Unidad de Biotecnología Animal. Decanato de Ciencias Veterinarias, UCLA. 2

Gaceta de Ciencias Veterinarias Vol 17 N 1 pp 25-30 Julio 2012 Caracterización de proteínas inmunodominantes de Pythium insidiosum y su uso en inmunoensayos para la detección de pitiosis en perro (Canis lupus familiaris) Characterization of immunodominants proteins of Pythium insidiosum and its use on immunoassays for the serological diagnosis of pythiosis in dogs (Canis lupus familiaris) Zapata F. 1, Perazzo Y. 1, Ortega I. 1, Torres A. 2, López J.A. 1 1 Unidad de Biotecnología Animal. Decanato de Ciencias Veterinarias, UCLA. 2 Área de Producción. Departamento de Producción Animal y Tecnología. Decanato de Ciencias Veterinarias, UCLA. *Núcleo "Herctor Ochoa Zuleta", DCV, Edf. B. Lab. Microbiología. Tarabana, 3023, Tfl: 0251-259-2442. E-mail: joseagustinlopez@ucla.edu.ve RESUMEN La Pitiosis es una enfermedad de áreas tropicales y subtropicales del mundo producida por el Oomyceto Pythium insidiosum. En los caninos la enfermedad se presenta principalmente con lesiones cutáneas y subcutáneas, así como gastrointestinales. La identificación definitiva del microorganismo se realiza a través del cultivo, pero requiere experiencia y tiempo. El objetivo de este estudio fue desarrollar un inmunoensayo a partir de proteínas purificadas de P. insidiosum para el diagnóstico serológico en caninos. A partir de un cultivo de P. insidiosum se obtuvieron los antígenos de cultivo filtrado y antígenos solubles de hifas rotas para el análisis de Western blot de las proteínas de P. insidiosum que reaccionaron específicamente con los anticuerpos presentes en sueros de conejos hiperinmunes. Las proteínas se separaron en geles de SDS-PAGE. El revelado inmunoenzimático se realizó con el sistema de proteína A conjugada a peroxidasa de rábano y se usaron como sustrato enzimáticos cloronaftol y peróxido de hidrogeno. Los antígenos inmunodominantes identificados fueron de 175, 125, 75, 71, 52, 46 y 35 kda., reconocidos por los sueros de conejos hiperinmunes, por lo tanto a partir de estos antígenos se puede desarrollar una prueba serodiagnóstica sensible y especifica que permitirá un manejo temprano y satisfactorio de la enfermedad. Palabras Clave: pitiosis, inmunoensayo, perro, diagnóstico. ABSTRACT Pythiosis is a disease of tropical and subtropical areas of the world caused by the oomycete: Pythium insidiosum. In dogs the disease occurs mainly with cutaneous and subcutaneous lesions, and gastrointestinal. Definitive identification of the organism is through in vitro culture, but it requires experience and time. The aim of this study was to develop an immunoassay from P. insidiosum purified proteins for serological diagnosis in dogs. From a P. insidiosus culture, were obtained culture filtrated antigens and soluble antigens of broken hyphae for Western blotting analysis of proteins from P. insidiosum which reacted specifically with antibodies present in sera from hyperimmune rabbits. Proteins were separated on SDS-PAGE gels. The immunoassay system revealed was performed with protein A conjugated to horseradish peroxidase and hydrogen peroxide as well as cloronaftol were used as enzyme substrates. Immunodominant antigens identified were 175, 125, 75, 71, 52, 46 y 35 kda., recognized by hyperimmune rabbit sera, therefore from these antigens may be developed a sensitive and specific serodiagnostic test, that allow an early and satisfactory management of the disease. Key words: pythiosis, dog, Immunoassay, diagnostics. Recibido: 23-01-2013 Aceptado: 11-04-2013 25

