CMVIgMELA Test PKS medac Castellano/Português 0123 110PKSVPSP/211004
FABRICANTE/FABRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUCION/DISTRIBUIDOR medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel: ++49/ 4103 / 8006 0 Fax: ++49/ 4103 / 8006 359 DIRECCION DE PEDIDOS/ENDERECO PARA ENCOMENDAS Tel.: ++49/ 4103 / 8006 111 Fax: ++49/ 4103 / 8006 113 Castellano... Página 1 12 Português... Página 13 23 Bibliografia/Referencias/Referências... Página 24 110PKSVPSP/211004
CMVIgMELA test PKS medac Enzimoinmunoensayo con Sistema de Control de Pipeteo (PKS) para la detección de anticuerpos IgM frente al citomegalovirus (CMV) Cat. no.: 110/PKS PARA USO EXCLUSIVO EN EL DIAGNOSTICO IN VITRO. INTRODUCCION El citomegalovirus (CMV) pertenece a la familia de los herpesvirus humanos patógenos que se caracterizan por tener un ADN genómico de cadena doble. Una característica de estos virus es que permanecen de forma latente en el organismo tras una infección primaria, pudiendo reactivarse ante diversas circunstancias. Las infecciones por citomegalovirus que tienen lugar en individuos inmunocompetentes, normalmente cursan de forma asintomática, pero en individuos inmunodeprimidos (por ejemplo: pacientes transplantados, pacientes infectados por VIH, pacientes con tumores y neonatos) las infecciones producen una variedad de síntomas graves. El CMV es uno de los patógenos más frecuentes en las infecciones prenatales que pueden causar una serie de alteraciones graves, incluyendo daños posteriores al nacimiento en niños asintomáticos. El test de Medac CMVIgMELA PKS puede aplicarse para la detección de anticuerpos IgM específicos del CMV en muestras de suero. Una infección aguda producida por CMV puede diagnosticarse mediante la detección de los anticuerpos IgM, aunque debe considerarse que no siempre se producen estos anticuerpos. En pacientes inmunodeprimidos, por ejemplo, los anticuerpos IgM frente al CMV raramente pueden detectarse durante las reactivaciones y las reinfecciones. 110PKSVPSP/211004 1
Además del CMVIgMELA test PKS medac Cat. no.: 110/PKS para 96 determinaciones también distribuímos los siguientes productos: CMVIgGELA test PKS medac Cat. no.: 115/Q/PKS para 96 determinaciones CMVIgGELA test PKS medac Cat. no.: 115/PKS para 96 determinaciones, CMVIgGELA test PKS medac Cat. no.: 116/PKS para 5 x 96determinaciones CMVIgAELA test PKS medac Cat. no.: 112/PKS para 96 determinaciones 2 110PKSVPSP/211004
PRINCIPIO DEL ENSAYO La placa está recubierta con inmunoglobulina antiigm humana. Los anticuerpos IgM presentes en la muestra se unen selectivamente a los pocillos. Los anticuerpos IgM específicos para el CMV, capturan el antígeno CMV marcado con peroxidasa (AG = antigeno; p = peroxidasa Incubación con el substrato TMB (*). La reacción se para mediante la adición de ácido sulfúrico. La absorbancia se lee fotométricamente. Ventajas del test No se obtienen resultados erróneos por reacciones inespecificas ni falsos positivos debido a la presencia del factor reumatoide. No se produce el bloqueo de la union de los anticuerpos por la presencia de títulos elevados de IgG. El Sistema del Control de Pipeteo permite monitorizar visualmente cada uno de los pasos de la técnica a través de cambios de color. Las tiras contienen pocillos separables, permitiendo un uso eficiente del test. Apropriado para la automización en aparatos de ELISA abiertos. 110PKSVPSP/211004 3
