ENTRADA DEL VIRUS D IMMUNODEFICIÈNCIA A LA CÈL LULA DIANA I CARACTERÍSTIQUES FISICOQUÍMIQUES DE LA MEMBRANA CEL LULAR Investigador principal: Dr. Josep Cladera Cerdà Centre: Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona Durada: 3 anys MEMÒRIA FINAL 1. Resum L entrada del virus d immunodeficiència humana en la cèl lula hoste implica, a partir del reconeixement del receptor CD4 de la membrana cel lular per part de la proteïna gp120 de la membrana vírica, una sèrie de canvis conformacionals que finalitzen amb la interacció de la proteïna gp41, associada de manera no covalent amb la gp120, amb la membrana cel lular. Aquesta interacció té lloc a través de l extrem aminoterminal de la proteïna gp41, una part de la seqüència coneguda com a pèptid de fusió. El canvi conformacional de la gp41 i la interacció del pèptid de fusió amb la membrana cel lular són els esdeveniments desencadenants dels processos d acostament i fusió de les membranes vírica i cel lular, que constitueixen el mecanisme d entrada del VIH en la cèl lula hoste. El 1
coneixement dels aspectes moleculars de la interacció del pèptid de fusió amb la membrana cel lular resulta, per tant, essencial a l hora de descriure com entra el virus a la cèl lula i a l hora d establir estratègies destinades a evitar aquesta entrada. El projecte de recerca estava orientat a la caracterització molecular de la interacció pèptid de fusió-membrana biològica, parant especialment esment en la importància de les característiques fisicoquímiques de les membranes, entre les quals destaquen la presència d un important potencial electrostàtic en la interfície lípid-aigua, el potencial dipolar de membrana, i la presència de polímers carregats negativament (proteoglicans) a la superfície de la membrana. El projecte es plantejà a partir de la utilització de seqüències peptídiques sintètiques representatives del pèptid de fusió i de membranes model (liposomes), com també de tècniques biofísiques altament complementàries: el marcatge fluorescent de membranes amb sensors dels potencials de superfície i del potencial dipolar per tal de seguir la unió del pèptid a la bicapa; la realització d experiments de transferència d energia per ressonància (FRET) per al seguiment del procés de fusió de membranes; i la utilització de l espectroscòpia d infraroig amb transformada de Fourier (FTIR) per al seguiment dels canvis conformacionals del pèptid i l estat d hidratació de la superfície de la bicapa lipídica. Les tècniques aplicades havien de permetre l obtenció de dades cinètiques que permetessin una descripció de la dinàmica dels processos d unió del pèptid a les membranes, de canvi conformacional i de fusió. 2. Resultats Interacció dels pèptids de fusió de la proteïna gp41 del VIH amb membranes: un estudi resolt en el temps de la unió del pèptid a les membranes, el procés de fusió i els canvis conformacionals (Biochemsitry 2005, 44, 13354-13364) 2
La interacció del pèptid de fusió de la proteïna gp41 del VIH amb la membrana de la cèl lula diana desencadena el procés de fusió de membranes que permet l entrada del virus a la cèl lula. Molts estudis sobre la interacció del pèptids de fusió amb membranes biològiques existents en la bibliografia s han dut a terme utilitzant pèptids sintètics i membranes biològiques. A causa de la varietat de sistemes experimentals i seqüències, a l hora d abordar els estudis projectats hi havia una certa controvèrsia quant al tipus d estructura que adoptaria el pèptid en el moment de desencadenar el procés de fusió: hèlix α o estructura β. Amb l objectiu de contribuir a resoldre la controvèrsia vam fer una sèrie d experiments sobre la interacció de les seqüències peptídiques més representatives amb membranes model en unes mateixes condicions experimentals. Les cinètiques del procés d unió dels pèptids a les membranes s han comparat amb les cinètiques del procés de fusió i amb les cinètiques dels canvis conformacionals detectats durant la interacció dels pèptids amb les membranes. Els resultats mostren que els pèptids de fusió, els quals adopten una estructura monomèrica i no ordenada en DMSO, el medi on es preparen les suspensions de pèptid, formen en entrar en contacte amb el medi aquós d una suspensió de membranes, uns agregats que contenen una barreja d estructures helicoïdals i estructures β. Les membranes model, un cop el pèptid s hi uneix, afavoreixen la formació de més estructura β d agregació. La formació d aquestes estructures β precedeix l inici del procés de fusió de membranes. Els resultats obtinguts han permès arribar a la formulació següent de l esquema cinètic dels processos: FP DMSO FP agw (k app 10-2 s -1 ) FP agw + M FP β M (k app 10-3 s -1 ) 2 FP β M FP β M F (k app 10-4 s -1 ) 3
