FACULTAD DE MEDICINA DE SEVILLA. PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA. SEGUNDO CICLO. - DIAGNÓSTICO DIRECTO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS DE ETIOLOGÍA FÚNGICA. - DIAGNOSTICO INDIRECTO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. Día 1: Día 2: Día 3: Diagnóstico directo de las infecciones de etiología fúngica: - Observación macroscópica de levaduras del género Candida. - Observación microscópica: Examen en fresco/tinciones. - Inoculación del medio cromogénico. Introducción a las técnicas de diagnóstico indirecto. Detección de anticuerpos frente a Brucella: - Prueba del Rosa de Bengala. - Prueba de microaglutinación. Observación de Western-blotting de VIH. Lectura e interpretación del medio cromogénico. Lectura e interpretación de la prueba de microaglutinación. Los alumnos no tienen necesidad de tomar apuntes de las explicaciones del profesor de prácticas pues el guión de prácticas está colgado en la página web del dpto.
DIA 1º: DIAGNÓSTICO DIRECTO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS DE ETIOLOGÍA FÚNGICA. INTRODUCCIÓN. Para poder establecer la etiología de las micosis, al igual que sucede con la mayoría de las enfermedades infecciosas de etiología bacteriana, se utilizan principalmente técnicas de diagnóstico directo, bien por el aislamiento del hongo causal o mediante la detección de alguno de sus componentes estructurales. En la mayoría de los casos el diagnóstico microbiológico se realiza mediante cultivo, a partir de muestras clínicas adecuadas. Las levaduras del género Candida constituyen la principal causa de micosis invasivas. La especie que con más frecuencia se aísla a partir de muestras clínicas es C. albicans, pero otras especies, tales como C. glabrata, C. tropicalis. C. parapsilosis, C. krusei, C. guillermondi y C. dublinensis, también se aíslan con relativa frecuencia. Candida spp. crece bien en los medios de cultivo que habitualmente se utilizan en bacteriología, dando lugar a colonias de crecimiento rápido (18-24h), circulares, lisas, blaquecinas, muy parecidas a las de las bacterias. La apariencia macroscópica de las distintas especies de Candida es muy uniforme y lo mismo sucede con su aspecto microscópico. Con la tinción de Gram, aunque no es una tinción para hongos, se tiñen como los Gram positivos de color violeta. La identificación a nivel de especie tiene importancia ya que sirve para orientar el tratamiento empírico hasta que se disponga de los datos de sensibilidad a los antifúngicos. Para ello se pueden utilizar medios diferenciales cromogénicos en los que las especies C. albicans, C. tropicalis y C. krusei se identifican porque crecen dando lugar a colonias con colores característicos. Las otras especies dan lugar a colonias con diversas gamas de colores que no permiten su identificación, por lo que es necesario realizar pruebas adicionales como asimilación de distintos azúcares y otros compuestos. 2
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA. 1. Observación macroscópica de colonias de levaduras en medio de Columbia. 2. Observación microscópica: Examen en fresco y tinción con azul de metileno 3. Subcultivo en medio cromogénico diferencial. 1. Observación macroscópica de colonias de levaduras en Columbia: Anotar la morfología, tamaño, color, olor,... Compararla con la de los otros compañeros de fila. 2. Observación microscópica: - Examen en fresco: Se realiza colocando el material a estudiar entre porta y cubreobjetos, observándose posteriormente con objetivo de mediano aumento (40X) o sea, sin aceite de inmersión. Un hecho a tener en cuenta es que se trabaja con microorganismos vivos, por lo que se deben extremar los cuidados para evitar la contaminación. Procedimiento: 1. Depositar con el asa una gota de agua en el centro del porta. 2. Tocar con el asa estéril una colonia. 3. Resuspender el material recogido en la gota de agua. 4. Cubrir con el cubre. 5. Observar al microscopio con el objetivo de 40X. - Tinción con azul de metileno: se trata de una tinción simple (utiliza un solo colorante). Procedimiento: 1. Suspensión. 2. Extensión. 3. Secado de la preparación. 4. Fijación con calor. Dejar enfriar después. 5. Cubrir el porta con azul de metileno y dejar actuar 1 min. 6. Lavar con agua. 7. Secar. 8. Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100X). 3
3. Subcultivo en medio cromogénico diferencial - Tocar con el asa la zona donde se inició la siembra en la placa de Columbia (zona con mayor densidad de colonias) y sembrar en aislamiento la placa de Cromogen. Inicio siembra Esterilizar el asa - Incubar a 37ºC durante 48 horas. 4
