Biomarcadores para Uso Clínico. Informe de Vigilancia Tecnológica

Biomarcadores para Uso Clínico Informe de Vigilancia Tecnológica

Biomarcadores para Uso Clínico Informe de Vigilancia Tecnológica

Biomarcadores para Uso Clínico El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido realizado en el marco del convenio de colaboración conjunta entre Genoma España y la Fundación de la Universidad Autónoma de Madrid (FUAM). Genoma España y la Fundación de la Universidad Autónoma de Madrid (FUAM) agradecen la colaboración ofrecida a: Dr. Ángel Carracedo (IML - Universidad de Santiago & Fundación Pública Medicina Xenómica) Dr. Ignacio Casal (Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC) Dr. Jaime Sancho (Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra - CSIC) La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando: Biomarcadores para Uso Clínico. GENOMA ESPAÑA/FUAM. Genoma España no se hace responsable del uso que se realice de la información contenida en esta publicación. Las opiniones que aparecen en este informe corresponden a los expertos consultados y a los autores del mismo. Autores: Gema Ruiz Romero (FUAM) Miguel Vega García (Genoma España) Copyright: Fundación para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica/Fundación de la Universidad Autónoma de Madrid. Edición: Cintia Refojo (Genoma España) Referencia: GEN-ES10001 Fecha: abril 2010 Diseño y realización: Creaciones Hazanas, S.L.

Índice RESUMEN EJECUTIVO 7 1. OBJETIVOS DEL INFORME 8 2. INTRODUCCIÓN A LOS BIOMARCADORES 9 3. IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE NUEVOS BIOMARCADORES 17 3.1. Etapas del proceso de identificación y validación de nuevos biomarcadores 18 3.2. Técnicas implicadas en el proceso de identificación y validación de nuevos biomarcadores 22 3.2.1. Genómica 22 3.2.2. Proteómica 32 3.2.3. Metabolómica 42 3.2.4. Biología de Sistemas 46 3.2.5. Nanotecnología 48 4. APLICACIONES DE LOS BIOMARCADORES EN LA PRÁCTICA CLÍNICA 55 4.1. Farmacogenómica 59 4.2. Cáncer 69 4.3. Enfermedades infecciosas 78 4.4. Enfermedades cardiovasculares 82 4.5. Enfermedades relacionadas con el sistema nervioso 85 5. SITUACIÓN ACTUAL 91 5.1. Papel de la industria farmacéutica y biotecnológica en la investigación en biomarcadores 91 5.2. Mercado de biomarcadores de uso clínico 94 5.3. Aspectos relacionados con la regulación de biomarcadores de uso clínico 98 5.4. Barreras en la implantación de los nuevos biomarcadores en la práctica clínica 103 5.5. Oportunidades de desarrollo 107

6 6. CONCLUSIONES 114 ANEXOS 116 Anexo I. Proyectos de investigación españoles relacionados con biomarcadores de uso clínico 116 Anexo II. Test comerciales y en desarrollo para el diagnóstico, estratificación de pacientes y análisis de respuesta a fármacos 161 Anexo III. Biomarcadores genómicos considerados como válidos por la FDA en el contexto de medicamentos aprobados 163 Anexo IV. Fichas de empresas españolas relacionadas con biomarcadores de uso clínico 166 Anexo V. Fichas técnicas correspondientes a grupos de investigación cuya actividad científica se enmcarca dentro de los biomarcadores de uso clínico 176 GLOSARIO 192 REFERENCIAS 193

Biomarcadores para Uso Clínico 7 Resumen ejecutivo Un marcador biológico o biomarcador es una característica biológica que puede ser medida de forma objetiva y que proporciona información sobre el desarrollo de procesos patológicos, sobre procesos biológicos normales o sobre la respuesta frente a un tratamiento farmacológico. Los biomarcadores forman parte de la práctica médica habitual. Indicadores biológicos tales como la medida de la temperatura corporal o de la presión arterial son utilizados de forma rutinaria en la clínica desde finales de los siglos XVII y XIX respectivamente. En los últimos años, la eclosión de las tecnologías ómicas (genómica, proteómica, metabolómica) ha supuesto la aparición de una nueva oleada de biomarcadores. Estos nuevos biomarcadores se corresponden con variaciones en la estructura, en la secuencia o en los niveles de expresión de genes, de proteínas o de metabolitos y proporcionan una visión molecular de las patologías, permitiendo en algunos casos la integración de información procedente tanto del genotipo como del fenotipo. El rápido despegue de las tecnologías ómicas comenzó tras el desciframiento del genoma humano. Este hito proporcionó a la comunidad científica una gran cantidad de información que en los próximos años se espera que ejerza un impacto directo sobre la práctica médica. Aparece ante nosotros la posibilidad de realizar una Medicina Personalizada en la que el papel de los nuevos biomarcadores será actuar como señales tempranas de la presencia de una patología o incluso del riesgo de desarrollarla en un futuro, así como poder anticiparse al desarrollo de reacciones de toxicidad o de falta de eficacia de los tratamientos farmacológicos. Pero para conseguir alcanzar todos estos objetivos se han de superar previamente una serie de barreras de diversa índole. No solo se plantean retos científicos y tecnológicos, también han de superarse retos sociales y éticos para finalmente poder poner en práctica una medicina más preventiva y centrada en la intervención temprana.

8 Genoma España 1. Objetivos del Informe El presente Informe tiene por objeto realizar un análisis de la situación actual de los nuevos biomarcadores haciendo especial hincapié en su uso en la práctica clínica, en comparación con los biomarcadores clásicos. En la primera parte del Informe se mostrarán las principales técnicas surgidas en la era del desciframiento del genoma humano, las denominadas tecnologías ómicas y su utilidad en los procesos de identificación y validación de nuevos biomarcadores. Se incluirá también una revisión de las principales aplicaciones terapéuticas de los biomarcadores. En la última parte del Informe se realizará un análisis de los principales retos a los que se enfrenta la investigación en este campo de conocimiento científico así como de sus principales oportunidades de desarrollo. Finalmente, se presentan una serie de anexos en los que se reflejan los proyectos de investigación que se están desarrollando en España, así como otros datos de interés para obtener una visión global de esta área de la ciencia actual.

