MICROCULTIVO Los mohos viven como saprofitos en el suelo y agua donde contribuyen a la descomposición de la materia orgánica y al reciclado de materia orgánica, utilizando enzimas extracelulares como celulasas y pectinasas, manteniendo de esta manera la fertilidad del suelo. Los hongos se aprovechan directamente como alimento (por ejemplo los champiñones) e indirectamente en la elaboración de cerveza, vino y pan (Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas con ésta). Además el queso Roquefort se produce inoculándolo con Penicillium roquefortii durante su elaboración y otros quesos suaves como el camembert se producen inoculando Penicillium camemberti. El moho crece sobre la superficie produciendo una proteasa que descompone la estructura del queso. Otros ejemplo es el interés en la producción de proteína de origen unicelular a partir de mohos, ya sea apara alimento del hombre o del ganado, por ejemplo el uso de Candida utilis y la levadura desecada Saccharomyces cerevisiae Además de la producción de alimentos, los mohos producen ácido cítrico para bebidas embotelladas, se basa en el crecimiento de Aspergillus niger, el descubrimiento de penicilinas como productos metabólicos de Penicillium notatum revolucionó la medicina moderna, hoy en día se produce con una variedad denominada Penicillium chrysogenum. Existen otros antibióticos producidos por mohos estos son las cefalosporinas, griseofulvina, ácido fusídico Algunas características de los mohos. Los mohos tienen las siguientes características: Son eucariontes, presentan un núcleo rodeado de membrana No contienen clorofila Se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza Los filamentos se llaman hifas y al conjunto de hifas se le llama micelio El interior de la hifa puede estar septada o no Son inmóviles, aunque existen esporas móviles La mayoría son esporulados La espora se forma por la fusión de los núcleos de dos células Si las esporas asexuales están contenidas en un saco, este recibe el nombre de esporangio, a la hifa que lo sostiene, esporangióforo, y a las esporas esporangiosporas. Si se forma fuera de un saco, se les designa conidiosporas. Las esporas sexuales que se forman dentro de un saco (ascas) se denominan ascosporas Muestran requerimientos nutricionales mínimos y su ph es cercano a 5,6 Los límites de temperatura para su desarrollo es de -6 > 70 Se multiplican abundantemente a humedades elevadas La mayoría de los mohos son aeróbicos Son heterótrofos, pero crece bien en cultivos simples Algunos son termodúricos Algunos producen micotoxinas Las levaduras se distinguen de los mohos en que son unicelulares, no suelen formar filamentos y se reproducen por fisión binaria o gemación. Generalmente son de forma ovalada La identificación de los mohos, unicelulares o filamentosos se realiza a través de: Morfología colonial Microcultivo 68
Morfología microscópica Pruebas metabólicas (levaduras) Composición de la pared celular Respiración Nutrición Reproducción Genética molecular. Morfología colonial: Los mohos unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el diámetro oscila entre 2-4 mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. cóncavas de aspecto brillante o mate, opacas, de bordes lisos. Morfología colonial: Los mohos filamentosos (mohos), tienen colonias de 2-3 cm de diámetro, de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. con aspecto polvoso, rugoso, terroso, aterciopelado, algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares. Morfología microscópica: La morfología microscópica se observa con la ayuda del microscopio a seco fuerte mediante la realización del microcultivo, observándose las siguientes estructuras: 1.- Según su nivel de organización celular pueden ser: - Unicelulares (levaduras) - Pluricelulares (mohos) - Dimórficos (posee ambos tipos de micelio) Fig. 71 a.- Unicelular b.- Pluricelular Por su tamaño Fig. 71 Macroscópicos Microscópicos 69
Por su forma Fig. 72 Amorfos (masa algodonosa) Definida (crecimiento circular) Fig. 73 Por su ausencia o presencia de septos Aéreo fuera del sustrato Profundos dentro del sustrato 70
Fig. 74 Por su localización Por su aspecto Algodonoso, aterciopelados, terrosos, húmedo, seco. Por su función: - Micelio vegetativo: se encarga de la captación de nutrientes. - Micelio aéreo o reproductor: producción de esporas (sexual y asexual) b) De acuerdo al color de las hifas: - Hialino: cuando no está pigmentado. - Dematiáceo: cuando posee color café oscuro. c) Su sistema de reproducción es asexual y sexual: - Las esporas asexuales son: Talosporas. a) Artrosporas: Son esporas que se forman por fragmentación de las hifas. b) Blastospora: Se forman en las levaduras por la gemación a partir de una célula ya preexistente. c) Clamidospora: Estas esporas son redondas y tienen doble pared gruesa que les confieren resistencia. Conidiosporas a) Microconidias: Son esporas unicelulares b) Macroconidias: Son esporas multinucleadas. Esporangiosporas Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo, por una estructura llamada esporangióforo. - Las esporas sexuales son: Zigosporas: esporas contenidas en cigosporangios en los Zimomycetes. Ascosporas: esporas contenidas en saquitos denominados ascas en los Ascomicetes. Oosporas: esporas contenidas en oosferas correspondientes a los Oomycetes. Basidiosporas: esporas contenidas en basidios correspondientes en Basidiomicetes. Morfología colonial de mohos y levaduras 71