Zapata F., Perazzo Y., Ortega I., Torres A., López J.A. INTRODUCCIÓN La Pitiosis es una enfermedad cutánea, gastrointestinal y multisistémica que puede afectar a equinos, caninos, bovinos, felinos y humanos, y se presenta en regiones tropicales y subtropicales del mundo [1,2.3]. El agente causal de esta enfermedad, Pythium insidiosum, es un organismo filamentoso que se encuentra en ambientes acuáticos, especialmente en regiones pantanosas con temperaturas superiores a 25 ºC [3]. En Venezuela la enfermedad se diagnosticó como Granulomatosis Enzoótica Bovina a principios de los años 90, y por estudios histopatológicos se sugirió que estaba involucrado un hongo perteneciente al orden de los Entomopthorales, ubicándose entre los géneros Basidiobulus sp., Conidiobulus sp., o Pythium insidiosum, organismo considerado un hongo para la época [4]. En el año 2005 se logró demostrar la presencia del Pythium en bovinos infectados del Estado Apure [5]. En caninos, la enfermedad se ha reportado en Venezuela desde el 2005, produciendo alteraciones de aspecto tumoral a nivel intestinal [6]. El diagnóstico de la Pitiosis se basa en las características clínicas, histopatológicas y aislamiento del microorganismo. Sin embargo, estos métodos de diagnósticos son difíciles porque las lesiones granulomatosas pueden ser producidas por hongos u otras causas, y la identificación del agente causal muchas veces se complica por la contaminación secundaria bacteriana en el cultivo [2, 7]. Los métodos de diagnóstico como inmunohistoquímica [8], inmunodifusión [9, 10], ensayo inmunoenzimático ELISA [11] y mas recientemente, los métodos moleculares [12, 13, 14] han sido empleados para el diagnóstico de la Pitiosis. En el presente estudio se realizó la purificación e identificación de las proteínas inmunogénicas de P insidiosum, por medio de un ensayo de transferencia (Western blot), utilizando sueros hiperinmunes obtenidos de conejos inoculados con extractos de las proteínas purificadas. Las proteínas se utilizaran en la elaboración de un inmunoensayo para el diagnóstico de Pitiosis en perro. Debido a que el diagnóstico precoz y un tratamiento eficaz son factores cruciales para un mejor pronóstico de los pacientes con Pitiosis, los antígenos inmunodominantes específicos identificados podrían ser importantes para el desarrollo de una prueba diagnóstica rápida y oportuna. MATERIALES Y METODOS 1. Preparación del antígeno. El cultivo se realizó según el protocolo descrito por Mendoza y Prendas, 26 1988 [15] con modificaciones. Se recolectaron muestras de suero sanguíneo y tejido intestinal de un canino con lesiones características de Pitiosis, durante una necropsia, (muestra cedida por la Dra. Milagros Castro). El tejido intestinal se subcultivó en agar Dextrosa Saboreaud a 37 C por 48 horas. Trozos del agar con micelio se transfirieron a 200 ml de caldo Dextrosa Sabouraud y se incubó a 37 C por una semana. El contenido se filtró usando membranas Durapore (0,22-μm poro; Millipore, County Cork, Ireland), para luego añadir fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF; 0.1 mg/ml) y EDTA (0.3 mg/ml), este filtrado correspondió al antígeno de cultivo filtrado (ACF). La masa de hifas retenidas en las membranas se lavaron en agua destilada y transfirieron a un mortero pre congelado en presencia de 25 ml de agua destilada fría conteniendo PMSF (0,1 m0g/ml) y EDTA (0,3 mg/ ml). La masa de hifas se trituró en hielo y centrifugó a 4.800xg a 4 C por 10 min. El sobrenadante resultante correspondió al antígeno soluble de hifas rotas (ASHR). Este antígeno se filtró a través de una membrana Durapore (0,22-μm tamaño de poro). El antígeno de cultivo filtrado, el antígeno soluble de hifas rotas y caldo Dextrosa Sabouraud fueron concentrados aproximadamente 80 veces usando filtros Amicon Ultra 15 para centrifuga (10.000 limite peso molecular nominal). La concentración proteica se