Biomarcadores para Uso Clínico 9 2. Introducción a los biomarcadores Los biomarcadores son una serie de características biológicas que pueden ser evaluadas y medidas de manera objetiva y que proporcionan información sobre procesos biológicos normales o patológicos, permitiendo discernir entre ambos procesos o bien definir el punto de la enfermedad en el que se encuentra un individuo, la progresión de la enfermedad o cuantificar su respuesta frente a una posible terapia. Los primeros biomarcadores utilizados en la práctica clínica para el diagnóstico de enfermedades eran indicadores fisiológicos tales como la temperatura corporal, la frecuencia cardíaca o la presión sanguínea. Estos biomarcadores son fácilmente accesibles por lo que podían ser medidos de manera sencilla y, por otra parte, se encuentran directamente relacionados con la fisiopatología de la enfermedad. En el siglo XX, los grandes avances que tuvieron lugar en campos como la bioquímica supusieron la aparición de una nueva oleada de biomarcadores que se evaluaban a través del análisis de fluidos corporales como la sangre, el plasma y diferentes tejidos. Pertenecen a este tipo de biomarcadores los niveles en sangre de glucosa, colesterol o enzimas hepáticas, por citar algunos ejemplos. Por último, la gran cantidad de información surgida a raíz de la eclosión de las tecnologías ómicas (genómica, proteómica y metabolómica) ha supuesto la aparición de una nueva generación de biomarcadores moleculares que se sirven de dichas tecnologías para realizar un diagnóstico molecular de las enfermedades. Definición de biomarcador 1 Un marcador biológico o biomarcador es una característica biológica que puede medirse de manera objetiva y que puede ser utilizada como indicador de un proceso biológico normal, de un proceso patológico, así como de la respuesta farmacológica a una intervención terapéutica. El diagnóstico molecular permite identificar los genes involucrados en el desarrollo de una enfermedad, así como los factores de riesgo de desarrollo de la patología. Gracias al análisis molecular es posible realizar una mejor estratificación de los pacientes, lo que puede traducirse en la puesta en marcha de terapias individualizadas mucho más efectivas 2. 1 Bethesda, Md. Biomarkers Definitions Working Group (2001). Biomarkers and surrogate endpoints: Preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 69 (3):89-95. 2 Chantell, L. et al. (2007). Cáncer Biomarkers, Where Medicine, Business and Public Policy Intersect. Biotechnology Healthcare, Feb-2007: 33-42.

10 Genoma España Pertenecen a este tipo de biomarcadores características biológicas tales como perfiles de expresión de genes, mutaciones en la secuencia de ADN, patrones de metilación del ADN, perfiles de metabolitos y proteínas, todos ellos relacionados con el curso de una patología. El ADN contiene toda la información necesaria para el funcionamiento del organismo. Cada molécula de ADN se encuentra organizada en una serie de unidades funcionales denominadas genes, los cuales llevan consigo las instrucciones para constituir otras moléculas esenciales en el organismo, las proteínas. Las proteínas están implicadas en procesos biológicos fundamentales del organismo, tales como funciones estructurales, transporte de moléculas, metabolismo, etc. Cualquier alteración que se produzca en estas funciones puede suponer o contribuir a la aparición de una patología, de ahí la estrecha relación entre genes-proteínas-enfermedad. Pares de bases Adenina Guanina Doble hélice Timina Citosina El ADN se encuentra empaquetado en el núcleo de las células formando una estructura compuesta por el propio ADN 3 y diferentes proteínas histonas, denominándose al conjunto cromatina. Para que el ADN se traduzca a proteínas, ha de producirse un paso previo denominado transcripción, en el que el ADN se copia a un intermediario denominado ARNm 4, que sirve de molde para la síntesis de proteínas. El ADN, además, transmite toda su información a las células hijas ya que es capaz de duplicarse mediante un proceso denominado replicación. 3 Cada molécula de ADN está constituida por dos cadenas de nucleótidos enrolladas entre sí formando una hélice. El esqueleto que forma cada una de las dos cadenas está constituido por un tipo de hidratos de carbono denominados pentosas, grupos fosfato y bases nitrogenadas: adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). El orden o secuencia en que aparecen distribuidos los nucleótidos determinan la información que fija el mantenimiento y las funciones del organismo. 4 ARNm: molécula de ARN que proviene de la transcripción de un gen que codifica una proteína, después de experimentar un proceso de corte y empalme.

Biomarcadores para Uso Clínico 11 Figura 1. Proceso de transcripción y traducción del ADN a proteínas. Fuente: Instituto Nacional de Salud de EE.UU., dirección web: http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/ illustrations/proteinsyn Alteraciones en cualquier punto del proceso de replicación del ADN, de la traducción del ADN a ARN mensajero o de la transcripción del ARN mensajero, pueden provocar el mal funcionamiento o la pérdida de función de una proteína, o incluso la interrupción de la síntesis proteica, lo cual conduce a la aparición de diversas patologías. ALTERACIONES EN LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS Replicación Pérdida o ganancia de la función de la proteína Transcripción Aparición de patologías Traducción Síntesis de la proteína aumentada o disminuida Figura 2. Esquema de las posibles alteraciones en la síntesis de proteínas. Fuente: elaboración propia