Fig. 75 Diferentes forma de levaduras y mohos OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE MOHOS. Determinar: Tamaño, forma, aspecto, color, producción de pigmento difusible y anotar los días de incubación. A continuación se muestran dibujos de mohos filamentosos. Una vez realizada las observaciones las cepas se pueden sembrar en tubo para su conservación o para la realización del microcultivo Sembrar por punto en tubos con PDA y ADS Fig. 75 Conservación de cepas de mohos. IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (MICROCULTIVO) 1. Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bisturí estéril y caliente. Fig.76 Forma en que se cortan los cuadros de agar par el microcultivo 2. Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que está sobre una varilla de vidrio doblada en forma de V en una caja de Petri (previamente esterilizada). 72
Fig. 77 Material parta el microcultivo y puesta del cuadro de agar 3. Tomar con el asa él inoculo del moho previamente seleccionado. 4. Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar. 5. Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio. Fig. 78 Inoculación del cubo de agar, y colocación del glicerol para mantener la huemdad 6. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri. 7. Incubar la caja a 28 C durante 48 h. REALIZAR OBSERVACIONES MÍNIMO CADA 12 h PARA IDENTIFICAR LOS CUERPOS FRUCTÍFEROS. 1. Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, retirar el glicerol con una pipeta Pasteur. Fig. 79 Observación del crecimiento del hongo y retiro del glicero para su inactivación 2. Adicionar 5 ml de formaldehído para inactivar el moho durante 15 minutos. 73
Fig. 80.- Inactivación del moho 3. Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un portaobjetos que contenga una gota de azul de algodón, sellar la preparación con barniz de uñas transparente. 4. Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodón, colocar un cubreobjetos sobre el colorante y sellar la preparación. Observar las preparaciones a 10X y 40X. Fig. 81.- Realización de la preparación en fresco del microcultivo 5. Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía realizar la comparación de las estructuras reproductoras y vegetativas, identificar de que moho se trata. Por ejemplo: Rizopus sp Fig. 82 Aspergillus Penicillium Alternaria 74
Fig. 83 Rhizopus sp OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LEVADURAS Para la identificación de levaduras utilizamos generalmente reacciones de fermentación de carbohidratos. Observar las levaduras que pueden aparecer sobre la superficie o en el seno del agar. En el primer caso son circulares y de diámetro mayor al de las bacterias; en el seno del agar suelen aparecer estrelladas y algo más pequeñas, son de aspecto húmedo y pueden ser coloridas. Fig. 84 Crecimiento de levaduras OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS. 1. De una placa de PDA incubada a 35 C seleccionar una colonia de levadura. 2. Fijar la levadura de la misma manera como se fija una bacteria. 3. Teñir la preparación con cristal violeta, lavar y dejar escurrir. 4. Observar la preparación en 10X y 40X y dibujar. 75
Fig. 85 Observación microscópica de levaduras 76
Métodos de conservación de cepas En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que conservar, teniéndose varios métodos para su conservación pero es necesario tomar en cuenta las características del microorganismos, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues sucede que nuestras cepas tipo pueden en un momento sufrir las siguientes daños como la deshidratación, cambios genéticos o perdida de la viabilidad y finalmente la muerte celular. Fig. 91 Deshidratación del medio en tubo con tapón de algodón. Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiología son: Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación; Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y Que estas células permanezcan genéticamente estables. Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios métodos de conservación para los microorganismos. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados, que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y métodos restringidos. A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo. Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método preparatorio en si mismo. Los métodos de conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización. a) Conservación por congelación. Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método son los siguientes: 1º.- Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomórficos e incluso en algunos más sencillos. 2º.- Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para la congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar conviene poner las células a 37ºC. 77