DIA 2º: TECNICAS DE DIAGNÓSTICO INDIRECTO INTRODUCCIÓN. Hay muchos agentes productores de enfermedades infecciosas que son muy difíciles o imposibles de cultivar, no pudiendo utilizar para su diagnóstico las técnicas basadas en el cultivo e identificación posterior. Así por ejemplo: Hay bacterias que requieren muchos factores de crecimiento; siendo muy difícil su cultivo. (T. pallidum). Los virus, si crecen, necesitan para ello cultivos celulares, que implican mucho tiempo y material caro (ej. Citomegalovirus) o bien no crecen (Epstein Barr). En estos casos podemos a poner de manifiesto la posible infección mediante la detección de anticuerpos producidos frente al microorganismo causal en el suero o a veces otras muestras del paciente. Estas técnicas nos permitirán hacer un Diagnóstico Indirecto de la enfermedad. Además, el estudio de los anticuerpos puede valorar la evolución de una enfermedad, la eficacia de un tratamiento o el estado inmune de la población. TOMA DE MUESTRA. Estas determinaciones, salvo excepciones (LCR...) se van a realizar en suero. Con estas técnicas podremos determinar tanto las inmunoglobulinas globales (IgG + IgM) o bien sólo la IgM, la IgG, o en algunos casos especiales otras Ig (IgA). la siguiente: La evolución de estas inmunoglobulinas en el curso de una infección primaria es 5
IgM IgG F Aguda F Convalescencia La detección de inmunoglobulinas totales o de IgG en una muestra de suero nos indicará la prevalencia de anticuerpos frente a una infección o bien que el paciente ha tenido previo contacto con el agente infeccioso. Solamente en caso de títulos muy altos podría tener valor diagnóstico. La presencia de IgM indica que la infección está en actividad por lo que una sola determinación podría ser diagnóstica (aunque existen excepciones). Normalmente lo que se hace es la determinación de inmunoglobulinas totales en dos sueros del paciente, uno tomado en la fase aguda de la enfermedad y otro en la fase de convalecencia (separación 15-20 días) y lo que vamos a valorar es un aumento significativo (4 diluciones ó más) en los títulos de anticuerpos. A esto lo denominamos Seroconversión. 6
TÉCNICAS. Aglutinación: Se usa cuando queremos poner de manifiesto anticuerpos frente a antígenos grandes (Brucella, Salmonella, Toxoplasma). Si hay Ac, estos se unirán al Ag formando una malla tridimensional que se ve a simple vista. Si no hay Ac, el Ag sedimentará en el fondo del pocillo formando un botón. - Lectura positiva: Malla que cubre todo el fondo del pocillo. - Lectura negativa: Punto o botón en el centro del pocillo. Hemaglutinación: Para Ags pequeños se utiliza un soporte que haga la reacción visible. En este caso son hematíes. Aglutinación con partículas de Latex: Es similar a la hemaglutinación, Aquí el soporte son partículas de látex. Fijación del complemento: Pone de manifiesto la IgM (que es la que más fija el complemento) o grandes cantidades de IgG. Por tanto es útil para detectar una infección en actividad y no para determinar el estado inmune. Si hay Ac, frente al Ag estudiado, la unión Ag-Ac va a fijar el complemento y a consumirlo. Para poderlo visualizar vamos a utilizar como sistema indicador el complejo Hematíes-Hemolisina. - Lectura positiva: botón o punto. Si había Ac frente al Ag no quedará complemento libre y la hemolisina no lisará los hematíes ocurriendo la precipitación de los mismos (Botón en el fondo). - Lectura negativa: no sedimentación de hematíes (agua de lavar carne) Si no había Ac, quedará complemento libre y éste será fijado por el complejo hemolisina-hematíes ocurriendo la lisis de hematíes. (Agua de carne). Inmunofluorescencia indirecta: Para poner de manifiesto la unión Ag-Ac utilizamos antigammaglobulinas, es decir, anticuerpos dirigidos contra gammaglobulinas (anticuerpos) humanos marcados con fluoresceína. Podemos poner de manifiesto bien los anticuerpos totales ó solo la IgM. Es una de las 7
técnicas más usadas en la actualidad. Se emplea por ejemplo para el diagnóstico de las infecciones producidas por Treponemma pallidum, Legionella, Toxoplasma, virus de Epstein Barr,... Ensayos inmunoenzimáticos (ELISA): En este caso la unión Ag-Ac se pone de manifiesto mediante anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos humanos que van unidos a un enzima. Este enzima va a catalizar una reacción de cambio de color cuando se le añada un sustrato específico. - Lectura positiva: Cambio de color. - Lectura negativa: Permanece el mismo color. Inmunoblotting o Western-blotting. Permite detectar Ac frente a proteínas (antígenos) de los microorganismos, previamente separadas mediante electroforesis y posteriormente transferidas a una membrana, mediante la realización de un inmunoensayo empleando la metodología antes indicada. Es una técnica de gran especificidad y se emplea, además de cómo herramienta de investigación, en el diagnóstico de las infecciones por virus, por ejemplo el VIH. 8