12 Genoma España Los biomarcadores moleculares pueden clasificarse basándonos en sus diferentes características para su uso en la práctica clínica. De este modo, pueden diferenciarse cuatro tipos principales de biomarcadores: Biomarcadores con valor diagnóstico, gracias a los cuales se pueden identificar pacientes con una patología concreta, discerniendo entre individuos sanos y enfermos. Dentro de este grupo de biomarcadores se puede hacer un subgrupo que albergaría a los biomarcadores que permiten la estratificación de pacientes, estos biomarcadores realizan un diagnóstico más específico de la enfermedad, clasificando a los pacientes en subgrupos. Biomarcadores con capacidad predictiva, que permiten predecir la posibilidad de desarrollar una patología antes de que se produzcan síntomas de la misma, es decir predicen el riesgo de sufrir una patología en el futuro. Biomarcadores con utilidad pronóstica, es decir, biomarcadores que proporcionan información sobre el posible curso de la patología, anticipando los posibles cambios que pueden producirse en el curso de la enfermedad así como su posible prolongación en el tiempo. Biomarcadores de respuesta, que permiten predecir cómo responderá un paciente frente a un tratamiento concreto, pudiendo de esta forma evitar tratamientos ineficaces o que produzcan reacciones adversas, con anterioridad a la puesta en marcha del tratamiento en sí. Por ejemplo, para las patologías mieloproliferativas existen biomarcadores con utilidad diagnóstica, tales como la presencia de mutaciones en el gen JAK2 cuya presencia está relacionada con el desarrollo de síndromes mieloproliferativos crónicos (policitemia vera, metaplasia mieloide, y/o trombocitemia esencial) 5, marcadores pronósticos como la presencia de mutaciones en el gen ZAP-70 que permiten predecir la posible evolución de la patología en la leucemia linfática crónica 6 y marcadores de respuesta como diversas mutaciones en el gen KIT que permiten predecir la posible respuesta de un paciente al tratamiento con el fármaco Glivec 7. Los biomarcadores también pueden ser clasificados en base a su naturaleza molecular en biomarcadores de tipo génico, proteico y metabólico. A continuación se profundizará en las características propias de cada uno de estos grupos de biomarcadores. 5 Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Servicio de Diagnóstico Molecular http://www.cnio.es/es/programas/prog509d.asp 6 Diario Médico, 12-12-2006, entrevista a Emili Montserrat: Hemos pasado de los factores pronósticos a los predictores de la respuesta en leucemia linfática crónica. 7 Calasanz, M. J. (2008). Utilidad diagnóstica de los biomarcadores: Leucemias y Linfomas. Ponencia del curso Biomarcadores y Medicina Traslacional UIMP/ Instituto Roche. www.institutoroche.org

Biomarcadores para Uso Clínico 13 Biomarcadores génicos Como se comentó anteriormente, las moléculas de ácido desoxirribonucleico o ADN contienen la información para sintetizar las proteínas que median en todos los procesos biológicos que se producen en los organismos. Existe una estrecha relación entre la existencia de alteraciones en el ADN y el desarrollo de enfermedades, motivo por el cual los ácidos nucleicos constituyen un tipo de biomarcadores. Muchas patologías surgen por la presencia de alteraciones genéticas junto al efecto del entorno sobre el individuo. Estas alteraciones pueden afectar a la secuencia de ADN o bien puede tratarse de modificaciones químicas que aparecen en la molécula de ADN pero que no afectan a su secuencia, los denominados cambios epigenéticos. Mediante el estudio de las diferencias entre las secuencias de ADN en genes concretos o de los cambios epigenéticos entre individuos sanos y enfermos se puede llegar a inferir aquellas alteraciones que están relacionadas con la patología y llegar a obtener, tras un proceso de validación, nuevos biomarcadores. A continuación se habla con más detalle de las diferentes alteraciones y de las modificaciones químicas que pueden aparecer en la secuencia de ADN: a) Las alteraciones que pueden aparecer en la secuencia de ADN provocan en muchas ocasiones la aparición de diferentes patologías. Esto ocurre porque las alteraciones en el ADN provocan la pérdida o mal funcionamiento de una proteína que esté implicada en procesos biológicos esenciales. Estos cambios en la secuencia génica pueden constituir una herramienta de gran utilidad en el diagnóstico de las patologías y existen diferentes tecnologías que permiten monitorizar estos cambios de cara a su uso en la práctica clínica. En el apartado 3.2.1 del presente Informe se habla detalladamente de este tipo de tecnologías. Tipos de alteraciones que pueden aparecer en la secuencia del ADN o mutaciones: Mutaciones génicas o mutaciones que afectan a la secuencia de nucleótidos que constituyen la molécula de ADN. Pertenecen a este grupo de mutaciones: (i) mutaciones puntuales o alteraciones que solo afectan a un único par de bases y en las que se produce la sustitución de una base por otra (ii) inserciones que consisten en la ganancia de una o más bases dentro de la cadena de ADN (iii) deleciones o pérdida de una o más bases dentro de la cadena de ADN Mutaciones estructurales o mutaciones que afectan a fragmentos de cromosomas. Pertenecen a este tipo de mutaciones alteraciones como: (i) deleciones o pérdida de un segmento del cromosoma (ii) duplicaciones o repetición de un segmento del cromosoma (iii) transposiciones, cambio de lugar de un segmento cromosómico (iv) inversiones, cambio de orden del segmento de un cromosoma Alteraciones en el número de cromosomas o aneuploidías.

