Rol del Laboratorio en el Diagnóstico y Prevención n de la Infección n por CMV en pacientes transplantados Bioquímica Mariela Merkt
CMV: Características Familia β Herpesviridae DNA doble cadena Virus envuelto Es el virus herpes más grande (240 kb)
Infección por CMV Es común, entre el 40-100% de la población mundial adulta es seropositiva Muchos individuos son infectados en la infancia, y en la mayoría de la población no causa enfermedad con significado clínico CMR, 13,83-121,200
CMV INFECCION PRIMARIA ESTADO LATENTE oreceptores de transplantes o pacientes HIV positivos oindividuos con sistema inmune inmaduro omujer embarazada: infección congenita REACTIVACION Enfermedad clínica Severa JCM,40,746-752,2002
Small RNA and Large Virus NEJM;357,25. 2007
Infecciones post transplante
El impacto del CMV en los transplantados es considerado como la más importante causa de morbi-mortalidad JCM,40,746-752,2002
Enfermedad por CMV Primoinfección: transferencia a través del órgano transplantado Reactivación: Infección latente Super infección: cepa distinta a la cepa latente
Efectos del CMV DIRECTOS INDIRECTOS 1.Directos: Sindrome mononucleosis like Leucopenia o trombocitopenia Infección del injerto Neumonitis Infección de TGI Encefalitis NEJM;338,24;1998
Efectos del CMV 2.Indirectos: Acción inmunomoduladora: Aumenta el riesgo de infecciones oportunistas (bacterianas, fúngicas) Aumenta el riesgo de injuria del órgano transplantado (agudo y crónico) Relacionado a ateroesclerosis del corazón transplantado NEJM;338,24;1998
Factores de riesgo para desarrollar enfermedad por CMV Estatus del donante y del receptor del transplante Del grado de inmunosupresión (reactivación) La presencia de CMV en sangre (viremia) asociado con alto riesgo de recurrencia o enfermedad futura La carga viral de CMV IHMF;2002
Presentación clínica depende del tipo de transplante TOS (excepto corazón y pulmón) ocurren severas infecciones del tracto GI con leucopenia y trombocitopenia; la neumonía es rara. TMO y receptores de corazón y pulmón la neumonía es la secuela más frecuente y la más fatal. La retinitis es rara en los transplantados IHMF;2002
Manifestaciones Clínicas www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm
Tratamiento Manejo antiviral de CMV Prevención Tratamiento Profilaxis universal Dirigida a todos los transplantados Profilaxis selectiva Dirigida a pacientes de alto riesgo Temprano (preemptive) Según resultado del test empleado Tratamiento tardío Se aplica una vez iniciado los síntomas
PROFILAXIS V: No se requieren test de laboratorio para iniciar la terapia D. Riesgo de exposición a drogas en individuos de bajo riesgo Desarrollo de resistencia PRE- EMPTIVE THERAPY V: Exposición de pocos individuos a las drogas, al igual que el tiempo de exposición D. Requiere test de elevada sensibilidad IHMF;2002
Por qué medir la viremia? Diagnóstico de enfermedad Tratamiento Monitoreo de la replicación viral Pre-emptive therapy Monitoreo de la terapia antiviral Duración del tratamiento Evaluar resistencia IHMF;2002
Frecuencia de monitoreo para guiar pre-emptive therapy Semanalmente monitorear viremia usando durante los primero 3 meses luego del transplante o durante más tiempo dependiendo de la intensidad de la inmunosupresión. www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm
Riesgo de infección según serología D-/R- D-/R+ D+/R+ D+R- Mayor riesgo IHMF;2002
Ensayos para la detección de CMV 1.NO MOLECULARES: Cultivo convencional, shell vial, antigenemia pp65 2. MOLECULARES: A.Cualitativos: PCR casera, PCR Amplicor, Nuclisens pp67 (NASBA) B. Cuantitativos: Cobas Amplicor Monitor, Híbrido de captura, Quantiplex bdna, PCR en tiempo real IHMF;2002
NO MOLECULARES
IHMF;2002
Detección del Ag temprano pp65 por Inmunofluorescencia pp65 Resultados: Se informa nº de células positivas/ 200.000 leucocitos
Comparando métodos Pp65 V: Es más sensible que los métodos de cultivo viral D: no es útil en periodos de neutropenia (se necesita un gran número de leucocitos) Requiere del rápido procesamiento de las muestras, y su resultado puede ser subjetivo, dependiendo de la experiencia del observador. Cultivo viral insume mucho tiempo, menor reproducibilidad, menor sensibilidad IHMF;2002
Recomendaciones para el inicio de pre-emptive therapy según pp65 TOS: TMO: Más de 10 células positivas/200.000 células observadas Mayor o igual a 1-2 células positivas/200.000 células observadas El cultivo viral y el shell vial no son adecuados para guiar pre-emptive therapy IHMF;2002
MOLECULARES
Ensayos moleculares comerciales para la detección de la infección por CMV IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES Nuclisens pp67 test Tipo de muestra: plasma El target de ácido nucleico es RNA y no DNA (indica infección activa) Límite de detección: aprox 700 moléculas de RNA Desventaja: No es cuantitativo IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES Híbrido de captura CMV DNA assay Sensibilidad de 76-100%, comparado con el shell vial 74-97% y Amplicor CMV Monitor assay 88-100 % New Microbiol 1996;19:193-201