COMPONENTES DEL KIT Cat. no.: 110/PKS 1. MTP Microplaca: 12 x 8 pocillos (con el soporte y el desecante, sellados al vacío en una bolsa de aluminio), divisibles, forma U, recubiertos con inmunoglobulina anti IgM humana, BSA e indicador de ph, listo para usar. 2. CONTROL Control negativo : 2 viales, cada uno con 0,75 ml de suero humano, listos para usar, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 3. CONTROL + Control positivo : 2 viales, cada uno con 0,75 ml de suero humano, listos para usar, conteniendo BSA, fenol, ProClin TM 300 y sulfato de gentamicina. 4. WB Solución de lavado: una botella con 100 ml, PBS/Tween (10 x), ph 7,2 7,4, conteniendo ProClin TM 300. 5. VIRDIL Diluyente de muestra: una botella con 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, listo para usar, conteniendo ProClin TM 300. 6. ANTIGEN CMVIgMELA (Antígeno Marcado Enzimáticamente): 2 viales, cada uno con 5,0 ml, liofilizados, conteniendo FCS, teñido de rojo y conjugadohrp. 7. TMB Substrato TMB: 1 vial con 10 ml, listo para usar. 8. STOP Solución de parada: 2 viales cada uno con 14 ml de 0,5 M ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ), listo para usar. 4 110PKSVPSP/211004
1. ALMACENAJE Y ESTABILIDAD MATERIAL/REACTIVO ESTADO ALMACENAMIENTO ESTABILIDAD Kit sin abrir 2 8 C Hasta la fecha de caducidad Microplaca abierto 2 8 C en la bolsa con 6 semanas desecante Controles abierto 2 8 C 6 semanas Solución de lavado diluido 2 8 C 6 semanas Diluyente de la abierto 2 8 C 6 semanas muestra CMVIgMELA reconstituido 2 8 C 5 días 18 C * 6 semanas Substrato TMB abierto 2 8 C 6 semanas Solución de parada abierto 2 8 C hasta fecha de caducidad * Alicuotar y no someter a más de un ciclo de congelación/descongelación! No usar los reactivos después de la fecha de caducidad. 2. REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN 2.1. Agua bidestilada. La utilización de agua desionizada puede alterar el procedimiento de la técnica. 2.2. Micropipetas ajustables. 2.3. Contenedores de cristal o plástico limpios para la dilución de la Solución de Lavado y de las muestras. 2.4. Aparatos apropiados para el lavado de la microplaca (p.ej. pipeta multicanal o lavador de ELISA). 2.5. Incubador a 37 C. 2.6. Lector de microplaca con filtros para 450 nm y 620 650 nm. 3. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Antes de comenzar con el procedimiento de la técnica, todos los componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente para prevenir la condensación. Calcular el número de pocillos que se necesitan. 110PKSVPSP/211004 5
3.1. Microplaca La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el desecante cada vez que se retiren los pocillos requeridos para la realización de la técnica. El almacenamiento y la estabilidad de los pocillos se indican en la tabla 1. Nota: los pocillos de la microplaca tienen un color verde luminoso. En algunas ocasiones puede verse una tinción marrón verdoso en el interior de los pocillos que se debe al proceso de producción y que no tiene ninguna influencia en la realización del test. 3.2. Solución de lavado Mezclar un volumen de solución de lavado (10 x) con 9 volúmenes de agua bidestilada (p. ej., 50 ml de solución de lavado (10 x) con 450 ml de agua bidestilada). Para 8 pocillos, se necesitan 10 ml de Solución de lavado diluida. Si se observan cristales en la solución de lavado (10 x), deberán disolverse por calentamiento (max. a 37 C), y /o agitación a temperatura ambiente. 3.3. CMVIgMELA Reconstituir cada vial del CMVIgMELA liofilizado con 5.0 ml del diluyente de la muestra. Mezclar suavemente, y vigilar que se disuelvan también las partículas que quedan adheridas al tapón del vial. Después de la reconstitución, el CMVIgGELA tiene color rojo y está listo para usar. No mezclar los reactivos específicos del ensayo procedentes de diferentes lotes del kit (microplaca, controles, CMVIgMELA). En contraste con esto, el diluyente de la muestra, el tampón de lavado, el substratotmb y la solución de parada, son en general reactivos que pueden intercambiarse en todos los kits para detección de virus por ELISA de medac. En general, no se recomienda la utilización de reactivos procedentes de otros fabricantes. Solamente se obtienen resultados válidos y reproducibles si se realiza el ensayo ajustándose fielmente al protocolo. 6 110PKSVPSP/211004