determinó usando el método de Biuret [20]. Los antígenos se mantuvieron a -20 C hasta su uso. 2. Identificación de proteínas de Pythium insidiosum por Electroforesis en acrilamida (SDS- PAGE). Se uso el método descrito por Montoya et al. (1995) [16], con algunas modificaciones, y el gel desnaturalizante se realizó según lo descrito por Laemmli (1970) [17], para un sistema discontinuo con gel de apilamiento (gel de poliacrilamida de poro grande, Bio Rad, 1989) [18]. Se mezcló 10 μl de los extractos ASHR y ACF con buffer de corrida (60mM Tris-HCl, ph 6,8, 25% glicerol, 2% sodio dodecil sulfato (SDS), 14,4 mm mercaptoetanol, y 0,1% de azul de bromofenol), se llevó a ebullición por 5 min. y se centrifugó a 13.800 xg durante 5 min. La separación de las proteínas se llevo a cabo a 100 voltios en un gel de poliacrilamida (4% gel de apilamiento, 12% gel de separación) en una cámara de mini geles (Biorad Minicell). Se utilizó como patrón de corrida un marcador de peso molecular para proteínas pre-teñido (Kaleidoscopio de BIO - RAD). Para la tinción, el gel se sumergió en una solución de azul de Coomassie G-250 al 0.1 % filtrado y disuelto en Metanol al 50 % y 10% de Ácido Acético (en agua bidestitala) durante 1 hora [19]. Luego se decoloró con una solución de metanol al 40 %, hasta la aparición de bandas. El gel se fijó en agua bidestilada y los resultados fueron documentados con el sistema DIGI-DOC de UV LAB.

Inmunoensayo para Pythium insidiosum 3. Obtención de suero hiperinmune de conejos. Se inmunizaron dos conejos de laboratorio (Oryctolagus cuniculus), de tres meses de edad y 3 Kg de peso, usando 1 ml de la mezcla de ASHR y Adyuvante incompleto de Freund. Se inyectó 0,1 ml por vía subcutánea en 10 puntos del dorso de cada animal, una vez a la semana, durante cinco semanas consecutivas. A la sexta semana se recolectó la sangre de cada conejo por punción directa del corazón usando la técnica de máxima asepsia, en tubos de ensayo sin anticoagulante. Se dejó incubar a temperatura ambiente durante 30 min. y se centrifugó durante 40 min. a 4.000 rpm, para recuperar el suero sanguíneo. 4. Inmunotransferencia de proteínas (Western blotting). Las proteínas se transfirieron a papel de nitrocelulosa de 0.45 mm, usando una cámara de transferencia MiniCell (BIO-RAD) a 100 voltios durante 1 hora a 4ºC, con buffer tris 25 mm; agua bidestilada; metanol 20%. Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon con leche descremada al 3% en buffer TBS (20 mm Tris, 500 mm NaCl, ph 7.4) (BIO-RAD) durante 1 hora y lavadas con TBS-Tween 20 (BIO-RAD). Luego se incubaron toda la noche a temperatura ambiente con el suero extraído de los conejos y el suero problema obtenido en la necropsia, diluido 1:1000 en buffer (TBS, ph 7,5, 0,05% Tween 20; 1% gelatina). Las membranas se lavaron dos veces con buffer (TBS, ph 7,5, 0,05% Tween 20) e incubaron a temperatura ambiente por 2 horas con Inmunoglobulina G de ratón anti-rabit IgG y anti-dog IgG conjugada a peroxidasa respectivamente a una dilución de 1:3.000 con buffer de anticuerpo. Las membranas se lavaron 3 veces y se les añadió una mezcla fresca de 10 ml al 0.3% de 4- cloro-1-naftol en metanol y 50 ml de TBS con 30 ml de 30% de peróxido de hidrógeno (H2O2.). Las reacciones se detuvieron sumergiendo las membranas en agua destilada. Como revelador para el suero canino se usó una solución de 0,03mg/ml de OPD (dihidrocloruro de o-fenilenediamina, SIGMA-ALDRICH) en agua bidestilada y 0,03% de H2O2. Para los sueros de conejos se uso la solución de revelado (BIO-RAD) sobre las membranas correspondientes. 