Acortamiento del ciclo generacional en pimiento mediante el cultivo de embriones inmaduros J. P. Manzur, A. Rodríguez-Burruezo, F. Nuez Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana, Universitat Politècnica de València, Camino de vera, sn, CP 46022 Valencia, España. Palabras claves: Capsicum annuum L., programas de mejora, cultivo in vitro, embriones cigóticos. Resumen Aunque el cultivo in vitro de embriones inmaduros ha estado enfocado fundamentalmente al rescate de embriones interespecíficos para sortear barreras de incompatibilidad postcigóticas (aborto), existe otra aplicación, menos estudiada en hortícolas, consistente en acortar el ciclo generacional y, en consecuencia, reducir la duración de los programas de mejora. El objetivo del presente estudio consistió en estimar el avance que aporta el cultivo in vitro de embriones inmaduros en pimiento (Capsicum annuum). Para ello, se autofecundaron flores de pimiento California wonder en el otoño-invierno 2010/11. Una parte de los frutos se cosechó 40 días tras la polinización, extrayendo embriones inmaduros, en estadíos torpedo y cotiledonar, cultivándolos en un medio artificial. Tras emitir las raíces y alcanzar un tamaño suficiente se trasplantaron a maceta. En paralelo, el resto de frutos se dejó en la planta hasta alcanzar la madurez fisiológica, necesaria para asegurar una buena germinación, extrayendo las semillas y sembrándolas, siguiendo el protocolo habitual. Para ambos bloques de plantas se registró la fecha de floración, como medida objetiva del inicio de la siguiente generación, logrando un avance superior a 60 días en el ciclo generacional mediante el cultivo in vitro de embriones. Estos resultados confirman que esta técnica sería de gran utilidad para acortar programas de mejora en pimiento, alcanzando hasta una generación más al año. INTRODUCCIÓN El cultivo de pimientos, chiles y ajíes (Capsicum spp.) está extendido prácticamente en todo el mundo. Esta solanácea cuenta a nivel mundial con 1,9 millones de hectáreas cultivadas y una producción cercana a 30 millones de toneladas, ocupando el séptimo puesto entre las hortalizas (FAO, 2009). Este hecho, junto a su diversidad de usos (como hortícola y especia), lo sitúan como uno de los productos vegetales hortícolas de mayor importancia económica. Además su importancia se encuentra en continuo crecimiento, pues la superficie destinada a su cultivo se incrementa año tras año. El cultivo de embriones de plantas se utilizó por primera vez hace más de un siglo por Hanning (1904), consiguiendo aislar y cultivar embriones maduros de dos crucíferas (Cochleira y Raphanus) en un medio estéril con sales minerales e hidratos de carbono. Desde entonces, las aplicaciones dadas a esta técnica han sido diversas. La más utilizada y estudiada ha sido el rescate de embriones interespecíficos, que permite transferir genes entre especies e incluso géneros, cuya cruzabilidad se ve afectada por la incompatibilidad postcigótica del aborto embrionario (Laibach, 1929). Sin embargo, el cultivo de embriones posee otras aplicaciones de interés agrícola entre las que destacan: i) superar latencia en semillas, ii) germinar semillas de especies estériles, iii) facilitar la 96
MEJORA GENÉTICA VEGETAL micropropagación clonal y transformación genética y iv) acelerar programas de mejora, al acortar el ciclo generacional de cultivo. En lo que se refiere a esta última aplicación, la técnica ha sido exitosa en diversos cultivos. En Rosa, que requiere un año para la floración, utilizando esta técnica se han alcanzado hasta dos ciclos anuales (Asen, 1948). En girasol, cuya semilla requiere más de la mitad del ciclo generacional (120-150 días) para madurar, se ha conseguido hasta 4 generaciones por año (Alissa et al., 1986). En Vigna y guisante, que de modo convencional sólo se logran dos