4. MUESTRAS 4.1. El ensayo es apropiado para muestras de suero. 4.2. No se necesita pretratamiento del suero, p. ej. inactivación. No obstante no deben estar contaminadas con microorganismos ni contener células rojas. 4.3. Los sueros tienen que diluirse a 1 : 100 con el diluyente de muestra, pudiéndose hacer diluciones seriadas para la determinación del título. 5 A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA 5.1. Cortar la bolsa de aluminio por la parte superior del cierre en cremallera y extraer el número de pocillos de la microplaca requeridos para la realización del test (ver 3.1). Los pocillos de la microplaca están listos para usar y no necesitan prelavado. 5.2. Dejar vacío el pocillo A1 como blanco (ver 6.A.). Añadir 50 µl de cada muestra diluída a cada pocillo, así como el control positivo y el control negativo a sus pocillos respectivos, por duplicado. Después de pipetear las muestras (líquidos de ph neutro o básico) los pocillos viran a color azul. Una pérdida en el cambio de color en alguno de los pocillos, indica que no se ha añadido la muestra o el control. Si es necesario, se pueden mantener los pocillos de la microplaca a temperatura ambiente en una cámara húmeda sin exceder 30 min., o entre 2 8 C sin exceder 60 min, antes del inicio de la técnica. 5.3. Incubar los pocillos de la microplaca durante 60 min (± 5 min.) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o alternativamente, cubrir la placa con una hoja adhesiva. 5.4. Reconstituir el CMVIgMELA (ver 3.3.). 5.5. Transcurido el tiempo de incubación, lavar 3 veces cada uno de los pocillos de la microplaca con 200 µl de la solución de lavado. Verificar que todos los pocillos están rellenos. Después del ciclo de lavado, sacudir la microplaca en papel secante. No dejar que se sequen los pocillos! Proceder inmediatamente! 110PKSVPSP/211004 7
5.6. Añadir CMVIgMELA (teñido de rojo) a cada pocillo (excepto A1). Si la técnica se realiza manualmente, deben pipetearse 50 µl de ELA en cada pocillo. Tener en cuenta: Cuando se trabaja con aparatos automáticos, deben pipetearse 60 µl de ELA a cada pocillo debido a la alta evaporación en las cámaras de incubación de los aparatos. Durante la evaluación del test se confirmó la posibilidad de su automatización. Sin embargo, se recomienda verificar la compatibilidad del test con los aparatos utilizados en el laboratorio. 5.7. Incubar nuevamente durante 60 min (± 5 min) a 37 C (± 1 C) en una cámara húmeda o alternativamente, cubrir la placa con una hoja adhesiva. 5.8. Tras la incubación, lavar de nuevo los pocillos de la microplaca (ver 5.5.) 5.9. Añadir 50 µl del substratotmb a cada pocillo (incluyendo el pocillo A1) e incubar durante 30 min. (± 2 min) a 37 C (± 1 C) en cámara húmeda en oscuridad, o alternativamente, sellar la microplaca con una hoja adhesiva. Las muestras positivas viran a azul. 5.10. La reacción se para añadiendo 100 µl de la solución de parada a cada pocillo (también al pocillo A1). Las muestras positivas viran a amarillo. Limpiar los pocillos de la microplaca por debajo antes de la lectura fotométrica y asegurarse de que no haya burbujas en el interior de los pocillos. La lectura debe de realizarse en los 15 minutos siguientes a la adición de la solución de parada! 8 110PKSVPSP/211004