5. Inmunoensayo enzimático. (ELISA). Se diseñó un ensayo inmunoenzimático (ELISA) cualitativo, para lo cual se sensibilizaron placas de poliestireno de fondo plano con antígeno de P. insidiosum en diluciones seriadas de 6,25 a 100?g/ml en tampón carbonatobicarbonato a ph 9,6, a 4 C por 18 horas. Luego de tres lavados con buffer fosfato salino (PBS) y Tween 20 (0,05%), las placas se bloquearon con albúmina al 1% en PBS (PBS-BSA), a 37 C por 1 hora. Los sueros se usaron en diluciones seriadas de 1:4 a 1:1024 en PBS-BSA y se incubó la placa a 37 C por 1 hora, para luego incubarlo con conjugado de IgG de carnero anti IgG humana y peroxidasa de rábano picante a Figura 1. Determinación de la Concentración de Proteínas de la Muestra (Método de Biuret). Se interpoló el valor de la absorbancia detectado para las muestras problemas de proteínas, con los valores conocidos de albumina para determinar el valor de la concentración para las proteínas purificadas. = Antigeno Soluble de Hifas Rotas: 0.6 ng/dl diferentes diluciones (1:1000 y 1:2000) a 37 C durante una hora. Previo lavado, se añadió orto-fenildietnolamina (OPD) 0,04% en tampón citrato ph 5,0 y peróxido de hidrógeno 0,03%. La reacción enzimática se detuvo con ácido sulfúrico 2N, y la lectura se realizó por observación del cambio de coloración y comparación con los controles positivo (suero hiperinmune obtenido en conejos) y los controles negativos. RESULTADOS Para la expresión de la concentración de proteínas totales se dibujó una gráfica patrón de proteínas comparando las diferentes concentraciones de albúmina con la absorbancia obtenida para cada una, a longitud de onda de 545 nm. El contenido de proteínas totales para el purificado a partir del Antígeno Soluble de Hifas Rotas (ASHR), se estimó por interpolación de los valores de absorbancia de la muestra problema con los conocidos, correspondiente a 0.6 ng/dl (Figura 1). El análisis de los preparados de Antígeno Soluble de Hifas Rotas (ASHR) purificados, utilizando una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE al 12% teñido con Azul de Coomasie, permitió corroborar la efectividad de la purificación, así como caracterizar las diferentes proteínas presentes en el preparado de P. insidiosum cultivado. En el patrón electroforético de las proteínas de P. insidiosum se detectaron bandas comprendidos en un rango de peso molecular entre 203 y 14 KDa. (Figura 2) El revelado inmunoenzimático del Western blot permitió detectar 8 componentes antigénicos inmunodominantes, cuyos pesos moleculares 27

Zapata F., Perazzo Y., Ortega I., Torres A., López J.A. estimados en kilodaltones son de 250, 175, 125, 75, 71, 52, 46, 35 kda., sin variación del tamaño molecular y la intensidad entre los sueros probados (Figura 3). El ensayo de ELISA se llevó a cabo de forma cualitativa, con la finalidad de comprobar la capacidad antigénica de las proteínas purificadas para reconocer anticuerpos específicos contra P. insidiosum en un inmunoensayo. Los ensayos de ELISA utilizando el suero problema y las diluciones en proporciones similares a la muestra control, resultaron positivas, al utilizar las proteínas extraídas de Pythium (Hifas rotas y antígeno soluble) como antígenos. Figura 3. Análisis de Western blot de las proteínas de Pythium insidiosum que reaccionan específicamente con los anticuerpos presentes en sueros de conejos hiperinmunes. Las proteínas se separaron en geles de SDS- PAGE al 12%. El revelado inmunoenzimático se realizó con el sistema de proteína A conjugada a peroxidasa de rábano y se usaron como sustrato enzimáticos cloronaftol y peróxido de hidrogeno. El carril 2, 3 y 4 corresponde al suero de conejo hiperinmune con Antígeno Soluble de Hifas Rotas (ASHR). El carril 1 corresponde a los pesos moleculares (Kaleidoscopio, BIO-RAD) expresados en kilodaltones de los marcadores utilizados. DISCUSION El perfil antigénico de la