VALORACION EMBRIONARIA POR MORFOCINÉTICA. CRITERIOS DE NOMENCLATURA Y ANOTACIÓN. Dr. Jesús Aguilar Prieto. Laboratorio de Fecundación in Vitro. IVI VIGO. Dr. Elkin Muñoz Muñoz. Ginecología. IVI VIGO. Tradicionalmente, la selección de los embriones en los laboratorios se ha realizado en base a criterios morfológicos y a ritmos de desarrollo analizados mediante microscopía de luz clara. El desarrollo e incorporación de la epigenómica, genómica, transcriptómica, proteinómica y metabolómica a la investigación y tratamiento de la esterilidad han supuesto una mejora del conocimiento de los procesos biológicos implicados en el éxito reproductivo. La investigación de nuevos medios y plataformas de cultivo, incubadores y sistemas de monitorización, la implementación de protocolos de estimulación ovárica, y el mejor conocimiento de la ventana de implantación embrionaria, entre otras, están favoreciendo el incremento de las tasas de gestación e implantación en las clínicas de reproducción en estos últimos años. La incorporación de la monitorización por time-lapse (TLM) del desarrollo embrionario, utilizada en investigación en los laboratorios de FIV desde 1957, se ha acelerado en estos últimos años, a raíz del desarrollo y comercialización de incubadores provistos de TLM los cuales permiten monitorizar el desarrollo del embrión sin alterar las condiciones de incubación, y permiten desarrollar algoritmos de selección basados en los tiempos en los que suceden los eventos celulares. Sin embargo, esta tecnología, se ha incorporado sin ningún consenso sobre qué eventos celulares deben anotarse y cómo y cuándo hacerlo, algo crucial para estandarizar la valoración embrionaria y compartir datos entre laboratorios y participar en controles de calidad externos. Presentamos una guía sobre qué eventos celulares deberían anotarse y cómo y en qué momento, para favorecer la estandarización de la nomenclatura y anotación (Ciray et al, 2014) de la valoración morfológica.
Esta guía pretende establecer criterios generales de anotación, independientemente del sistema de TLM que se utilice. Debido a ello, algunos parámetros aquí definidos, serían de difícil valoración en sistemas TLM de campo oscuro. Por otro lado, no se busca valorar la utilidad de algunos de los parámetros definidos en relación a la generación de algoritmos que puedan incrementar las tasas de implantación pues entendemos que al existir diversos sistemas TLM con distintos incubadores, los resultados podrían no ser comparables. DEFINICIONES PARA LA TLM DEL DESARROLLO EMBRIONARIO t hace referencia al momento, o fotograma (frame) en que un evento sucede. Aparición y desaparición del evento, se anotan como a o f respectivamente, y número de células, o de veces que sucede un evento, mediante la letra n. t0 = tiempo en que sucede la inseminación para FIV clásica. En ICSI el tiempo en el que la mitad de los ovocitos de la cohorte han sido microinyectados. tpb2 = El segundo corpúsculo polar ha sido extruido del citoplasma. tpn = tiempo en que el que la fecundación es confirmada. Los eventos de aparición o desaparición de los pronúcleos (PN) se registran como tpna y tpnf respectivamente. Aplicar un número para indicar la aparición desaparición en cada PN. ej) tpn1a haría referencia al tiempo de aparición del primer PN. tz = Valoración del score pronuclear. Pese a aconsejarse su valoración a las 17±1h (ALPHA & ESHRE), se recomienda en valorarlo en el último fotograma previo a tpnf pues se produce una constante modificación en la morfología pronuclear hasta el momento de la desaparición de los mismos. tn = tiempo en el que el embrión tiene n blastómeras completamente separadas por membranas celulares independientes. tsc = La primera evidencia de compactación es visible. tmf/p = Se completa la compactación, siendo f una mórula completa, y p una parcial. tsb = primer fotograma en el que se inicia la blastulación.