5.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA Control negativo Control positivo Muestra Blanco (A1) Control negativo 50 µl Control positivo 50 µl Muestra 50 µl Incubar durante 60 min a 37 C, lavar 3 x con 200 µl solución de lavado. CMVIgMELA 50/60 µl *) 50/60 µl *) 50/60 µl *) Incubar durante 60 min.a 37 C, lavar 3 x con 200 µl de la solución de lavado. SubstratoTMB 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Incubar durante 30 min a 37 o C en oscuridad. Solución de parada 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer fotométricamente a 450 nm (ref. 620 650 nm) *)Para técnicas manual/automática (ver 5.6.) 6.A. CALCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION) Leer los valores DO a 450 nm (longitud de onda de referencia 620 650 nm). Restar el valor del blanco (pocillo A1) a todos los demás valores de DO. La media de los valores de la DO del control negativo tiene que ser < 0.100. La media de los valores de la DO del control positivo tiene que ser > 0.800. Cutoff = la media de los valores de la DO del control negativo + 0.140. Zona gris = cutoff ± 10 %. 110PKSVPSP/211004 9
6.B. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Muestras con valores de la DO por debajo del límite inferior de la zona dudosa, se informan como NEGATIVOS Muestras con valores de la DO dentro de la zona dudosa, se informan como DUDOSAS. Estas muestras deberían ensayarse nuevamente junto con una muestra reciente tomada 14 días más tarde con objeto de determinar un cambio en el título. Muestras con valores de la DO que superan el límite superior de la zona dudosa se informan como POSITIVAS. Los resultados deberían siempre interpretarse en relación con los datos clínicos y otros parámetros del diagnóstico. En muestras únicas no pueden excluirse reacciones cruzadas, originadas por anticuerpos frente a otros Herpesvirus. En muestras negativas las concentraciones elevadas de lípidos pueden ocasionar un resultado falso positivo. Concentraciones elevadas de hemoglobina o bilirubina, no influyen en los resultados de la técnica. 7. CARACTERISTICAS DEL ENSAYO Nosotros determinamos las siguientes características del ensayo durante la evaluación en el diagnóstico. 7.A. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD 482 muestras de suero pertenecientes a donantes de sangre y a pacientes, fueron estudiadas usando el kit de medac PKSELAIgM CMV y los resultados se compararon con otro kit de ELISA altamente específico que se utiliza en la rutina de los laboratorios. Los resultados obtenidos, se detallan en la siguiente tabla: 10 110PKSVPSP/211004
CMVIgMELA test PKS Ensayo de referencia negativo positivo negativo 314 1 positivo 1 166 Sensibilidad = 99,0 % Especificidad = 99,8 % Valor predictivo positivo: 99,40 % Valor predictivo negativo: 99,68 % 7.B. PRECISION Muestra variación Intraensayo Muestra variación Interensayo (n =11) media DO S.D. C.V. (%) n media DO D.S. C.V. (%) CN 0,034 0,005 15 24 CN 0,050 0,010 19 CB 0,314 0,013 4 24 CB 0,230 0,021 9 CP 2,269 0,048 2 24 CP 1,456 0,064 4 Nº1 0,049 0,008 15 27 Nº4 0,058 0,007 13 Nº2 0,317 0,023 7 27 Nº5 0,264 0,037 14 Nº3 2,673 0,086 3 27 Nº6 0,271 0,039 14 Nº7 1,788 0,073 4 CN = control negativo ; CB = control intermedio (no se incluye en el kit); CP = control positivo ADVERTENCIAS GENERALES EN LA MANIPULACION * Para evitar contaminaciones cruzadas, no intercambiar los viales ni sus tapas respectivas. * Los reactivos deberán cerrarse correctamente, inmediatamente después de utilizarse para evitar la evaporación y la contaminación microbiana. * Después de usarse, los reactivos tienen que almacenarse según las indicaciones para garantizar su vida media. * Tras su utilización todos los reactivos del kit deben almacenarse en su caja, para evitar mezclar reactivos de diferentes tests o de diferentes lotes (ver 3.) 110PKSVPSP/211004 11