cepa de P. insidiosum aislada de canino, reveló al Western blot, usando sueros hiperinmunes de conejos a títulos altos de anticuerpos, siete componentes inmunoreactivos con pesos moleculares estimados de 175, 125, 75, 71, 52, 46 y 35 kda. Los componentes antigénicos con mayor inmunoreacción fueron los antígenos de 52, 46 y 35 kda.), dato similar al encontrado en diferentes 175 125 75 71 Figura 2. Análisis electroforético de Pythium insidiosum en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) teñido con azul de Coomassie. Referencia: foto del folleto de fábrica del marcador Kaleidoscopio (BIO-RAD), cuyos valores están señalados a la izquierda en kilodaltones. El carril 1 corresponde a la corrida en gel del marcador Kaleidoscopio. El carril 2 corresponde al Antígeno Soluble de Hifas Rotas (ASHR) 28 52 46 aislados de humanos, perros, gatos y caballos de diferentes regiones geográficas, en donde el patrón de proteínas para P. insidiosum se encuentra entre los 209 y 9 KDa, con variaciones en cuanto a número de bandas e intensidad de las mismas, en individuos de una misma especie [21]. De la misma manera, se ha demostrado que algunas cepas de P. insidiosum expresan antígenos únicos in vitro y durante la infección natural, indicando que estos antígenos se expresan con una alta variabilidad sin importar la especie animal [21]. Diversos autores reportan patrones de bandas en el SDS-PAGE teñido con Coomasie, diferentes a los establecidos como referencia (209 a 9 KDa) [22, 23, 24, 25]. Una posible explicación es el uso de concentraciones diferentes de poliacrilamida (8 y 10%) y el método de cultivo utilizado [21]. El análisis por inmunotransferencia para la detección e identificación de P. insidiosum ha sido estudiado desde 1992 y el perfil antigénico del P. insidiosum por inmunoblot ha sido caracterizada en muchos huéspedes como; caballos, conejos, bovinos y humanos [21, 26]. Mendoza et al. (1992), utilizaron sueros de cinco caballos de Costa Rica con Pitiosis y

Inmunoensayo para Pythium insidiosum tres caballos que habían sanado de Pitiosis por inmunoterapia, observándose en el análisis de Western blot, antígenos inmunodominantes de 32, 30 y 28 kda [26]. Por otro lado, Vanittanakom et al. (2004), demostraron que los antígenos de 110, 73, 56, 42 a 35, 30 a 28, 26 y 23 kda fueron inmunorreactivos con sueros provenientes de humanos con Pitiosis, con una fuerte reacción con los antígenos de peso molecular de 42 a 35 kda [14]. Krajaejun, et al. (2006), utilizaron muestras de P. insidiosum y sueros provenientes de pacientes humanos Tailandeses con Pitiosis, e identificaron un antígeno inmunodominante de peso molecular 74 KDa en todas las muestras analizadas, así como también, antígenos con rangos desde 43 a 34 KDa [10,11]. Estos reportes son antigénicamente similares a los resultados del presente trabajo, presentando variaciones que indican que la respuesta inmune humoral a los antígenos de P. insidiosum podrían variar según la especie que afecta o entre cepas del agente patógeno. Schurko et al. (2003), realizaron un análisis filogenético usando secuencias de los espaciadores ribosomales intragénicos de 5.8S (rrna) de aislados de todo el mundo de P. insidiosum, encontrando que aunque todas las muestras presentaron estrecha relación entre sí, existen tres (3) subgrupos genéticos de P. insidiosum, identificados como I, II y III, según su ubicación geográfica [27]. De estos, el subgrupo III mostró una relación más distante en cuanto a los otros dos subgrupos, lo cual pudiese indicar la presencia de una subespecie distinta en cada región geográfica estudiada. Por otra parte Rivierre et al. (2005), reportaron el primer caso de Pythium en África, demostrando que el organismo causal fue