tbyz = Blastocisto completo. Último fotograma antes de que la zona pelúcida (ZP) empiece a adelgazar. Las letras y y z hacen referencia a una valoración morfológica de la masa celular interna y trofoectodermo respectivamente. teyz = Inicio de la expansión. Primer frame en que la ZP empieza a adelgazar. thyz = Herniación. Primer frame en que se extruyen células a través de la ZP. thdyz = Blastocisto eclosionado. Primer fotograma en el que el blastocisto ha sido extruido de la ZP como un todo. VARIABLES CALCULADAS DEL DESARROLLO EMBRIONARIO POR TLM VP = Tiempo durante el cual los PN son visibles. VP= tpnf- tpna. cc y ECC : Duración de los ciclos celulares. Un ciclo celular es una secuencia ordenada de eventos durante los que una célula duplica su contenido y se divide en dos. Su duración puede calcularse tanto para una única célula, como para una ronda de mitosis en los que el embrión dobla su número de blastómeras, ciclo celular de blastómeras (cc) y de ciclo celular embrionario (ECC) respectivamente. El cc para la blastómera a ( cc2a ) se calcula como t3 - t2, para la blastomera b cc2b = t4 - t2. El ciclo celular en el que el embrión alcanzaría las 4 células, el segundo ciclo celular embrionario (ECC2) se calcula como (t4 - t2). Por tanto, el tiempo que la última blastómera en división emplea para dividirse, coincide con la duración el ECC (fig1). La duración del ECC3 es el tiempo en que el embrión pasa de 4 a 8 células, e incluye 4cc; a, b, c y d. cc3a=t5 - t4; cc3b=t6 - t4; cc3c=t7 - t4 y cc3d=t8 - t4=ecc3 (Fig.2) S : Sincronización La sincronización es el tiempo que emplean células hermanas en dividirse en dos, y alcanzar el siguiente paso en la secuencia geométrica {1 célula, 2 células, 4 células, 8 células...}, desde que se divide la primera. S2= t4-t3; s3= t8-5. dcom = duración de la compactación (tm- tsc) db = Duración de la blastulación (tb-tsb) deb = Duración de la expansión del blastocisto (thn-te)
dhn = Duración de la herniación (thb-thn) ANOTACIONES ADICIONALES Permitirán estandarizar el tiempo de visibilidad de los siguientes eventos celulares, considerando (i) para el inicio del mismo, y (end) para su cese. tser Agregación del retículo endoplasmático rugoso. Su presencia se relaciona con calidad ovocitaria y embrionaria. Fragmentación Se sugiere para anotar la fragmentación la utilización de la fórmula x%ftn en donde x se refiere al porcentaje de fragmentación y tn se refiere a la última división celular que se completó. Asi, 10%ft2 se refiere a un embrión de 2 células con un 10% de fragmentación. Ya que la fragmentación es otro evento dinámico, se recomienda anotarla en el fotograma previo a la mitosis. Es decir, para anotar la fragmentación de un embrión de dos células, se recomienda hacerlo justo antes de que se divida a tres. Morfología nuclear nmono (mononucleadas) n es el número de blastómeras con un solo núcleo. nbi (binucleadas)= número de blastomeras con dos núcleos por célula. nmulti (multinucleadas) número de blastómeras con más de dos núcleos visibles. También incluye los micronúcleos. El seguimiento de la aparición y desaparición se recomienda realizarlo con (a) y (f) respectivamente. Simetría blastomérica Un embrión con todas sus blastómeras simétricas ( even ). uneven si se diferencian entre sí en un tercio del tamaño esperado. Se recomienda analizarla al final de los estadíos embrionarios de 2, 4 y 8 células, cuando se considera criterio de morfología óptima. División rápida Descrita por Rubio et al (2011), es una división de una única célula en dos, en un tiempo menor del habitual, generalmente menos de cinco horas.
División tricotómica: Descrita por Kola et al (1987), división aberrante de una célula directamente a tres. Asociada con errores en el huso acromático. ttm = t(n) - t(n-1) = 0. Fusion blastomérica Reducción del número de células de un embrión debido a fusiones celulares. Debe distinguirse de internalización de fragmentos celulares. Cuando se detecte se anotará como tfu. Disposición plana Cuando el embrión de 4 células presenta ejes de división que no siguen una simetría tetraédrica. Cuando este evento se detecte, debe anotarse como tpa embryo rolling Se define a las blastómeras que giran sobre sí mismas sin dividirse. troll ondas citoplasmáticas Movimientos citoplasmáticos generados por contracciones de la actinomiosina desencadenados por oscilaciones de calcio tras la fecundación. tcw Fig 1. Segundo ciclo celular Fig. 2 tercer ciclo celular Bibliografía H. Nadir Ciray, Alison Campbell, Inge Errebo Agerholm, Jesús Aguilar, Sandrine Chamayou, Margarida Esbert, Shabana Sayed. Proposed guidelines on the nomenclature and annotation of dynamic human embryo monitoring by a time-lapse user group. Human Reproduction. 2014. Available online. DOI: 10.1093/humrep/deu278.