AISLAMIENTO DE CEPAS NATIVAS BACTERIANAS A PARTIR DE BIOPELICULA OBTENIDA DE UN SITIO DE VERTIMIENTO DE AGUAS RESIDUALES CON ALTO CONTENIDO DE CROMO MARIBEL MARTINEZ YEPES Tesis de Grado para optar al título de Magíster en Biotecnología Directora: OLGA INÉS MONTOYA CAMPUZANO, Bióloga, M.Sc. Asesor: ORLANDO SIMÓN RUIZ VILLADIEGO, Químico, M.Sc. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLÍN 2009
Mira, Platero, cómo han puesto el río entre las minas, el mal corazón y el padrastreo. Apenas si su agua roja recoge aquí y allá, esta tarde, entre el fango violeta y amarillo, el sol poniente; y por su cauce casi sólo pueden ir barcas de juguete. Qué pobreza! El río, Platero y yo de Juan ramón Jiménez
A mi Hijo, Mateo.
Agradecimientos Quiero dar las gracias a todas aquellas personas que me han acompañado durante todo este tiempo, tanto en la universidad, como por fuera de la misma. Especial agradecimientos doy a mi Directora de tesis la profesora Olga Inés Montoya Campuzano por acogerme cuando me encontraba como siervo sin tierra y por estar siempre dispuesta a escucharme y apoyarme. Agradezco a mis profesores del posgrado en Biotecnología por generar en mi la duda que me hizo obstinarme y continuar, especialmente a mi asesor el profesor Orlando Simon Ruiz Villadiego. Al profesor Mario Arias del Laboratorio de Bioconversiones, quien de la manera más cordial me permitió utilizar los recursos de su laboratorio. Al profesor Francisco Luis Montoya Herrera. A America y Leydi por su paciencia en todas los tramites que las involucré. A mis compañeros: Víctor, Gloria, Andrea y Jacqueline que me mantuvieron despierta y a las estudiantes de Ingeniería Biológica: Nayibe, Ana María y Juliana por lo comprometidas y animosas. A mi buen amigo Fernando Orozco, quien hizo de la culminación de mi tesis un objetivo común. Al posgrado en Biotecnología y a la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Y con todo mi amor, a pesar de mis ausencias e incomprensiones, a mi hijo Mateo.
CONTENIDO pág. LISTA DE TABLAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE ANEXOS INTRODUCCIÓN 1 1. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE 4 1.1 BIORREMEDIACIÓN 5
1.2 BIOPELÍCULA 6 1.3 PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DEL CROMO 8 1.4 USO DEL CROMO EN LA INDUSTRIA 10 1.5 INDUSTRIA CURTIEMBRERA Y PLANES ESTRATEGICOS SOBRE LA MINIMIZACIÒN DE RESIDUOS CONTAMINANTES EN COLOMBIA 12 1.6 EFECTOS DEL CROMO SOBRE LA SALUD 13 2. DESARROLLO EXPERIMENTAL 15 2.1 MATERIALES Y MÉTODOS 15 2.1.1 Muestreos preliminares 15 2.1.2 Muestreo principal 15
2.1.3 Elección del medio de cultivo para el aislamiento de las cepas bacterianas tolerantes al Cr(VI) y para los ensayos fisicoquímicos de resistencia 17 2.1.4 Aislamiento de cepas bacterianas tolerantes al Cr(VI) a partir de la biopelícula 17 2.1.5 Ensayos fisicoquímicos para determinar la resistencia al Cr(VI) de las cepas tolerantes 21 2.1.6 Microscopia Electrónica de Barrido de las Cepas MBB1, MBB2 y MBA, para Detectar Posibles Alteraciones Morfológicas por Estrés Oxidativo 24 2.2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24 2.2.1 Muestreos preliminares 24 2.2.2 Muestreo principal 24
2.2.3 Aislamiento y caracterización bioquímica de las cepas bacterianas tolerantes al Cr(VI) a partir de la biopelícula 27 2.2.4 Ensayos fisicoquímicos para determinar la resistencia al Cr(VI) de las cepas tolerantes 30 2.2.5 Microscopia electrónica de barrido 44 3. CONCLUSIONES 48 BIBLIOGRAFÍA 50 ANEXOS 60
LISTA DE TABLAS pág. Tabla 1. Compuestos de cromo según su estado de oxidación 8 Tabla 2. Compuestos de cromo según su actividad industrial 11 Tabla 3. Parámetros fisicoquímicos de temperatura, oxigeno disuelto, ph, potencial redox, concentración de Cr(III) y concentración de Cr(VI) in situ 25
LISTA DE FIGURAS pág. Figura 1. Potenciales estándar de reducción para soluciones acuosas de cromo 10 Figura 2a. Dispositivo acanalado de acrílico transparente 16 Figura 2b. Dispositivo acanalado de acrílico transparente con perlas de borosilicato para obtener un crecimiento controlado de la biopelícula acuática 17 Figura 3. Aislamiento de Cepas Tolerantes al Cr(III) (color gris) y al Cr(VI) (color amarillo) a partir de la Biopelícula Bacteriana 20