filogenéticamente muy diferente de otros organismos Oomycetos pero más cercanos a los subtipos de P. insidiosum, lo que sugiere una nueva especie de Pythium, y por lo tanto una más amplia acción patógena de este microorganismo [28]. Es por ello que los diferentes subgrupos de las especies de Pythium patógenos encontrados en los análisis filogenéticos podría explicar las diferencias existentes en cuanto a los antígenos presentes en cada aislado de P. insidiosum, y que podrían variar su inmunogenecidad como lo demuestra Mendoza et al. (1992), Krajaejun, et al. (2006), y se sugiere en el presente estudio [22, 26]. De los 8 antígenos detectadas en la inmunotransferencia, los antígenos de 52, 46 y 35 KDa mostraron una mayor intensidad de banda, demostrando ser los antígenos inmunodominantes. Nuestros datos son similares a los reportados por Mendoza et al. (1992), que identificaron los antígenos de bajo peso molecular, 32, 30 y 28 KDa, como los inmunodominantes en el western blot, lo cual podría 29 deberse a la complejidad química de los mismos [26]. Los tres antígenos (52, 46 y 35 KDa) identificados por western blot usando el suero hiperinmune producido en conejos a partir de la proteína de P. insidiosum purificada, podrían utilizarse en el desarrollo de pruebas diagnósticas sensibles y específicas, para describir áreas enzoóticas de Pitiosis canina en Venezuela, así como también, pueden ser utilizados como antígenos inmunizantes en las diferentes especies animales susceptibles. Los sueros hiperinmunes obtenidos de los conejos inoculados y del perro con diagnóstico clínico e histopatológico a Pythium, demostró que la prueba de ELISA es especifica en la identificación de los anticuerpos para el antígeno homologo (Hifas rotas y antígeno soluble), donde los ensayos con el suero problema y las diluciones en proporcionales a la muestra control, lograron mostrar una reacción positiva. Los resultados del inmunoensayo (ELISA) y la inmunotransferencia, permiten identificar las proteínas de Pythium, con importancia inmunogénica, y demuestra su utilidad para el desarrollo de ensayos inmunoenzimáticos más sensibles y específicos. Esto sería de gran utilidad para la detección precoz de nuevos casos y la instauración de un tratamiento eficaz, así como, en los estudios epidemiológicos de la Pitiosis canina en Venezuela. De igual manera, las proteínas inmunodominantes (52, 46 y 35 kda) pueden ser usadas, en un futuro, para el desarrollo de una vacuna contra Pythium insidiosum. AGRADECIMIENTO Este estudio se llevó a cabo con financiamiento del CDCHT-UCLA. BIBLIOGRAFÍA [1] Foil, C. Update on Pythiosis (Oomycosis) in Internacional Symposium Antimicrobial therapy: Applications in Dermatology. 1996, p. 57-63. [2] Leal AT, Monteiro AB, Flores EF, Santurio JM. Pythiosis. Ciencia Rural (Santa Maria). 2001.31: 735-743. [3] Santurio, J., Monteiro, A., Leal, A., kommers, C., De Sousa, R., Catto, J. Pythiosis caused for Pythium insidiosum in Brazil Pantanal. Journal of Mycopathology, 1998.Vol. 144 (3): 123-125. [4] Marín, C., M. de López, N., Pérez, C., Mirabal, G., De Rolo, M., Urdaneta. Juan C. Primer Reporte de la Granulomatosis Enzoótica Bovina en Venezuela. FONAIAP Divulga. 1991. 37. [5] Pérez RC, Luis-León JJ, Vivas JL, Mendoza L. Epizootic cutaneous pythiosis in beef calves. Vet