generaciones, ha sido posible conseguir cuatro y seis generaciones al año, respectivamente (Ochatt et al., 2002). En el caso del pimiento, sus frutos requieren alcanzar la madurez fisiológica para disponer de semillas viables y, en muchos casos, este período se puede extender varios meses. Así, dentro de un programa convencional de mejora en pimiento, el ciclo generacional (desde la siembra a la extracción de semilla madura) requiere 6-7 meses en temporada otoño-invierno. Por ello, el cultivo de embriones inmaduros in vitro en Capsicum se presenta como una herramienta potencial, que podría evitar la espera de la maduración del fruto. Ello reduciría el tiempo generacional y aceleraría el programa de mejora, reduciendo los costos para las empresas productoras de semillas, las cuales suelen contar con una unidad de cultivo in vitro con los dispositivos y herramientas necesarios para aplicar esta técnica. Este estudio tiene como objetivo valorar la utilidad del cultivo in vitro de embriones inmaduros de pimiento para este fin. Para ello, se cuantificó y comparó el tiempo necesario para completar una generación, en temporada otoño-invierno, entre el método convencional de la siembra de semillas proveniente de frutos maduros frente a la siembra in vitro de embriones procedentes de frutos inmaduros. MATERIAL Y MÉTODOS El material vegetal utilizado en este estudio fue una accesión de pimiento perteneciente al tipo varietal California Wonder de fruto rojo (C. annuum) conservado en el Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV). La siembra se realizó en julio de 2010 y el transplante, cuando las plantas presentaban 4-5 hojas verdaderas, en septiembre de 2010 en invernaderos de la Universidad Politécnica de Valencia (UPV, Campus de Vera). Iniciada la emisión de botones florales (noviembre 2010), éstos se embolsaron en los días previos a la antesis para asegurar la autofecundación. Los frutos cuajados (diciembre 2010) fueron divididos en dos bloques. En el primero (bloque I o control), se siguió el procedimiento habitual. Para ello, se dejaron madurar completamente tres frutos para extraer y secar sus semillas (4-5 días), sembrándolas (45 en total, 15 por fruto) en una cámara de crecimiento (25 ºC, humedad relativa del 70% y fotoperíodo 16/8 h) y, posteriormente, transferirlas al invernadero, para registrar el momento en que cada planta de esta nueva generación presentase tres flores, considerado el inicio de una nueva generación/ciclo. En el segundo (bloque II), otros tres frutos se cosecharon inmaduros a los 40-45 días tras polinización (DTP), momento óptimo para disponer de abundantes embriones inmaduros avanzados (torpedo y cotiledonar) y cuya buena germinación en medio estéril ha sido constatada previamente (Manzur et al., 2010). El medio utilizado para cultivar los embriones contenía sales minerales MS con vitaminas (4,4 g.l -1 ), sacarosa (80 g.l -1 ), agar (7 g.l -1 ) y ph 5,7. Las condiciones de cultivo en cámara fueron 30 días a 25 ºC, humedad relativa del 70% y fotoperíodo 16/8 h. luz/oscuridad. Posteriormente, las plántulas se transfirieron a sustrato y se les dio un periodo de aclimatación de siete días. Finalmente se trasplantaron a macetas y se pusieron en las mismas condiciones que el bloque I, esperando registrar la fecha de aparición de tres flores. Para este bloque se empleó un 97