INFORMACION SOBRE SEGURIDAD E HIGIENE * Debe cumplirse la normativa sobre seguridad e higiene en el trabajo de cada país. * Los reactivos de origen humano han sido testados y se ha encontrado que son negativos para el HbsAg, para anticuerpos frente a VIH1/2 y para el VHC. A pesar de ello, está altamente recomendado que estos materiales al igual que aquellos de origen animal (ver contenido del kit) sean manipulados como potencialmente infecciosos y usados con todas las precauciones necesarias. CONSIDERACIONES SOBRE LA ELIMINACION DE LOS RESIDUOS Los residuos químicos y de las preparaciones se consideran en general como material peligroso. La eliminación de estos residuos está regulada a través de las leyes nacionales y regionales y de sus normativas. Contactar con las autoridades locales o con las compañías de gestión homologadas, que aconsejarán del modo en el que se deben eliminar los residuos peligrosos. Fecha de revisión: 21.10.2004 12 110PKSVPSP/211004
CMVIgMELA test PKS medac Imunoensaio enzimático com Sistema Controlo de Pipetagem (PKS) para a detecção de anticorpos IgM para Citomegalovírus (CMV) Cat. No.: 110/PKS Apenas para utilização em diagnóstico in vitro INTRODUÇÃO O Citomagelovírus (CMV) pertence à família dos Herpesviridae que é caracterizada por um genoma DNA de cadeia dupla. É característica estes vírus persistirem num estado latente no organismo após infecção primária. Podem assim ocorrer reinfecções sob determinadas circunstâncias. O curso que as infecções CMV tomam em indivíduos imunocompetentes é normalmente assintomáticos sem qualquer sintoma, Em indivíduos imunocomprometidos (e.g. Pacientes transplantados, indivíduos HIV positivos, pacientes tumorais, recémnascidos) observamse uma variedade de sintomas graves. O CMV é um dos patogénios mais frequentes em infecção prénatal que pode causar uma série de desordens graves incluindo lesões tardias em crianças nascidas sem sintomas. O kit CMVIgM ELA pode ser aplicado para a detecção de anticorpos CMV IgM específicos em soro. Uma infecção CMV aguda pode ser diagnosticada pela demonstração de anticorpos IgM. Devese ter em conta que nem sempre são produzidos anticorpos IgM. Em pacientes imunodeprimidos raramente se detectam anticorpos CMV IgM durante reactivações e reinfecções. 110PKSVPSP/211004 13
Para além de CMVIgMELA Test PKS medac Cat.no.: 110/PKS para 96 determinações também temos os seguintes produtos: CMVIgGELISA PKS medac Cat. no.: 115/Q/PKS para 96 determinações, CMVIgGELA Test PKS medac Cat. no.: 115/PKS para 96 determinações, CMVIgGELA Test PKS medac Cat. no.: 116/PKS para 96 determinações, CMVIgAELA Test PKS medac Cat. no.: 112/PKS para 96 determinações. 14 110PKSVPSP/211004
PRINCÍPIO DO TESTE A placa é revestida com imunoglobulina IgM antihumana. As IgM da amostra ligamse selectivamente aos poços. Os anticorpos IgM específicos do CMV ligamse ao antigénio CMV marcado com Peroxidase. Incubação com substrato TMB (*). A reacção é parada pela adição de ácido sulfúrico. A absorção é lida fotometricamente. Vantagens do teste Ausência de reacções inespecíficas e ausência de resultados falsopositivos causados por factores reumatoides. Ausência de bloqueamento de anticorpos IgM por um elevado título de IgG. O PKS permite monitorizar visualmente e fotometricamente cada passo de pipetagem através das alterações de cor. As tiras separáveis permitem uma utilização eficiente. Adequado para automatização em aparelhos abertos. 110PKSVPSP/211004 15
CONTEÚDO DO KIT Catálogo no. 110/PKS 1. MTP Microplaca: 12 8 poços separáveis, com suporte e dissecante selados em vácuo em saco de alumínio, formato U, revestidos imunoglobulina IgM antihumana de cabra, BSA e indicador de ph, pronta a usar. 2. CONTROL Controlo negativo: 2 frascos de 0,75 ml cada, soro humano, azul, pronto a usar, contém BSA, fenol, ProClin 300 e sulfato de gentamicina. 3. CONTROL + Controlo positivo: 2 frascos de 0,75 ml cada, soro humano, azul, pronto a usar, contém BSA, fenol, ProClin 300 e sulfato de gentamicina. 4. WB Tampão de lavagem: 1 frasco de 100 ml, PBS/Tween (10 ), ph 7,2 7,4, contém ProClin 300. 5. VIRDIL Diluente de amostras: 1 frasco de 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, pronto ausar, contém ProClin 300. 6. ANTIGEN CMVIgMELA (Antigénio marcado enzimaticamente): 2 frascos com 5,0 ml cada, liofilizados, corados de vermelho, conjugadohrp, contem FCS. 7. TMB Substrato TMB: 1 frasco com 10 ml, pronto a usar. 8. STOP Solução stop: 2 frascos de 14 ml cada, 0,5 M de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ), pronto a usar. 16 110PKSVPSP/211004
1. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE Material/Reagente Estado Armazenamento Estabilidade Kit fechado 2...8 C Prazo de validade Microplaca aberta 2...8 C no 6 semanas saco c/ dissecante Controlos abertos 2...8 C 6 semanas Tampão de lavagem diluído 2...8 C 6 semanas CMVIgMELA reconstituído 2...8 C 5 dias 18 C 6 semanas Substrato TMB aberto 2...8 C 6 semanas Solução stop aberta 2...8 C Prazo de validade Aliquotar e não congelar após descongelado! Não utilizar os reagentes após a data do prazo de validade 2. REAGENTES E MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO 2.1. Água redestilada. A utilização de água desionizada pode afectar o procedimento do teste. 2.2. Micropipetas ajustáveis. 2.3 Recipientes de vidro ou plástico para a diluição do tampão de lavagem. 2.4. Dispositivo adequado para a lavagem da microplaca (Multipipeta ou lavador ELISA). 2.5. Incubadora para 37 C. 2.6. Leitor com filtros para 450 nm, e 620 650 nm. 3. PREPARAÇÃO DOS REAGENTES Antes de iniciar o teste os reagentes devem ser colocados à temperatura ambiente. Calcular o número de poços necessários 3.1. Microplaca O saco de alumínio tem de ser bem fechado juntamente com o dissecante após cada remoção de poços. 110PKSVPSP/211004 17
Nota: Os poços da microplaca têm uma cor verde clara. Possíveis manchas verde acastanhadas dentro dos poços devemse ao processo de produção e não influenciam a performance do teste. 3.2. Tampão de lavagem Misturar um volume de tampão de lavagem (10 ) com nove volumes de água (e.g. 50 ml de tampão de lavagem (10 x) com 450 ml de água). São necessários 10 ml de tampão de lavagem diluído para oito poços. Os cristais no tampão de lavagem (10 x) têm de ser dissolvidos aquecendo (máx. 37 C) e/ou agitando à temperatura ambiente. 3.3. CMVIgMELA Reconstituir o CMVIgMELA liofilizado com 5.0 ml de diluente de amostras. Misturar com cuidado. Misturar cuidadosamente e ter atenção para que as partículas junto à abertura também sejam dissolvidas. Após reconstituição o CMVIgMELA tem cor vermelha e está pronto a usar. Não misturar reagentes específicos do teste (microplaca, controlos, CMVIgMELA) de diferentes lotes. Por seu lado, o diluente de amostra, tampão de lavagem, substrato TMB e solução de paragem são reagentes que geralmente se podem trocar entre todos os kits ELISA para virologia da medac. Em geral, não se devem utilizar reagentes de outros fabricantes. Apenas se obtêm resultados válidos e reprodutíveis quando o procedimento é rigorosamente seguido 4. AMOSTRA 4.1. O teste é adequado para soro. 4.2. Não é necessário prétratamento da amostra, e.g. inactivação. Contudo não devem esta contaminados com microorganismos nem conter glóbulos vermelhos. 4.3. As amostras têm de ser diluídas 1 : 100 com diluente de amostras. Podem ainda ser diluídas para determinação de título. 18 110PKSVPSP/211004
5. PROCEDIMENTO 5.1. Cortar o saco de alumínio e retirar o número de poços necessários (ver 3.1.) Os poços da microplaca estão prontos a usar e não têm de ser prélavados. 5.2. Deixar o poço A1 vazio para branco (ver 6 A). Adicionar 50 µl de amostra diluída, assim como de controlo negativo e controlo positivo, em duplicado aos poços. Após pipetar as amostras (fluidos de ph neutro ou básico) os poços ficam azuis. Se esta alteração de cor não se verificar significa que não foi adicionada amostra ou controlo. Se necessário a placa pode ficar numa câmara húmida até 60 minutos a 2 8 C antes de continuar. 