Zapata F., Perazzo Y., Ortega I., Torres A., López J.A. Microbiol. 2005.Aug 10; 109(1-2):121-8. [6] Mendoza L, Arias M, Colmenarez V, Perazzo Y. Intestinal canine pythiosis in Venezuela confirmed by serological and sequencing analysis. Mycopathologia. 2005. Feb; 159(2):219-22. [7] Chaffin MK, Schumacher J, Hooper N. Multicentric cutaneous pythiosis in a foal. J Am Vet Med Assoc. 1992.15; 201(2):310-2 [8]Brown, C., Mcdure, J., Triche, P. y Crowder, C. Use the Inmunohistochemical methods for doagnosis of Equine Pythiosis. Lournal American Veterinay, 1988. (49) p. 1866-1868. [9] Kaufman, L. Penicilliosis marneffei and pythiosis: emerging tropical disease. Mycopathologia. 1998. 143:3-7. [10] Miller, R. I., and R. S. Campbell. Immunological studies on equine phycomycosis. 1982.Aust. Vet. J. 58:227-231. [11] Mendoza, L., L. Kaufman, W. Mandy, and R. Glass. Serodiagnosis of human and animal pythiosis using an enzyme-linked immunosorbent assay. Clin. Diagn. 1997. Lab. Immunol. 4:715-718. [12] Grooters AM, Gee MK. Development of a nested polymerase chain reaction assay for the detection and identification of Pythium insidiosum. J Vet Intern Med. 2002. 16(2):147-52. [13] Schurko AM, Mendoza L, de Cock AW, Bedard JE, Klassen GR. Development of a species-specific probe for Pythium insidiosum and the diagnosis of pythiosis. J Clin Microbiol. 2004.42(6):2411-8. [14] Vanittanakom, N., J. Supabandhu, C. Khamwan, J. Praparattanapan, S. Thirach, N. Prasertwitayakij, et al. Identification of emerging human-pathogenic Pythium insidiosum by serological and molecular assay-based methods. J. Clin. Microbiol. 2004.42:3970-3974. [15] Mendoza, L., and J. Prendas. A method to obtain rapid zoosporogenesis of Pythium insidiosum. Mycopathologia. 1988.104:59-62. [16] Montoya, Y, León C, Maturrano L, Muñoz-Najar U, Nolasco O, Talledo M. Guía de Practica del Curso Teórico-Practico: Electroforesis de proteinas y acidos nucleicos. Lima: Instituto Nacional de Salud. Cede Central. 1995. [17] Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature (London). 1970. 227:680-685. [18] Bio-Rad. Acrylamide polymerization-a practical approach. US/EG Bulletin. 1989.1156,3 pp. [19] Darnell J, Lodish H, Baltimore D. Molecular cell bology. 2nd ed. New York: Scientific American Books. 1990. [20] Fine J. The biuret method of estimating albumin and globulin in serum and urine. Biochem J. 1935 Mar; 29(3):799-803. [21] Chindamporn, Ariya., Vilela Raquel., Hoag K.A.,2, Mendoza Leonel. Antibodies in the Sera of Host Species with Pythiosis Recognize a Variety of Unique Immunogens in Geographically Divergent Pythium insidiosum Strains. Clinical and Vaccine Immunology, 2009. Mar., p. 330-336. [22] Krajaejun T, Sathapatayavongs B, Pracharktam R, Nitiyanant P, Leelachaikul P, Wanachiwanawin W, et al. Clinical and epidemiological analyses of human pythiosis in Thailand. Clin Infect Dis. 2006.Sep 1; 43(5):569-76. [23] Krajaejun T, Kunakorn M, Pracharktam R, Chongtrakool P, Sathapatayavongs B, Chaiprasert A, et al. Identification of a novel 74-kiloDalton immunodominant antigen of Pythium insidiosum recognized by sera from human patients with pythiosis. J Clin Microbiol. 2006.44(5):1674-80. [24] Leal, A. T., J. M. Santurio, A. B. M Leal, J. B. Catto, E. F. Flores, I. Lubeck, and S. H. Alves. Characterization of the specificity of the humoral response to Pythium insidiosum antigens. J. Mycol. Med. 2005. 15:63-68. [25] Supabandhu, J., M. C. Fischer, L. Mendoza, and N. Vanittanakom. Isolation and identification of the human pathogen Pythium insidiosum from environmental samples collected in Thai agricultural areas. Med. Mycol. 2008.46:41-52 [26] Mendoza, L., V. Nicholson, and J. F. Prescott. Immunoblot analysis of the humoral immune response to Pythium insidiosum in horses with pythiosis.j. Clin. Microbiol. 1992.30:2980-2983. [27] Schurko, A. M., L. Mendoza, C. A. Levesque, N. L. Desaulniers, A. W. de Cock, and G. R. Klassen. A molecular phylogeny of Pythium insidiosum. Mycol. Res. 2003.107:537-544. [28] Rivierre, C., C. Laprie, O. Guiard-Marigny, P. Bergeaud, M. Berthelemy, and J. Guillot. Pythiosis in Africa. Emerg. Infect. Dis. 2005.11:479-481. 30