14 Genoma España b) En los últimos años los investigadores han prestado una atención creciente a otro tipo de modificaciones que puede sufrir el ADN, los cambios epigenéticos, ya que este tipo de modificaciones parece jugar un papel clave en patologías como el cáncer. Los cambios epigenéticos son una serie de modificaciones químicas que se producen sobre el ADN, no afectando a su secuencia pero que son heredables. Las principales modificaciones epigenéticas son la metilación del ADN 8 y las modificaciones que sufren las histonas 9. En muchos estados patológicos los patrones de metilación del ADN aparecen alterados 10. En cáncer, a pesar de observarse una disminución global de la metilación del ADN (entre un 20 y 60% menor), existen determinadas regiones del genoma que se encuentran hipermetiladas. Estas regiones hipermetiladas se localizan en regiones promotoras de genes supresores de tumores. Al encontrarse hipermetiladas, impiden que el gen supresor pueda cumplir su función de control sobre la división celular, produciéndose un aumento en la proliferación celular. En enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide o lupus eritematoso también aparecen regiones hipometiladas y en patologías cardiovasculares se observan hipermetilaciones en lesiones ateroescleróticas. Los cambios epigenéticos se traducen en cambios en la estructura de la cromatina y pueden detectarse mediante diferentes tecnologías como inmunoprecipitación de la cromatina seguida de análisis por microarrays del ADN precipitado, técnicas de las que se habla en el apartado 3.2.1 del Informe. Biomarcadores proteicos Las proteínas son macromoléculas biológicas complejas que desempeñan un elevado número de funciones en el organismo, entre las que se encuentran funciones estructurales (colágeno), funciones de transporte (transporte de oxígeno por la hemoglobina), funciones de defensa (anticuerpos) o pueden actuar como mensajeros en rutas de señalización de procesos biológicos, por citar algún ejemplo. Como se comentó anteriormente, las alteraciones que se producen en la secuencia de ADN o en sus patrones de metilación pueden llevar a la síntesis de proteínas con modificaciones estructurales o a una síntesis aumentada o disminuida de la misma. 8 Metilación del ADN: Adición de un grupo metilo a una de las cuatro bases que forman parte del ADN, concretamente a la citosina. En humanos es frecuente que esta metilación se produzca en citosinas que preceden a guaninas, en regiones ricas de guaninas y citosinas de genoma denominadas islas CpG. Estas islas CpG suelen aparecer en regiones reguladoras de muchos genes. Fuente: Esteller, M. (2008). Epigenetics in cancer. N. Engl. J. Med., 358(11):1148-59. 9 Las principales modificaciones que pueden sufrir las histonas son acetilación, fosforilación, metilación, deaminación, ubicuitinización, ADP-ribosilación e isomerización de prolinas histónicas. Fuente: Kaminker, P. (2007). Epigenética, ciencia de la adaptación biológica heredable. Arch. Argent. Pediatr., 105(6):529-531. 10 Esteller, M. (2006). The necessity of a human epigenome project. Carcinogenesis, 27(6):1121-1125.

Biomarcadores para Uso Clínico 15 Debido a las importantes funciones que desempeñan las proteínas en el organismo, su mal funcionamiento, ausencia o sobreexpresión se puede traducir en el desarrollo de diferentes patologías. Por este motivo las proteínas se presentan como posibles biomarcadores de enfermedad, ya que mediante la comparación de perfiles proteicos de individuos sanos y enfermos se puede llegar a determinar las proteínas que están relacionadas con el curso de una patología, bien sea por su presencia, ausencia o mal funcionamiento. Un ejemplo de biomarcadores de tipo proteico es el antígeno específico de próstata (PSA), utilizado para el diagnóstico y screening de cáncer de próstata. El PSA es una proteína que se sintetiza en la próstata y participa en la disolución del coágulo seminal. Su concentración en sangre está relacionada con el tamaño de la próstata, siendo estos niveles muy bajos en individuos sanos. En pacientes con cáncer de próstata, estos niveles en sangre se encuentran aumentados de forma proporcional al tamaño del tumor. Sin embargo, es necesario señalar que existe un porcentaje de pacientes con cáncer de próstata que presentan niveles de PSA normales, así como portadores de otras patologías que muestran valores alterados. Por tanto, se trata de un marcador que aunque ha supuesto una mejora en el diagnóstico del cáncer de próstata no es infalible, ya que no es una prueba específica de adenocarcinoma de próstata 11. Las tecnologías englobadas dentro del campo de la proteómica, de las que se habla en profundidad en el apartado 3.2.2 del presente Informe, permiten analizar de forma simultánea la presencia de un elevado número de proteínas en una muestra biológica procedente de individuos enfermos y sanos, lo que podrá proporcionar a la práctica clínica nuevos biomarcadores. Biomarcadores metabólicos Un tercer tipo de biomarcadores moleculares son los biomarcadores metabólicos. Pertenecen a este tipo de biomarcadores los metabolitos, es decir, los compuestos que se forman en el organismo como resultado de las reacciones químicas que en él se producen. Se estima que alrededor de 3.000 metabolitos forman parte de procesos biológicos esenciales. Tienen especial interés los denominados metabolitos de bajo peso molecular entre los que se encuentran aminoácidos, azúcares o lípidos. Mediante el estudio de la concentración de los diferentes metabolitos presentes en el cuerpo humano se pueden generar patrones o perfiles metabólicos. Estos perfiles de metabolitos pueden verse alterados durante procesos patológicos, respuesta a fármacos u otros tipos de estrés. Comparando estos perfiles con perfiles de organismos sanos se pueden identificar aquellos metabolitos que pueden actuar como indicadores del proceso biológico que está experimentando el organismo o del riesgo de padecer determinadas enfermedades. Por ejemplo, niveles elevados de colesterol en sangre indican un riesgo elevado de sufrir una patología cardíaca o niveles altos de glucosa en orina pueden ser un indicador de riesgo de diabetes. 11 PSA y Cáncer de próstata. Clínica Universitaria Universidad de Navarra. Área de salud. http://www.cun.es/areadesalud/pruebas-diagnosticas/psa-y-cancer-de-prostata/

16 Genoma España Una característica de los biomarcadores metabólicos que los hace especialmente interesantes es su capacidad para aportar información sobre la influencia del entorno en el organismo. Por ejemplo, una dieta poco equilibrada puede verse reflejada en la alteración de un metabolito o de un conjunto de metabolitos. En el apartado 3.2.3 del presente Informe, se habla en profundidad de la disciplina que se encarga del estudio global del los metabolitos (metabolómica) y de su papel en la búsqueda de nuevos biomarcadores.

Biomarcadores para Uso Clínico 17 3. Identificación y validación de nuevos biomarcadores El descubrimiento de un biomarcador puede resumirse en un proceso compuesto por dos etapas fundamentales: una primera etapa de identificación en la que se reconocen las posibles moléculas o genes candidatos a convertirse en biomarcadores, y una fase de validación clínica del biomarcador obtenido en la fase previa. Entre ambas etapas pueden existir una serie de pasos intermedios cuyo objetivo es incrementar al máximo la utilidad del ensayo. En el presente apartado se realizará una breve introducción a las tecnologías de alto rendimiento que han permitido y revolucionado el proceso de descubrimiento de nuevos biomarcadores, así como sobre las distintas etapas que forman parte del proceso de descubrimiento de nuevos biomarcadores para su posterior traslación a la práctica clínica, punto del que se habla en profundidad en el apartado 4 del presente Informe. ARN Proteínas Metabolitos Microarrays Espectroscopia RMN Identificación de los genes, proteínas o metabolitos candidatos a biomarcador expresados de forma diferencial Validación de los candidatos a biomarcador empleando un número mayor de muestras Desarrollo de métodos de análisis sencillos, reproducibles y de bajo coste para analizar los biomarcadores identificados y poder trasladar su uso a la práctica clínica Figura 3. Esquema del proceso de identificación y validación de un biomarcador. Fuente: Kurian, S. et al. (2007). Applying genomics to organ transplantation medicine in both discovery and validation of biomarkers. International Immunopharmacology, 7:1948-1960.

