TP Bioinformática Autores: Máximo Rivarola, Ana Julia Distéfano, Paula Fernández, Norma Paniego, Sergio González Instituto de Biotecnología, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA), INTA-Castelar NCBI - BLAST 1. Uso de Entrez 1. Utilizando Entrez, encuentra cuantos genes humanos tienen un dominio WAP. Tipear human [orgn] AND WAP domain (23 entradas) 2. Acotar la búsqueda para encontrar cuantas proteínas con este tipo de dominio están localizadas en el cromosoma 20. Usar el buscador en la página principal de Entrez y tipear: 20 [chr] AND human [orgn] and WAP domain. Hay 16 entradas clasificadas como genes. 2. NCBI - BLAST Estamos trabajando con el cdna AF217525. Utiliza Entrez para obtener la secuencia FASTA y encontrar la siguiente información: 1. Cuál gen está codificado por este cdna? DSCAM gene, mol de adhesión en Síndrome de Down 2. Cuántos aminoácidos tiene la traducción? 2012 aa AF217525_1 3. Cuáles son los IDs de cada posible transcripto de este gen y confirmar si fueron manual o automáticamente curados (NM o XM)?. Que variante contiene el cdna AF217525? NM_001389 y NM_001271534, NM indica que fue curado manualmente. La variante que contiene al cdna es NM_001389. 4. Qué dominios Pfam contiene la proteína? Para ver el dominio en Entrez clickear en el link del dominio conservado bajo la proteína refseq (pfam07679) 5. Utilizando NCBI, ejecute 2 nucleotide Blast con la secuencia RefSeq NM_001389 contra la base de datos human genomic + transcript: primero utilizar los parametros por default, luego destildar opcion mask for look up table only Existe diferencia entre ambos resultados? Cambia el resultado si se aplica o no el low complexity filter? La aplicacion o no de los distintos parmetros modifica el funcionamiento del blast en la consideracion o no de regiones de baja complejidad para en distintas fases del alineamiento.
Galaxy UCSC Browser Introducción: En este Trabajo Practico veremos como es un análisis típico de un bioinformático. En el caso de obtener una gran cantidad de datos, como sucede con las tecnologías NGS, la terminal de Linux es requerida! Sin embargo, existen otras posibilidades para analizar tus datos de manera similar. Ahora te mostraremos como se hace un trabajo bioinformático con una herramienta mucho mas amigable. La herramienta se desarrollo en la Universidad de Estatal de Pensilvana (Penn State) y el programa se llama Galaxy (Blankenberg et al. 2007, PMID 17568012). Luego te mostraremos como visualizar una inmensa cantidad de datos, públicos o propios, en un visualizador de Genomas. El UCSC Genome browser (Kent et al., The human genome browser at UCSC. Genome Res. 2002 Jun;12(6):996-1006). Información sobre Galaxy: Galaxy Penn State s Galaxy is a useful way of wrapping many command line modules together in a user-friendly GUI. When logged in, you can save your workflow and execute the entire workflow on a new dataset without manually executing each individual step. You can also easily share these workflows with others. Figura 1. Algunos Iconos de Galaxy explicados Nota de los datos usados en este TP: Este set de datos es solo una pequeña parte de los verdaderos resultados, se utiliza esta cantidad de datos por razones practicas de tiempo y uso de computadora.
Comenzamos el Trabajo Practico: 1. Abrir el explorador de internet de tu PC e ir a: https://main.g2.bx.psu.edu/ 2. Registrarse: Clic en User, luego en Register en la barra superior. 3. Subir Archivo que utilizaremos para trabajar: Solapa Get Data: ejecutar Upload File. Ejercicio 1. Crear un archivo con la información de cada SNP obtenido por los reads alineados al genoma humano. El archivo de entrada (.fq) es un FASTQ que contiene la secuencia de ADN mas su calidad en cada posición. (El resultado va ser SNPs ubicados en el gen humano BRCA1 ubicado en el cromosoma 17). Primero, veamos el archivo fastq (fq) y luego alineamos al genoma humano: 1. Solapa NGS: QC and manipulation: 1. Ejecutar FastQC Read QC: run on the BRCA1reads.fq. Que muestran las figuras generadas? 2. Ejecutar FASTQ Groomer: run on the BRCA1reads.fq (Sanger quality output). Cuantas secuencias teniamos antes y después de ejecutar FASTQ Groomer? 2. Solapa NGS: Mapping: Ahora vamos a alinear contra el genoma humano. 1. Ejecutar Map with Bowtie for Illumina. Usamos un programa que mapea (alinea rápido) usando el programa Bowtie con los reads del output: FASTQ groomed data. El genoma que usaremos para mapear sera el hg19 (versión 19 del genoma humano). El resto de parámetros los dejamos como están. 2. Cuantos reads se mapearon? Que porcentaje de los reads se alineo? Para poder saber las estadísticas del resultado de Bowtie, realizaremos lo siguiente: Vamos a solapa NGS: SAM Tools: Utilizamos el programa SAM-to-BAM : El input de este programa es el output de Bowtie. El output de sam-to-bam es luego utilizado por el programa flagstat que nos da las estadísticas del mapeo. 3. Verifiquemos el archivo de mapeo a ver si encontramos SNPs 1. Solapa NGS: SAM Tools: programa Generate Pileup : El input es el archivo de salida
de sam-to-bam, el archivo BAM. Aquí creamos el archivo pileup que contiene el detalle de las variantes. 2. Solapa NGS: SAM Tools: Programa Filter pileup : Para ello antes debemos editar los atributos de archivo que fue generado en el paso anterior: Click en el icono del lapiz. Solapa Datatype Completamo el campo New Type con pileup Save Ahora si ejecutamos Filter pileup (parametros por defecto). Cuantos SNPs tenemos? Veamos esos resultados! Los podemos guardar a la PC de manera local. Ejercicio 2. En este ejercicio Utilizaremos un Genome Browser para buscar la informacion disponible de los lugares del genoma humano en los cuales encontramos SNP's Vamos al UCSC genome browser: http://genome.ucsc.edu/index.html 1. Clic Genome Browser. 2. Select the human genome hg19 assembly. 3. Vamos a la posicion en la cual queremos buscar, en el box ponemos: chr[numero de cromosoma]:[posicion inicio]-[posicion fin] (ver ejemplo en figura 2) 4. Visualizar en Genome browser, Primero hacer clic en hide all 5. Luego mostrar y esconder tracks de interés! Por ejemplo: RefSeq genes 6. Dentro de que gen se ubican nuestros SNP's? 7. Hay SNP's reportados en estas posiciones? Son los mismos que encontramos nosotros con nuestros reads? 8. Para contestar estas preguntas visualizar tracks de SNPs (el ultimo grupo de tracks disponibles: Variation and Repeats). 9. Otra pregunta, El hombre Neandertal tenia este gen? Se tiene información sobre SNPs? Ver track: SNPS Used for Selective Sweep Scan (S) (All Neandertal Assembly and Analysis tracks).
Figura 2. Visualización de la posicion 41245546 (intervalo alrrededor) del cromosoma 17 en el UCSC Genome Browser. Créditos: Algunas partes de este TP son de: Hands on workshop: Next generation sequence data analysis. The Netherlands Bioinformatics Centre. Leiden Genome Technology Center