2. METODOS MOLECULARES Branched-DNA (bdna) Ventaja Alta reproducibilidad Desventaja Necesita de un alto número de PMN 2.10 6 IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativa Puede ser utilizada con plasma o Leucocitos El test utiliza el Cobas amplicor Buena especificidad Estrecho rango dinámico y alta demanda de tiempo para su realización. Rango: 400-1.10 5 copias/ml plasma o por 5.10 6 Leucocitos IHMF;2002
Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativo Usando plasma: 1000-5000 copias/ml en TOS TMO cercano al límite de detección para guiar pre-emptive therapy IHMF;2002
2. MOLECULARES Detección cualitativa de ADN por PCR Tipo de muestra: Leucocitos Ventajas Permite detectar a muy bajo nivel de viremia (alta sensibilidad) Permite monitorear la eficacia del tratamiento antiviral Sensibilidad cercana al 100 % Desventajas No permite diferenciar infección latente de enfermedad activa. IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES PCR en Tiempo Real Combina la química de la PCR con sondas fluorescentes para detectar el producto amplificado en la misma reacción, permitiendo además medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizada a cada momento, mostrando y registrando la cinética de la reacción de la amplificación. Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305
Hay diferentes fluoróforos para la detección SYBER Green: Fluoróforo no específico Detecta todos DNA de doble cadena producidos durante la reacción de amplificación (producto específico, inespecífico o dímeros de primer) www.roche.com
Para discriminar si las muestras son positivas o negativas se realiza una curva de desnaturalización ( melting curve ) al final de la reacción La reacción se calienta desde 50 hasta 95 ºC monitoreando continuamente la fluorescencia Cada amplicon tiene un Tm característico, lo cual depende del: tamaño, contenido de CG y la secuencia. Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305
PCR Cualitativa Lo realizamos en: Sangre entera Biopsias Control interno LightCycler: Roche Se informa: Detectable o no detectable. Sitio de amplificación Gen que codifica para la glicoproteina B del CMV
PCR Cuantitativa LightCycler Roche Tipo de muestra: Plasma Se utlizan standares de cuantificación caseros Control interno Rango lineal: 200-200.000.000 copias Se informa: copias/ml de plasma
Sitio de amplificación Gen que codifica para la glicoproteina B del CMV 2000 copias/ml
2. METODOS MOLECULARES PCR en Tiempo Real Ventajas Altamente sensible y específica Mejor relación costo-beneficio para determinar C.V Permite predecir enfermedad monitorear la terapia antiviral Rápida 1 hora Menor riesgo de contaminación cruzada
Aplicación de la Cinética de la carga viral en la identificación del paciente de riesgo Carga viral en la primera muestra positiva (carga viral inicial) Velocidad de aumento de la carga viral FACTOR DE RIESGO
Cinética de cargas virales (CMV) 1500 200000 copias/ml 1000 500 0 0 3 17 24 31 38 Días copias/ml 150000 100000 50000 0 0 4 11 17 Días 60000 copias/m l 40000 20000 0 0 7 9 14 21 24 29 Días
Tipos de muestra Cuantificación en distintos compartimentos celulares: sangre entera, plasma, Leucocitos, MN, PMN Carga viral en sangre entera 0.67 log más elevada que en plasma Carga viral en PMN y MN similar en pacientes con enfermedad activa Uso de Leucocitos: carga viral baja, progresión rápida de la enfermedad (TMO). Uso de plasma: progresión lenta de la enfermedad (HIV), neutropenia. CMR, 1998,11:533-554
Qué muestra es la mas conveniente? Evaluar cada caso en particular Tipo de paciente Metodología disponible Todas las muestras 1. Proveen información pronóstico 2. Pueden usarse para el inicio preemptive therapy 3. Pueden medir respuesta a la terapia
Tratamiento Ganciclovir IV: Tratamiento de 2-4 semanas en TOS Idem en TMO; con pneumonitis se agrega gammaglobulina endovenosa. No hay estudios randomizados; está basado en estudios comparativos en un pequeño grupo de pacientes. Valaciclovir Foscarnet (resistencia al ganciclovir) Cidofovir: en individuos con HIV/SIDA NEJM;335,721-729, 1996
CONCLUSIONES Se necesitarían estudios comparativos para evaluar y poder estandarizar los ensayos moleculares para los distintos transplantes Se necesitarían estudios que validen la carga de CMV para iniciar las estrategias del tratamiento temprano en función a los resultados de la carga viral
CONCLUSIONES La baja sensibilidad del cultivo convencional y del shell vial limitan su uso en el manejo de la infección por CMV en este tipo de pacientes Es necesaria la utilización de métodos cuantitativos para establecer el riesgo de enfermedad y para monitoreo del tratamiento o detectar resistencia.
A pesar de que hay muchos puntos en el manejo del paciente transplantado que aún no han sido dilucidados, y que falta mucho por aprender, las herramientas diagnósticas con las cuales contamos en el Laboratorio son de mucha utilidad para poder ayudar a este tipo de pacientes a prolongar su vida
Muchas Gracias www.drstamboulian.com.ar