18 Genoma España 3.1. Etapas del proceso de identificación y validación de nuevos biomarcadores Como se comentó anteriormente, el proceso de descubrimiento de un nuevo biomarcador debe estar constituido por dos etapas primordiales: una etapa de identificación de posibles candidatos a biomarcador y una etapa final de validación clínica, entre las que existen pasos intermedios cuyo objetivo es aumentar las posibilidades de éxito de la investigación 12. Investigación científica Investigación clínica Etapa de identificación de los posibles biomarcadores Etapa de validación clínica de los biomarcadores Información procedente de las diferentes tecnologías ómicas. Información procedente de la literatura científica. Candidatos a biomarcador $ $$$ $$$$ Etapa de priorización Etapa de verificación Validación clínica Realización de análisis bioinformáticos. Realización de simulaciones de datos genómicos, proteómicos y/o metabolómicos. Realización de estudios en organismos modelo. Realización de estudios en líneas celulares. Realización de análisis estadísticos. Realización de ensayos clínicos piloto. Medida de parámetros como especificidad y sensibilidad de los biomarcadores. Realización de ensayos clínicos prospectivos. Realización de ensayos clínicos retrospectivos. Desarrollo de un test de diagnóstico asociado al biomarcadore o a los biomarcadores. Establecimiento de los valores de especificidad, sensibilidad y utilidad clínica real del test. Figura 4. Etapas en el proceso de descubrimiento de un biomarcador. Fuente: elaboración propia. 12 Paulovic, A. G. et al. (2008). The interface between biomarker discovery and clinical validtion: The tar pit of the protein biomarker pipeline. Proteomics Clin. Appl., 2:1386-1402.

Biomarcadores para Uso Clínico 19 Etapa de identificación de posibles candidatos a biomarcador Durante la fase de identificación de biomarcadores, los candidatos a biomarcador pueden ser obtenidos a partir de la literatura científica existente o puede tratarse de biomarcadores de novo obtenidos mediante diferentes tecnologías. El objetivo es conseguir relacionar una característica con un hecho biológico que tenga relevancia clínica o que esté relacionado con el estado de salud/enfermedad. Para ello se buscan diferencias genéticas, proteicas o en niveles de metabolitos entre individuos sanos y enfermos. Se identifican diferentes biomarcadores y se busca la posible causa para descartar aquellos que no tengan relación con la enfermedad. En esta etapa del proceso existe un número elevado de candidatos a biomarcador, número que irá descendiendo progresivamente a medida que avance el estudio. Se parte de muestras biológicas en las que primero habrá que separar los distintos componentes que aparecen en ellas. Posteriormente y mediante el empleo de diferentes tecnologías se identificarán las diferentes proteínas, metabolitos o alteraciones en genes y se comparará siempre con muestras control para buscar aquellas diferencias que se convertirán en candidatos a biomarcador. Los principales cuellos de botella que pueden surgir en esta etapa del proceso son fundamentalmente problemas relacionados con cuestiones técnicas. Algunos de los principales retos técnicos característicos de esta fase del proceso de descubrimiento de nuevos biomarcadores serían hechos tales como: (i) el bajo nivel de correlación que existe para algunos genes y sus traducciones a proteína o, lo que es lo mismo, entre el número de copias de ADN o ARN existentes y el nivel real de proteínas que se traducen a partir de este material genético; (ii) rango dispar de concentraciones de proteínas en sangre; (iii) dificultades de acceso y procesado de muestras en tejidos distintos del sanguíneo; (iv) dificultad para estudiar proteomas completos que puedan dar una idea global de un proceso biológico. Debido al elevado número de candidatos a biomarcador que surgen en la etapa de identificación, es interesante realizar un paso intermedio de priorización de candidatos antes de continuar con el proceso de descubrimiento de nuevos biomarcadores. En esta etapa se trataría de dar prioridad a la investigación con aquellos candidatos que muestren más posibilidades de tener una utilidad clínica real. La fiabilidad de los datos, su potencial valor clínico y el análisis bioinformático son algunos de los criterios que se deben contemplar en la etapa de priorización 13. Continuando con el proceso de descubrimiento de nuevos biomarcadores, y antes de comenzar con la validación clínica de los candidatos, es interesante realizar un paso previo de verificación, que tendría por objeto determinar si existe una evidencia científica lo suficientemente importante sobre la utilidad clínica del biomarcador como para continuar con el proceso. Para ello se deben realizar análisis estadísticos que evalúen el significado estadístico de las diferencias entre los valores obtenidos previamente en el estudio para individuos sanos y enfermos. Del mismo modo debe realizarse un estudio piloto (con un número de individuos más reducido que en un ensayo 13 Vivanco, F. (2008). Proteómica y Medicina. Curso de biotecnología aplicada a la salud humana. CIEMAT - Amgen.