5.3. Incubar a microplaca 60 minutos (± 5 min) a 37 C (± 1 C) numa câmara húmida ou selada. 5.4. Reconstituir o CMVIgMELA (ver 3.3) 5.5. Após a incubação lavar a microplaca 3 vezes com 200 µl de tampão de lavagem por poço. Todos os poços devem ser preenchidos. Após a lavagem bater em papel absorvente. Não deixar secar os poços! Continuar o teste imediatamente! 5.6. Adicionar 50 µl de CMVIgMELA (vermelho) a cada poço (excepto A1). Se o teste for feito manualmente têm de ser pipetados 50 µl de conjugado. Nota: Se o teste for feito em sistema automático têm de ser pipetados 60 µl de conjugado devido à maior evaporação nas câmaras húmidas dos instrumentos. A adequação do teste para aparelhos automáticos foi confirmada durante a avaliação do teste. Contudo, recomendase a verificação da compatibilidade do teste com o aparaelho utilizado no laboratório. 5.7. Incubar a microplaca 60 minutos (± 5 min) a 37 C (± 1 C) numa câmara húmida ou selada. 5.8. Após a incubacao, lavar a microplaca novamente (ver 5.5.) 110PKSVPSP/211004 19
5.9. Adicionar 50 µl de substrato TMB a todos os poços (incluindo A1) e incubar 30 minutos (± 2 min) a 37 C (± 1 C) numa câmara húmida ou selados e no escuro. As amostras positivas ficam azuis. 5.10 Parar a reacção adicionando 100 µl de solução stop a cada poço (incluindo A1). As amostras positivas ficam amarelas. Limpar os poços por baixo antes da leitura fotometrica e ter atenção para que não hajam bolhas de ar nos poços. A leitura deve ser efectuada até 15 minutos após a adição da Solução Stop. 5.B. TABELA PARA O PROCEDIMENTO Branco Controlo Controlo Amostra (A1) negativo positivo Cont. negativo Cont. positivo Amostra 50 µl 50 µl 50 µl Incubar 60 minutos a 37 C, lavar 3 com 200 µl de tampão de lavagem CMVIgMELA 50/60 µl * 50/60 µl * 50/60 µl * Incubar 60 minutos a 37 C, lavar 3 com 200 µl de tampão de lavagem Substrato TMB 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Incubar 30 minutos a 37 C no escuro Solução stop 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leitura a 450 nm (ref. 620650) *) procedimento manual /automatico (ver 5.5) 6.A. CALCULO DOS RESULTADOS Ler os valores de DO a 450 nm (ref. 620 650 nm). Subtrair o valor de DO do branco (poço A1) de todos os outros valores de DO. O valor médio de DO para o controlo negativo tem de ser < 0.100. O valor médio de D.O para o controlo positivo tem de ser > 0.800. Cutoff = valor médio da DO do controlo negativo + 0.140 Zona cinzenta = Cutoff ± 10 % 20 110PKSVPSP/211004
6.B. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Amostras com valores de D.O abaixo do limite inferior da zona cinzenta são consideradas NEGATIVAS. Amostras com valores de D.O entre a zona cinzenta são consideradas EQUIVOCAS. Estas amostras devem ser retestadas juntamente com uma amostra fresca obtida 14 dias mais tarde para determinar alteração de título. Amostras com valores de D.O acima do limite superior da zona cinzenta são consideradas POSITIVAS. Os resultados devem sempre ser interpretados em conjunto com dados clínicos e parâmetros de diagnóstico adicionais. Reacções falsopositivas baixas causadas por anticorpos contra outros Herpesvirus ou por anticorpos heterofílicos não podem ser excluídos em casos isolados Concentrações muito elevadas de lípidos em amostras podem influenciar a concentração de anticorpos medida. Altas concentrações de hemoglobina ou Bilirubina não influenciam os resultados do teste 7. CARACTERÍSTICAS DE PERFORMANCE Foram determinadas as seguintes características de performance durante a avaliação diagnostica 7.A. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE Foram testadas 482 amostras, selecciondas de dadores de sangue e doentes, com o kit em comparação com um ELISA altamente específico utilizado em rotina. Os resultados foram: 110PKSVPSP/211004 21
