteínas de la familia VRK, en este trabajo nos centramos en la proteína VRK2. Se estudió una serie de 136 carcinomas de mama por inmunohistoquímica. El análisis reveló una correlación inversa entre los niveles de VRK2 y el receptor ErbB2 (Figura1). 2

3 FIGURA 1. Correlación inverasa entre los niveles de erbb2 y VRK2 en 126 casos de cácer de mama. A-izda. casos ErbB2 positivos. A-Dcha. casos ErbB2 -.nverse correlation between VRK2 and ERBB2 in human breast carcinomas. B. Diferencia en al distribución de casos. Los niveles altos de VRK2 bloquean la señal de respuesta a oncogenes Para determinar si VRK2 afecta a señalización por rutas de MAPK, se utilizó como sistema reportero el promotor de respuesta a suero (SER) unido a luciferasa. Las células fueron estimuladas con factor de crecimiento (EGF), ErbB2 (oncogén sobreexpresado en cáncer de mama), RasG12V (la mutación más frecuente en cáncer), RafV600E mutación en melanomas) y una construcción de MEK activa constitutivamente. Estas proteínas se utilizaron porque representan los pasos consecutivos en la ruta de señalización que activa al elemento de respuesta a suero. La sobrexpresión de VRK2 inhibe la activación de transcripción por cualquiera de estas proteínas de manera que es dosis dependiente (Fig.2). Esto indica que VRK2 controla esta ruta de señalización celular actuando a través de un paso localizado casi al final de la misma. Si solo se hubieran afectados los primeros, pero no los últimos indicaría que actúa a un nivel más próximo al receptor. Esta localización del sitio de actuación es importante pues indica que puede ser relevante en tumores de diferentes tipos y no sólo en cáncer de mama. 3

4 FIGURA 2. La activación de transcripción por elementos SRE indicudo por los oncogenes ERBB2, RAS and RAF oncogenes es inhibida por VRK2A de una manera dosis dependiente. overexpression to oncogenic ErbB2 (A), H-Ras G12V (B left), B-Raf V600E (C) and constitutively-active MEK1(D) in MCF7 cells. This effect is independent of VRK2A kinase activity as shown in B, where a kinase-dead VRK2A K169E also inhibits H-Ras G12V activation (B, right). * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 (unpublished). The expresion of different proteins is shown in immunoblots at the bottom. Efecto de VRK2 sobre las rutas de señalización en respuesta a los oncogenes ErbB2 o Ras La ruta de señalización iniciada en ErbB2 puede tras un tramo común divergir hacia las rutas mitogénicas de MAPK, de supervivencia como AKT o pleiotrópicas como RSK. Alto nivel de VRK2 en presencia de estos oncogenes no afecta a la ruta de AKT, ya que no se detectan cambio en su fosforilación (Fig. 3). Sin embargo la sobrexpresión de VRK2 reduce la fosforilación de P-erk, y de uno de sus dianas RSK (Fig. 3). VRK2 no afecta a la fosforilación de MEK1. Estos resultados indican que VRK2 está actuando entre las quinasas MEK1 y ERK1 (Fig. 3), bloqueando la transmisión de la señal entre ambas y así se puede explicar la inhibición de la activación transcripcional descrita en la sección anterior. 4

5 Figure 3. Efecto de VRK2 sobre diferentes proteínas en repuesta a los oncogenes ERBB2 y RAS- G12V. Se determino por immunoblot el estado de fosforilación de proteínas consecutivas en la ruta de señalización, o de otras proteínas (myc y cyclin D1) como controles. Bajos niveles de VRK2 incrementan la respuesta a EGF El efecto de VRK2 sobre la respuesta transcripcional mediada por serum-response element fue determinada en líneas celulares de mama. Primero demostramos que la estimulación por EGF es inhibida de manera dosis dependiente por cantidades crecientes de VRK2 (Fig.4A). Para determinar si la eliminación de VRK2 produce el mismo efecto que predice su sobreexpresión, la proteína VRK2 endógena fue casi totalmente eliminada por medio de knockdown usando sirna específicos. Como se muestra en la Figura 4B, la eliminación o bajada de niveles de VRK2, permite una mayor señalización en respuesta a EGF. Esto es lo que parece estar ocurriendo en los casos de cáncer de mama con bajo nivel de VRK2. 5

6 Figura 4. A. Inhibición de la respuesta transcripcional a EGF por medio de dosis crecientes de VRK2. B. Incremento de la respuesta transcripcional a EGF por eliminación por RNA de interferencia específico para VRK2. VRK2 por su interacción con la proteína scaffold KSR1 interfiere con la señalización por MAPK. El mecanismo por el que actua VRK2, se situa entre las quinasas MEK1 y ERK1. Esto indica que un candidato importante puede ser una de las proteínas de ensamblaje de complejos de señalización por MAPK. Primero determinamos si la respuesta a EGF era afectada por dos de estas proteínas, JIP1 y KSR1. La eliminación de JIP1 no afecta a la respuesta, pero la eliminación de KSR1 hace que la célula no responda al factor de crecimiento (Figure 5A). En base a esto comprobamos que la activación en caso del control seguía siendo sensible a la sobreexpresión de VRK2, pero no en el caso de KSR1, pues la respuesta ya se ha eliminado previamente (Fig. 5B). El siguiente paso consite en demostrar que VRK2 es capaz de interaccionar con componentes del complejo de señalización ensamblado en KSR1. Para ello se utilizaron ensayos de pulldown o inmunoprecipitación. Primero demostramos que VRK2 es capaz de interaccionar directamente con KSR1, tanto transfectado como endógeno(figura 5C). Asímismo demostramos que VRK2 interacciona con MEK1 (Figure 5D), pero no con ERK1. Estos resultados nos sugieren que la triple interacción KSR1-MEK1-VRK2 impide la fosforilación de ERK, previniendo su activación y el efecto sobre transcripción de este. 6

7 Figure 5. A. La perdida de la scaffold KSR1 (derecha), pero no JIP1 (izda.) bloquea la activación de transcripción en respuesta a EGF. B. VRK2 bloquea la activación de transcripción (izda.), pero si se elimina KSR1, ya no puede hacer su efecto (dcha.). C. VRK2 interacciona con KSR1 transfectada (izda.) o endógena (dcha.). D. VRK2 interaciona con MEK1. NOTA Los resultados de este trabajo serán enviados a publicar próximamente y se enviará una copia de la misma a la Fundación cuando esté disponible públicamente. En los trabajos resultantes se agradece la contribución realizada por la Fundación. 7