20 Genoma España clínico) en el que deben analizarse los mismos criterios que se emplean para la validación clínica de un test de diagnóstico, sensibilidad y especifidad (criterios de los que se habla en profundidad en el apartado 4 del presente Informe). A partir de este punto, el coste de la investigación se encarece de forma muy notable debido a la puesta en marcha de los estudios de validación clínica, por ello es interesante incluir una fase de verificación que permita examinar mediante estudios piloto el mayor número posible de candidatos a biomarcador. Etapa de validación clínica de los biomarcadores Los grandes avances que han experimentado en los últimos años las tecnologías ómicas han supuesto la aparición de un número muy elevado de biomarcadores susceptibles de ser aplicados en la práctica clínica como herramientas de diagnóstico, pronóstico o bien como elementos de predicción de la aparición de diferentes patologías. Pero este boom en la producción científica y en la investigación sobre nuevos biomarcadores no ha venido acompañado por una disponibilidad de dichos avances científicos en la realidad clínica. Este pronunciado desequilibrio entre producción científica y realidad clínica está motivado, entre otros factores, por la falta o las deficiencias en el proceso de validación clínica de los nuevos biomarcadores. Se trata de un punto crítico de la investigación en biomarcadores de cara a su traslación a la práctica clínica. Este es uno de los cuellos de botella más importantes a los que se enfrenta la investigación con biomarcadores, ya que definir el momento exacto en el que se puede considerar que un biomarcador está completamente validado es una tarea compleja. Definición de biomarcador validado: Un biomarcador puede considerarse como biomarcador validado cuando puede ser medido fácilmente mediante un test que tenga unas características bien establecidas y para el que existe un marco científico o un conjunto de evidencias que pongan de manifiesto la fisiología, toxicología, farmacología o significado clínico de los posibles resultados del test 14. No existe un baremo objetivo que mida el nivel de validación del biomarcador en la práctica clínica, pero lo que si se va consiguiendo durante el proceso de validación es un aumento en la certeza de la validez del mismo. Esta certeza irá aumentando a medida que se desarrollen ensayos clínicos que demuestren la utilidad clínica real del biomarcador, su validez clínica y su seguridad. Por este motivo, el proceso de validación de biomarcadores es una tarea larga y costosa. Por otra parte, cada biomarcador debe ser validado para cada uso específico que se le quiera asignar, es decir el criterio de validación de un biomarcador que 14 US Food and Drug Administration. (2005). Guidance for industry-pharmacogenomic data submissions. Disponible en la dirección http://www.fda.gov/cder/guidance/6400fnl.pdf

Biomarcadores para Uso Clínico 21 quiere ser utilizado como test de exploración de poblaciones asintomáticas será muy distinto del criterio que se emplearía para validar un biomarcador que pretenda medir la posible respuesta frente a un tratamiento farmacológico, por citar un ejemplo. Por último, para que el biomarcador se considere completamente validado tiene que incorporarse a la rutina clínica. Para ello, ha de desarrollarse un test diagnóstico sencillo que detecte la presencia de biomarcador de manera precisa y robusta. Este proceso es largo y costoso, pudiendo llegar a ser tan complejo como el proceso de desarrollo de un nuevo fármaco 15. Antes de introducir en la práctica clínica un nuevo test de diagnóstico es imprescindible cumplir ciertas obligaciones en cuanto a calidad de producción, y realizar una serie de valoraciones sobre la eficacia, efectividad y eficiencia del test de diagnóstico, impacto económico, impacto sobre la organización de los servicios sanitarios y los aspectos éticos y sociales que pueden acompañar a la introducción de la prueba dentro de dichos servicios 16. Estos puntos son tratados en mayor profundidad en el apartado 4 del presente Informe. Muestra procedente de un paciente Identificación de posibles biomarcadores mediante el empleo de las diferentes tecnologías ómicas Determinación de la posible aplicación del biomarcador: Diagnóstico Predictivo Pronóstico Respuesta a terapia Validación clínica del biomarcador Aprobación para uso exclusivo en investigación Aprobación por Agencias Reguladoras para uso humano Estudio de coste-beneficio Uso del biomarcador en la práctica clínica Figura 5. Cronología de la investigación con biomarcadores y de su posterior traslado a la clínica. Fuente: adaptado de Molitoris, A. et al. (2008). Technology Insight: biomarker development in acute kidney injury-what can we anticipate? Nature Clinical Practice Nephrology, 4:154-165. 15 Del Barrio, J. (2008). Investigación traslacional y Medicina Genómica. I+D en la Industria Farmacéutica. Foro Integra Instituto Roche. Publicado on-line http://www.institutoroche.es/ actividades2.php?ap=formacion&taula=formacion&id=100&pc=revisiones 16 Márquez Calderón, S. y Briones Pérez de la Blanca, E. Marco para la evaluación de las pruebas genéticas en el Sistema Sanitario Público de Andalucía. Sevilla: Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitaria, 2005. Informe 2/2005.

22 Genoma España 3.2. Técnicas implicadas en el proceso de identificación y validación de nuevos biomarcadores Existe un elevado número de tecnologías que participan en el proceso de descubrimiento de biomarcadores. Desde los métodos tradicionales de análisis de genes, proteínas y metabolitos hasta las tecnologías de alto rendimiento actuales entre las que se incluyen las tecnologías surgidas en el seno de la genómica, la proteómica, la metabolómica, la biología de sistemas o las técnicas de imagen molecular. A continuación, se presentan las principales tecnologías surgidas en la Era del Genoma Humano que permiten la identificación y validación de biomarcadores. 3.2.1. Genómica La genómica se define como la disciplina científica que se encarga del estudio del conjunto total de genes o genoma de los seres vivos. A principios del año 2001 se publicó el primer borrador del genoma humano y dos años después se presentó la versión completa del mismo. A raíz del Proyecto Genoma Humano han surgido una serie de proyectos internacionales, cuyo objetivo es transformar la gran cantidad de información genómica obtenida mediante la secuenciación completa del genoma en conocimiento de utilidad para su aplicación en la práctica clínica. La búsqueda de biomarcadores de tipo génico se basa en el análisis de alteraciones en la expresión o en la secuencia de genes junto con el estudio de las modificaciones epigenéticas, de las que se habla en el apartado 2 del presente Informe, para encontrar aquellas diferencias entre individuos sanos o controles e individuos afectados por la patología. El presente apartado trata de diferentes variantes de la tecnología de microarrays, así como del genotipado en relación al descubrimiento de biomarcadores de tipo génico. Microarrays Los microarrays consisten en una colección de moléculas inmovilizadas sobre un soporte en localizaciones conocidas. Estas moléculas inmovilizadas pueden ser fragmentos de ADN (microarrays de ADN), proteínas (microarrays de proteínas), carbohidratos o azúcares complejos (microarrays de carbohidratos), células (microarrays de células) y muestras de tejidos (microarrays de tejidos) 17. En el caso de los arrays de expresión, las sondas utilizadas pueden ser moléculas de oligonucleótidos 18 o de ADN complementario 19 (ADNc). 17 López, M.; Mallorquín, P. y Vega, M. (2005). Aplicaciones de los microarrays y biochips en salud humana. Informe de Vigilancia Tecnológica. GENOMA ESPAÑA/CIBT-FGUAM. 18 Oligonucleótido: secuencia corta de nucleótidos de una sola hebra, con entre 11 y 50 nucleótidos. 19 ADN complementario: fragmento de ADN que se sintetiza a partir de un ARN mensajero.