on FP DMSO és el pèptid de fusió dissolt en DMSO (estructura secundària no ordenada), FP agw és el pèptid de fusió formant agregats (barreja d estructura helicoïdal, β i no ordenada) en aigua, M és la membrana, FP β M és el complex format quan els agregats formats en aigua interaccionen amb les membranes, i FP β M F és el complex pèptid membrana després que el procés de fusió ha tingut lloc. L esquema cinètic anterior està esquematitzat en la figura 1 i en l animació que es presenten a continuació. Figura 1. Seqüència d esdeveniments moleculars en la interacció del pèptid de fusió del VIH amb membranes biològiques model. [animació] Feu doble clic sobre la icona. Un cop s obri l arxiu, feu un sol clic per iniciar l animació. Seqüència d esdeveniments: unió dels agregats peptídics (formats en medi aquós) a la membrana, canvi estructural (formació de més estructura β), deshidratació de la interfície aigua-lípid, contacte entre membranes, fusió de membranes, micrografia electrònica on es veuen les membranes model fusionant-se. (durada 14 segons.) 4
Efecte del colesterol en la interacció del pèptid de fusió de la proteïna gp41 del VIH amb membranes model. Importància del potencial dipolar de membrana. (Biochemistry 2006, 45, 15768-15775.) La fusió entre les membranes viral i cel lular és un esdeveniment clau en el procés pel qual el VIH entra en la cèl lula diana. La fusió de membranes es veu facilitada per la interacció de la proteïna viral gp41 amb la membrana cel lular. Utilitzant pèptids sintètics i membranes model, hem determinat en el treball descrit anteriorment que la seqüència d esdeveniments moleculars implica la unió del pèptid a la membrana, seguida d un canvi conformacional (transformació d estructures desordenades i helicoïdals en estructures β agregades que precedeix la barreja de lípids [fusió de membranes]). En aquest treball es va acarar d una manera sistemàtica la determinació de la influència del colesterol (abundant en la membrana viral) en la seqüència d esdeveniments que duen a la fusió de membranes. A més del conegut efecte sobre la fluïdesa de la membrana, el colesterol pot afectar un paràmetre físic menys conegut: el potencial dipolar de membrana. Aquest potencial electrostàtic és generat a la interfície agiua-lípid pels dipols elèctrics presents en les molècules de lípids. Utilitzant el sensor fluorescent del potencial dipolar de membrana, di-8-anepps, juntament amb altres tècniques biofísiques (espectroscòpia d infraroig, marcatge fluorescent de membranes model amb FPE i transferència d energia per ressonància) hem demostrat que el colesterol incrementa l afinitat dels pèptids de fusió per les membranes model i tot i que disminueix l extensió del procés de fusió, augmenta la seva velocitat. La influencia del colesterol en l afinitat del pèptid i en la velocitat del procés de fusió ve donada pel seu efecte en la magnitud del potencial dipolar de membrana, mentre que l extensió del procés de fusió i els efectes en els canvis conformacionals que té el pèptid en interaccionar amb les membranes, semblen dependre d altres paràmetres 5
fisicoquímics associats a la membrana, com la fluïdesa i el grau d hidratació. POTENCIAL DIPOLAR (? D ) Unió del FP a Membranes Velocitat Barreja de Lípids Extensió Barreja de Lípids Canvi Conformacional del FP Aspectes de la interacció del pèptid de fusió del VIH dependents de la influència del colesterol en el potencial dipolar (esquerra). 3. Rellevància i possibles implicacions clíniques dels resultats finals obtinguts Els resultats obtinguts són, a un nivell fonamental, una contribució a la caracterització dels mecanismes moleculars que utilitza el VIH per entrar en la cèl lula hoste. El coneixement d aquests mecanismes és important a l hora d afrontar l estudi de fàrmacs destinats a bloquejar l entrada del virus a la cèl lula. Tot i que els estudis s han dut a terme utilitzant sistemes model (pèptids sintètics i membranes model) i que això fa que l extrapolació dels resultats al sistema virus-cèl lula sigui molt difícil, els coneixements adquirits són una informació que cal tenir en compte a l hora de considerar com interacciona el virus amb la membrana cel lular. 6
4. Publicacions Buzón, V., Padrós, E., Cladera, J. (2005) Interaction of Fusion Peptides from HIV Gp41 with membranes: A Time- Resolved, Membrana-Binding, Lipid Mixing and Structural Study. Biochemistry 44(40):13354-64. Buzón, V and Cladera, J. (2006) Effect of cholesterol on the interaction of the HIV Gp41 fusion peptide with model membranes. Importance of the membrane dipole potential. Biochemistry 45, 15768-15775. 7