Figura 4. Materiales y equipos usados en el aislamiento, purificación y conservación de las cepas tolerantes al Cr(VI) 21 Figura 5. Procedimiento de la reactivación de las cepas tolerantes para realizar la cinética de crecimiento y la determinación de la resistencia al Cr(VI) 22 Figura 6. Materiales Utilizados en los Ensayos Fisicoquímicos para Determinar la Resistencia al Cr(VI) y su Remoción del Caldo LB 23 Figura 7. Parámetros fisicoquímicos de temperatura ( C), oxígeno disuelto (mg/l) y ph durante el tiempo de desarrollo de la biopelícula en el sitio de vertimiento 26 Figura 8. Parámetros químicos de Cr(III) (ppm), E (mv) y Cr(VI) (ppm) durante el tiempo de desarrollo de la biopelícula en el sitio de vertimiento 26 Figura 9. Cepas bacterianas MBB1, MBB3, MBB4 y MBB5 (de izquierda a derecha), características macroscópicas (Leica Zoom TM, 2000, Leica Microsystems Inc., NY, USA) y microscópicas con la coloración de Gram de la colonia (Leica CME, 2000, Leica Microsystems Inc., NY, USA) 28
Figura 10. Cepa bacteriana MBB2, característica macroscópica (Leica Zoom TM, 2000, Leica Microsystems Inc., NY, USA) y microscópica con la coloración de Gram de la colonia (Leica CME, 2000, Leica Microsystems Inc., NY, USA) 28 Figura 11. Cepas bacterianas MBC1 y MBC2 (de izquierda a derecha), características macroscópicas (Leica Zoom TM, 2000, Leica Microsystems Inc., NY, USA) y microscópicas con la coloración de Gram de la colonia (Leica CME, 2000, Leica Microsystems Inc., NY, USA) 29 Figura 12. Cepa bacteriana MBA, característica macroscópica (Leica Zoom TM, 2000, Leica Microsystems Inc., NY, USA) y microscópica con la coloración de Gram de la colonia (Leica CME, 2000, Leica Microsystems Inc., NY, USA) 29 Figura 13. Cinética de Remoción de Cr(VI) del Caldo LB de las Cepas Bacterianas Tolerantes (MBB1:cepa no identificada, MBB2: Bacillus cereus, MBB3: Brevibacillus brevis, MBB4: Bacillus stearothermophilus, MBB5: Bacillus megaterium, MBC1: Micrococcus sp, MBC2: Micrococcus sp Y MBA: cepa no identificada), ensayos realizados por duplicado 32 Figura 14. Cinética de Remoción de Cr(VI) del Caldo LB de las cepas MBB1 y Bacillus cereus, ensayos realizados por duplicado 33
Figura 15. Cinética de Remoción de Cr(VI) del Caldo LB de la cepa MBA, ensayos realizados por duplicado 33 Figura 16. Curva de Biomasa en la Cinética de Remoción de Cr(VI) de las cepas bacterianas tolerantes (MBB1:cepa no identificada, MBB2: Bacillus cereus, MBB3: Brevibacillus brevis, MBB4: Bacillus stearothermophilus, MBB5: Bacillus megaterium, MBC1: Micrococcus sp, MBC2: Micrococcus sp Y MBA: cepa no identificada), ensayos realizados por duplicado 34 Figura 17. Cinética de Remoción de Cr(VI) de las cepas MBB1, Bacillus cereus MBA y Cultivo mixto a ph ácido, ensayos realizado por duplicados. Las barras representan el error estándar 36 Figura 18. Cinética de Remoción de Cr(VI) de las cepas MBB1, Bacillus cereus, MBA y Cultivo mixto a ph alcalino, ensayos realizado por duplicados. Las barras representan el error estándar 37 Figura 19. Índice de Crecimiento en la Cinética de Remoción de Cr(VI) de MBB1, Bacillus cereus, MBA y Cultivo mixto a ph ácido, ensayos realizados por duplicado. Las barras representan el error estándar 39
Figura 20. Índice de Crecimiento en la cinética de Remoción de Cr(VI) de MBB1, Bacillus cereus, MBA y Cultivo mixto a ph alcalino, ensayos realizados por duplicado. Las barras representan el error estándar 39 Figura 21. Índice de crecimiento de MBB1, Bacillus cereus, MBA y Cultivo mixto a ph ácido y alcalino, ensayos realizados por duplicado. Las barras representan el error estándar 41 Figura 22. Remoción de Cr(VI) promedio de MBB1, Bacillus cereus, MBA y Cultivo mixto a ph ácido y alcalino, ensayos realizados por duplicado. Las barras representan el error estándar 41 Figura 23. Efecto significativo del ph a través del tiempo sobre el Índice de crecimiento de MBB1 43 Figura 24. Efecto significativo del ph a través del tiempo sobre el porcentaje de remoción del Cr(VI) de MBB1 43 Figura 25. Microfotografía electrónica de barrido de MBB1 en ausencia de Cr(VI) (12,000 magnificaciones) 45
Figura 26. Microfotografía electrónica de barrido de MBB1 en un cultivo con 888 ppm de Cr(VI) 15después de 24 horas (15,000 magnificaciones) 45 Figura 27. Microfotografía electrónica de barrido de Bacillus cereus en ausencia de Cr(VI) (6,000 magnificaciones) 46 Figura 28. Microfotografía electrónica de barrido de Bacillus cereus en un cultivo con 888 ppm de Cr(VI) después de 24 horas (5,500 magnificaciones) 46 Figura 29. Microfotografía electrónica de barrido de MBA en ausencia de Cr(VI) (9,000 magnificaciones) 47 Figura 30. Microfotografía electrónica de barrido de MBA en un cultivo con 888 ppm de Cr(VI) y después de 24 horas (8,500 magnificaciones) 47
LISTA DE ANEXOS pág. Anexo 1. Características Morfológicas Macroscópicas y Microscópicas de las Cepas Bacterianas en los médios de cultivo caldo y agar LB 60 Anexo 2. Multifactor ANOVA. Análisis estadístico de las cinéticas iniciales 61 Anexo 3. Multifactor ANOVA. Análisis estadístico de las cinéticas de MBB1, Bacillus cereus, MBA y Cultivo mixto 66