Biomarcadores para Uso Clínico 23 La utilidad de esta tecnología en la búsqueda de nuevos biomarcadores radica en su capacidad para medir alteraciones en los niveles de expresión génica. La correlación entre estas alteraciones y las distintas patologías, permite identificar aquellos genes candidatos a convertirse en nuevos biomarcadores. Esta metododología consiste en extraer el ARN mensajero (ARNm) de una muestra problema (por ejemplo, de tejido enfermo) y de una muestra control de un individuo sano. El ARNm se copia a ADNc mediante un proceso de transcripción inversa que aporta mayor estabilidad a la molécula y que permite añadir marcadores para su detección. Este ADNc marcado será entonces incubado en el microarray, que dispondrá de sondas específicas para genes concretos. La señal que emite el ADNc es cuantificada mediante un software, lo que permite determinar si el gen se expresa más o menos en la muestra problema, convirtiéndose así en un candidato a biomarcador. Dichos genes han de ser posteriormente validados en un conjunto mayor de muestras empleando tecnologías diferentes a los microarrays, tales como la PCR cuantitativa a tiempo real, que permite analizar un número menor de genes en un gran volumen de muestras de manera simultánea 20, o mediante el empleo de arrays de tejidos (este punto es tratado en profundidad en el presente apartado). Tejido sano Muestra A Tejido sano Muestra B Interpretación A > B B > A Extracción ARNm A = B A B Combinación de ambas señales fluorescentes ADNc marcado con sondas fluorescentes Hibridación con ADN inmovilizado Incidencia luz fluorescente Emisión de fluorescencia Figura 6. Análisis de la expresión génica mediante microarrays de ADN. Fuente: López. M.; Mallorquín, P. y Vega, M. (2005). Aplicaciones de los Biochips y Microarrays en salud humana. GENOMA ESPAÑA/CIBT-FGUAM. 20 Perkel, J. M. (2008). Genomic biomarker discovery: bringing the genome to life. Science. Life Science Technologies, 28 de marzo de 2008: 1853-1855.

24 Genoma España La literatura científica recoge un elevado número de estudios que emplean arrays de expresión con el objetivo de identificar biomarcadores. Se trata de un campo de investigación muy activo y cuyos resultados empiezan a trasladarse a la práctica clínica. Prueba de ello es que hasta la fecha el primer test pronóstico aprobado por la FDA, se basa en esta tecnología. El test denominado Mammaprint, analiza la expresión de 70 genes con el objetivo de establecer un pronóstico de pacientes con cáncer de mama (este punto es revisado en profundidad en el apartado 4.2 del presente Informe). Resumen del papel de los microarrays de expresión en la búsqueda de biomarcadores Papel en el proceso de descubrimiento de biomarcadores Identificación de biomarcadores Validación de biomarcadores Principales Ventajas Posibilidad de realizar un análisis de la expresión de un elevado número de genes en un solo experimento permitiendo de esta forma obtener firmas moleculares asociadas a un estado patológico. Rapidez del análisis. Tecnología asentada. Principales Inconvenientes Problemas relacionados con la reproducibilidad de los experimentos (inestabilidad de las muestras biológicas, problemas relacionados con el marcaje de las muestras y en la detección, problemas de estandarización de los experimentos, variabilidad en la calibración de los distintos instrumentos utilizados en los experimentos). Necesidad de validar los resultados obtenidos con otras técnicas (PCR cuantitativa, arrays de tejidos). Complejidad del análisis de los datos de expresión obtenidos. Los cambios en los perfiles de expresión de genes no siempre reflejan los cambios que se producen en la función de las proteínas expresadas por dichos genes. No permiten detectar polimorfismos germinales. Los resultados obtenidos en los experimentos son altamente dependientes de la selección de las muestras. Tabla 1. Ficha resumen del papel de los microarrays de expresión en la búsqueda de biomarcadores. Fuente: elaboración propia. Arrays de Hibridación Genómica comparada Los CGH arrays o arrays de hibridación genómica comparada detectan ganancias y pérdidas de regiones del genoma. Estos arrays permiten realizar la búsqueda de anomalías en la secuencia de ADN sobre todo el genoma del individuo, sin disponer de información previa de la anomalía en cuestión 21. 21 Galán, E. (2002). Aplicaciones del laboratorio de citogenética a la clínica. Pediatr. Integral, 6(9):820-830.