Teste de referência Negativo Positivo CMVIgMELA test PKS Negativo 314 1 Positivo 1 166 Sensibilidade = 99,40 % Especificidade = 99,68 % Valor predictivo positivo: 99,40 % Valor predictivo negativo: 99,68 % 7.B. PRECISÃO Amostra Variação intraensaio Amostra Variação interensaio (n=11) DO SD VC(%) n DO SD VC(%) CN 0,034 0,005 15 24 CN 0,050 0,010 19 CPF 0,314 0,013 4 24 CPF 0,230 0,021 9 CP 2,269 0,048 2 24 CP 1,456 0,064 4 No.1 0,049 0,008 15 27 No.4 0,058 0,007 13 No.2 0,317 0,023 7 27 No.5 0,264 0,037 14 No.3 2,673 0,086 3 27 No.6 0,271 0,039 14 No.7 1,788 0,073 4 CN = controlo negativo; CPF = controlo positivo fraco (nao incluído no kit); CP = controlo positivo CONSELHOS GERAIS DE MANIPULAÇÃO Para evitar contaminação cruzada não trocar os frascos e as suas tampas. Os reagentes têm de ser fechados imediatamente após utilização para evitar evaporação e contaminação microbiana. Após utilização, os reagentes têm de ser armazenados como indicado para garantir a validade Após utilização todos os componentes do kit devem ser armazenados nos recipientes originais para evitar a mistura com reagentes de outros testes ou lotes (ver também 3.) 22 110PKSVPSP/211004
INFORMAÇÃO SOBRE SAÚDE E HIGIENE Os regulamentos de segurança e saúde locais têm de ser tidos em conta. Os reagentes de origem humana foram testados e considerados negativos para HBsAg, para anticorpos HIV1/2 e para HCV. Contudo, recomendase que estes materiais, bem como os de origem animal (ver conteúdo do kit), sejam manipulados como potencialmente infecciosos e utilizados com todas as precauções necessárias. CONSIDERAÇÕES DE ELIMINAÇÃO Os resíduos de químicos e preparações são geralmente considerados como desperdício contaminante. A eliminação deste tipo de desperdício é regulada através de leis e regulamentos nacionais e regionais. Contactar as autoridades locais ou companhias de gestão de lixos para saber procedimentos a tomar. Data da revisão: 21.10.2004 110PKSVPSP/211004 23
BIBLIOGRAFIA/REFERÊNCIAS Enders, G.: Infektionen und Impfungen in der Schwangerschaft. Urban und Schwarzenberg, München, 9 30, (1990). Flik, J.: A comparison of 2 quantitative ELISAs used to detect IgG antibodies against HCMV in transplant recipients. Poster presented at the 5th Intern. Cytomegalovirus Conference, (1995). Jethon, C., Doerr, H. W., Weber, B.: Serologische Diagnose der CytomegalievirusInfektion: Evaluierung von drei Enzymimmunoassays zum Nachweis von spezifischen IgMAntikörpern in Serumproben von immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten. Lab. Med. 20 (9), 480 484, (1996). Reimer, K. und Meisel, H.: Humanes Zytomegalievirus, in: Diagnostische Bibliothek Bd.1, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschaftsverlag, 279 290, (1996). Schmitz, H., Doerr, H. W., Kampa, D. and Vogt, A.: Solidphase enzyme immunoassay for IgM antibodies to Cytomegalovirus. J. of Clin. Microbiol. 5, 629 634, (1977). Schmitz, H., Kampa, D., Doerr, H. W., Luthardt, T., Hillemanns, H. G. and Würtele, A.: IgM antibodies to Cytomegalovirus during pregnancy. Arch. Virol. 53, 177 184, (1977). Schmitz, H., von Deimling, U. and Flehmig, B.: Detection of IgM antibodies to Cytomegalovirus (CMV) using an EnzymeLabelled Antigen (ELA). J. Gen. Virol. 50, 59 68, (1980). Steinmann, J. and Bischoff, J.: Comparison of serological methods for the detection of Cytomegalovirus infection. Lab. Med. 15, 585 589, (1991). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or longterm human Cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA, (1997). Weber, B., Prosser, F., Munkwitz, A. and Doerr, H. W.: Serological diagnosis of Cytomegalovirus infection: comparison of 8 enzyme immunoassays for the detection of HCMVspecific IgM antibody. Clin. Diagn. Virol. 2, 245 259, (1994). 24 110PKSVPSP/211004