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA. Técnicas para la detección de anticuerpos frente a brucella: o Prueba del Rosa de Bengala. o Prueba de microaglutinación. 1. Detección de anticuerpos frente a Brucella: Prueba del Rosa de Bengala Fundamento: El Antígeno coloreado Rosa de Bengala permite una detección precoz de las aglutininas (anticuerpos) específicos que aparecen en la Brucelosis. Método: 1. Depositar en los círculos correspondientes de la tarjeta plastificada 50 ul del suero problema y 50 ul del control positivo. 2. Añadir en ambos círculos una gota del antígeno (suspensión concentrada de Brucella abortus 99 inactivada por calor y fenol y coloreada con Rosa de Bengala). 3. Mezclar con un palillo de plástico hasta homogeneizar. 4. Agitar lentamente y en círculos la tarjeta durante 4 minutos. Lectura: Debe hacerse a los 4 minutos, no más tarde, aunque es posible que el resultado positivo se observe antes. - No hay aglutinación: Suero negativo - Hay aglutinación: Presencia de anticuerpos. El resultado debe ser corroborado por otras técnicas de diagnóstico indirecto, p. ej. Microaglutinación. 2. Prueba de microaglutinación Método: Se realiza en placa de microtitulación. Disponemos de un control positivo, de un control negativo, y de dos sueros problema, uno obtenido en la fase aguda de la enfermedad y otro durante la fase de convalecencia. Todos los sueros se han diluido previamente 1/10 (dilución inicial de referencia). 1. Añadir 50 ul de suero salino en todos los pocillos de las 4 primeras filas de la placa, con excepción del primero que lo dejaremos vacío en todas las filas. 2. Añadir 50 ul. Del control positivo en los pocillos 1 y 2 de la primera fila. Mezclar con pipeta el contenido del pocillo 2 y transferir 50 ul del contenido al pocillo 3. 9
Mezclar con pipeta el contenido del pocillo 3 y transferir 50 ulñ del contenido al pocillo 4. Proceder de forma similar para los demás pocillos de esta fila excepto con el último que quedará sólo con suero fisiológico, para actuar como control del antígeno. La dilución del suero inicial es 1/10, y en los sucesivos pocillos es de 1/20, 1/40,... 3. Utilizando puntas diferentes se tealiza lo mismo con el control negativo, con el suero en fase aguda y con el suero en fase convaleciente, en las filas 2, 3 y 4 respectivamente. 4. Poner 50 ul del antígeno en todos los pocillos. 5. Agitar la placa suavemente durante 3 minutos e incubarla a 37º C durante 24 horas. Tapándola para evitar la desecación. Lectura: Se consideran positivos los pocillos donde se observa aglutinación en sábana ocupando todo el fondo del pocillo. El pocillo testigo (último de cada fila) debe ser negativo, es decir, debe observarse un botón de sedimentación en el centro del pocillo. Negativo: botón, por sedimentación del antígeno. Positivo: aglutinación en sábana, por la interacción Ag-Ac 10
PLAN DE ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTE EN EL LABORATORIO DE PRACTICAS DE ALUMNOS Ante un derrame Usar guantes Los residuos derramados se empaparán en papel secante. El papel utilizado se desechará en el contenedor de residuos. Limpiar la superficie con lejía (las botellas de lejía están situadas en la ultima banca) Ante salpicadura Lavarse con agua y jabón Si la salpicadura se ha producido en el ojo, lavar de manera abundante con suero salino (existe una botella con suero salino en la última banca) Ante una quemadura Lavar la zona afectada con agua No quitar la ropa si está pegada a la piel Acudir a urgencias Ante un fuego Cortar el gas Usar los extintores Retirar los productos inflamables NOTA: No realizar nunca la tinción con el mechero encendido. 11
GESTION DE RESIDUOS EN EL LABORATORIO El material contaminado, (placas, tubos, guantes y papel contaminado) se deposita en los contenedores de residuos biológicos con bolsas autoclavables. Posteriormente serán esterilizados en el autoclave. Las torundas, pipetas pasteur y puntas de pipetas. se depositan en los vasos de precipitado autoclavables. Posteriormente serán esterilizados en el autoclave. El material contaminado cortante o punzante y no plástico, se deposita en los contenedores amarillos (portas de cristal y agujas). Estos residuos son retirados por la entidad gestora correspondiente (Universidad) Los restos de basura normal (papel de las manos, folios, etc) se depositan en el contenedor negro de basura normal y posteriormente en los contenedores urbanos. 12