Biomarcadores para Uso Clínico 25 Una de las posibles anomalías que puede presentar la secuencia de ADN son las mutaciones que afectan a fragmentos cromosómicos. Pertenecen a este tipo de mutaciones anomalías como deleciones (pérdidas de fragmentos), inserciones, duplicaciones de fragmentos cromosómicos o traslocaciones, que en conjunto se conocen con el nombre de variaciones en el número de copias 22. Este tipo de alteraciones sobre la secuencia del ADN está directamente relacionado con el desarrollo de diferentes patologías, como el Síndrome de Williams en el que los afectados sufren problemas de desarrollo 23, por citar un ejemplo. La metodología básica de la técnica consiste en llevar a cabo un proceso de hibridación competitiva entre las muestras de ADN. Por una parte se tiene el ADN-problema marcado con un flurocromo concreto y el ADN-control marcado con otro flurocromo distinto. Ambos ADN se hibridan sobre sondas de fragmentos genómicos depositadas en el array. Mediante un programa informático se cuantifica la cantidad de un fluorocromo y otro, estableciéndose ganancias o pérdidas del material genético en función de la proporción de cada color. Ejemplo de búsqueda de posibles biomarcadores mediante el empleo de CGH arrays La empresa qgenomics, constituida por investigadores del Centro de Regulación Genómica, ha desarrollado una cartera de servicios de diagnóstico basados en la tecnología CGH array. Cuentan entre otros con kits de diagnóstico preimplantatorio y postnatal para numerosos trastornos genéticos recurrentes asociados con anomalías de ganancias o pérdidas cromosómicas. Algunos ejemplos son los síndromes de Williams, Angelman y Prader-Willi, entre otros. Por otra parte, también es importante señalar que una de las áreas de estudio con mayor actividad investigadora con esta tecnología es la oncología. La amplificación y deleción de oncogenes y genes supresores de tumores son eventos comunes en la progresión del cáncer. Conseguir identificar las alteraciones de dichos segmentos genómicos proporcionará nuevas herramientas para el correcto diagnóstico del cáncer 24. 22 El estudio de este tipo de mutaciones se lleva a cabo mediante el análisis del cariotipo por el que se observan los cambios estructurales o en el número de cromosomas de un individuo. El método tradicional de análisis del cariotipo es la observación del número de cromosomas mediante microscopía óptica. Una de la principales limitaciones que presenta esta técnica es su escasa resolución, no siendo posible la detección de micro-alteraciones, es decir, de pérdida o ganancia de pequeños fragmentos de ADN. La tecnología denominada Hibridación in situ con fluorescencia FISH en sus siglas en inglés, permite el estudio de pequeñas anomalías en la secuencia de ADN tales como deleciones, inserciones o traslocaciones. Para ello se emplean sondas de ADN marcadas con fluoróforos en los puntos donde presuntamente podría localizarse la anomalía, que se unen por complementariedad de bases con la muestra de ADN problema. 23 MedlinePlus, Enciclopedia médica de salud http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/ article/001116.htm 24 Davies, J. et al. (2005). Array CGH technology and their applications to cancer genomes. Chromosome research, 13:237-248.

26 Genoma España Resumen del papel de los CGH arrays en la búsqueda de biomarcadores Papel en el proceso de descubrimiento de biomarcadores Identificación de biomarcadores Validación de biomarcadores Principales Ventajas Permiten detectar ganancias y pérdidas de regiones del genoma. Capacidad de detectar polimorfismos géneticos en líneas germinales. Permiten realizar búsquedas de anomalías en la secuencia de ADN sin disponer de información previa de la anomalía en cuestión. Principales Inconvenientes No permiten detectar inversiones o traslocaciones del material genético. Las ganancias o pérdidas de regiones del genoma no implican siempre la aparición de una patología. No permiten detectar modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Tabla 2. Ficha resumen del papel de los CGH arrays en la búsqueda de biomarcadores. Fuente: elaboración propia. Genotipado de SNP Las técnicas de genotipado consisten en el estudio de la diversidad genética mediante el análisis de las variaciones existentes en el genoma entre individuos y poblaciones 25. Una de las variaciones más comunes que pueden aparecer en el genoma son los denominados SNP (del inglés Single Nucleotide Polymorphism) o polimorfismos de una sola base que consisten en substituciones de una base por otra de la secuencia de ADN. Este tipo de mutaciones es muy frecuente en la población. Los SNP pueden aparecer en cualquier parte del genoma tanto en regiones codificantes 26, como en regiones no codificantes 27 o en regiones intergénicas en las que aparentemente no deberían tener consecuencias sobre el fenotipo. 25 López, M.; Mallorquín, P. y Vega, M. (2005). Técnicas de genotipado en la salud humana. Informe de Vigilancia Tecnológica. GENOMA ESPAÑA / CIBT-FGUAM. 26 Las mutaciones en regiones del ADN que se traducen a proteínas pueden repercutir sobre la estructura o función de la proteína que se sintetiza a partir de ese gen. 27 Regiones no codificantes: zonas dentro de un gen que no se traducen en proteínas, tales como intrones, promotores, zonas de splicing, etc. Las mutaciones que aparecen en estas zonas pueden tener consecuencias sobre el nivel de expresión de la proteína que codifica el gen.

Biomarcadores para Uso Clínico 27 Gen G C G C A T G C SNP Cromosoma T A C G T A C G Figura 7. SNP como marcadores de enfermedad. Fuente: https://www.celera.com/celera/cdx_discover De forma práctica el objetivo de un experimento de genotipado de SNP radica en la detección de polimorfismos de la cadena de ADN mediante distintas metodologías y procesos con distinto grado de idoneidad en función del número de SNP y el número de muestras que se quieran analizar. Generalmente, son necesarias grandes plataformas robotizadas con un adecuado control de calidad y en la mayoría de países avanzados se han generalizado los centros nacionales de genotipado. En la Tabla 3 se presenta una clasificación de las distintas técnicas de genotipado en función de las tecnologías que permiten la amplificación, identificación y detección de los SNP. TÉCNICAS IMPLICADAS EN EL GENOTIPADO DE SNP Amplificación de la muestra Discriminación alélica Mecanismos de detección Formatos de reacción PCR Amplificación de ADN por círculo rodante Método Invader Hibridación Extensión de cebadores Ligamiento Rotura Luminiscencia Fluorescencia Fluorescencia time-resolved Transferencia de energía entre fluorocromos Fluorescencia por polarización Electricidad Espectrometría de masas Electroforesis capilar Reacciones homogéneas Reacciones en un soporte sólido (microarrays de ADN) Tabla 3. Técnicas implicadas en el genotipado de SNP de alto rendimiento clasificadas en función de las tecnologías que permiten la amplificación, identificación y detección de los SNP. Fuente: López, M.; Mallorquín, P. y Vega, M. (2005). Técnicas de genotipado en la salud humana. Informe de Vigilancia Tecnológica. GENOMA ESPAÑA / CIBT-FGUAM. La mayor parte de los SNP que se encuentran distribuidos por el genoma son mutaciones silenciosas que no tienen consecuencias sobre el fenotipo de los individuos, pero alrededor del 20% de los polimorfismos detectados hasta la fecha se encuen-