diseño experimental en embriones inmaduros similar al del bloque I (total de 45, siembra de 15 embriones/fruto). RESULTADOS Y DISCUSIÓN La cosecha del bloque I se realizó, en promedio, a los 120 DTP (marzo de 2011), mientras que la del bloque II a los 44 DTP (diciembre de 2010). Esta diferencia de días se mantuvo prácticamente constante durante toda la segunda generación. La germinación en ambos casos requirió alrededor de 15 días. Las plántulas alcanzaron el desarrollo óptimo para traspaso a maceta (4-5 hojas verdaderas) a los 160 y 100 DTP para los bloque I y II, respectivamente (Figura 1). La floración de las tres plantas (segunda generación) provenientes de semillas de los tres frutos (primera generación) no tuvo grandes diferencias dentro del bloque (datos no mostrados), sin embargo entre los bloques existió una clara diferencia. El bloque convencional (bloque I) tardó en promedio 195 DTP en completar el ciclo, mientras que el bloque utilizando cultivo de embrión sólo tardó 130 DTP (Figuras 1 y 2). En ambos bloques se observa que desde la siembra a la germinación y desde el traspaso a maceta a la floración, el desarrollo de las plantas se comporta de modo similar (pendientes similares), sin embargo desde la germinación al traspaso a maceta el bloque II requirió unos días más para alcanzar las 4-5 hojas verdaderas. Esto podría deberse a que el embrión germinado in vitro está inmaduro, por lo que requiere más tiempo en igualar su desarrollo con la planta proveniente de semilla madura (Figura 1). Así, el desarrollo de las plantas provenientes del cultivo de embrión no tuvo grandes diferencias con las plantas obtenidas del modo convencional. Los 66 días de diferencias logrados mediante el cultivo in vitro de embriones permite reducir una generación de pimiento de 6,5 a 4,5 meses en temporada otoñoinvierno. Dado que en el ciclo primavera-verano el desarrollo vegetal es más rápido, la utilización de esta técnica permitirá a los mejoradores alcanzar 3 generaciones al año. Además, aunque en muchos vegetales emplear esta técnica conlleva la obtención de individuos débiles, incapaces de completar su desarrollo (germinación precoz), en el caso del pimiento todas las plantas presentaron una morfología y fertilidad normales (Figura 2). Otra ventaja de esta técnica fue una mayor tasa de germinación frente al método convencional. Así en el bloque I el porcentaje de germinación medio fue del 33%, mientras que en el bloque II alcanzó un 72% (datos no mostrados). Esto se debe, probablemente, a que el embrión del bloque I se desarrolló en el fruto durante los meses de invierno, por lo que las bajas temperaturas podrían haber afectado su viabilidad. Este estudio demuestra que el cultivo de embriones en pimiento permite acortar el ciclo generacional, acelerando los programas de mejora para las empresas productoras de semillas al obtener un mayor número de ciclos por año. Referencias Alissa, A., Jonard, R., Serieys, H. et Vincourt, P. 1986. La culture d'embryons isolés in vitro dans un programme d'amelioration du tournesol. CR Acad Sci Paris 302:161-164. Asen, S. 1948. Embryo culture of rose seeds. Am. Rose Annual 33:151-153. FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). 2009. Base de datos estadísticos. http://faostat.fao.org. Fecha de consulta: 17 de agosto de 2011. Hannig, E. 1904. Zur physiologie pflanzlicher embryonen. I. Ueber die cultur von Cruciferen-Embryonen ausserhalb des embryosacks. Bot. Zig. 62:45-80. Laibach, F. 1929. Ectogenesis in plants. Jour. Hered. 20:201-208. 98
MEJORA GENÉTICA VEGETAL Manzur, J.P., Herraiz, J., Rodríguez-Burruezo, A., and Nuez, F. 2010. Evaluation of response to in vitro embryo rescue in Capsicum spp. Proceedings of the XIV TH EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum & Eggplant. Valencia, 30 aug -1 sept. p. 397-402. Ochatt, S. J., Sangwan, R. S., Marget, P., Assoumou Ndong Y., and Rancillac M. 2002. New approaches towards the shortening of generation cycles for faster breeding of protein legumes. Plant Breed. 121:436-440. Fig. 1. Parámetros evaluados medidos en días tras polinización (DTP; las barras señalan el error típico) comparando los dos bloques en estudio. 99
Fig. 2. Esquema comparativo del ciclo generacional convencional (195 DTP) y del modificado mediante el cultivo de embriones inmaduros (130 DTP). 100