3º.- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene una temperatura de 195ºC, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de 140ºC. Aquellos congeladores que sólo alcanzan temperaturas entre 20ºC y 40ºC, como ocurre con la mayoría, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentración de solutos que existen en la suspensión celular, su punto de congelación baja. El daño que se produce en las células es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentración iónica. Para la conservación en congeladores, las células se almacenan en criotubos (tubos de plástico esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Este método no se debe emplear para la conservación de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el género bacteriano Clostridium, ya que al estar las células en una superficie hay un mayor contacto con el oxígeno y puede afectarse la viabilidad. 4º.- Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa o inositol. En su elección influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar. b).- Conservación por liofilización. Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores. Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es muy cómodo. Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilización son lógicamente los mismos que influyen en la congelación, a los que habrá que añadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratación. Sin embargo, antes de pasar a explicar éstos, tenemos que hacer unas breves consideraciones sobre los que antes hemos mencionado para el caso de la congelación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, ya vimos que se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas, mezclas de glucosa con caldo hígado o chopped meat (sin carne) para bacterias anaerobias. Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservación son: 1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos mohos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos. 78
2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden de 10 8-10 9 células /ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de mohos filamentosos y levaduras. 3. Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de 50ºC. 4. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que no es perjudicial. 5. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células. 6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad. B.- Métodos alternativos. Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos. a).- Conservación por transferencia periódica. La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características. Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inoculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos; y almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC. A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos. b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril. Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentración celular no debe ser superior a 10 4-10 5 células /ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar diluida. Para demostrar la eficiencia de un método en nuestras cepas se tiene que determinar el porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica, bioquímica y la virulencia.. C.- Métodos restringidos. En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro métodos que vamos a citar se basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células. 79
a).- Desecación en papel de filtro. Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelación incontrolada de las células. b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc. Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es barato y de fácil conservación. Fig. 92 Deshidratación del medio para generación de esporas en mohos Fig. 93 Conservación de esporas en aceite mineral y arena estéril Desecación en bolitas de alginato. Éste es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a 80ºC debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato. Este es un método que se está utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales. c).- Desecación en sal para halobacterias. Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible. 80
Por último, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el método empleado en la conservación de las cepas microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las células que se han estado guardando, porque éstas vienen de una situación de estress más o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de prueba. Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo más posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas en medios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad microbiana, cada microorganismo soportará determinados métodos de conservación mejor que otros, o será necesario tomar precauciones especiales en su conservación. Como ya dijimos al comienzo, no existe un método general de conservación de los microorganismos, aunque no resulta difícil determinar el más aconsejable en cada caso. La mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a largo plazo con los métodos generales de congelación y/o liofilización, y para periodos cortos pueden mantenerse vivos. CULTIVO EN TUBO INCLINADO PARA CONSERVACIÓN DE CEPAS POR REFRIGERACIÓN 1.- Tomar un tubo con agar de soya y tripticaseína y sembrarlo por estría simple 2.- Adicionarle 3 ml de aceite mineral estéril. (El aceite se puede esterilizar en autoclave o en el horno) 3.- Cerrar el tubo con el tapón, etiquetar el tubo perfectamente, colocarlo dentro de un bote y guardarlo en el refrigerador. Fig. 94.- Diferentes formas de conservación de cepas Fig. 95 Una de las formas más usuales de conservar las cepas es en congelación 81
PRUEBAS BIOQUÍMICAS Aislamiento Una vez transcurrido el tiempo de incubación del cultivo, observamos la placa de Petri, escogeremos las colonias que estén separadas, a estas les realizaremos la morfología colonial previamente revisada, además haremos una tinción de Gram para determinar el grupo al que pertenece. Una vez conocido el Gram podremos realizar la Identificación del microorganismo y para ello es necesario elegir las más adecuadas acorde a lo que tenemos y a lo que nos sugiere la bibliografía, pues existen algunas marchas ya descritas las cuales nos son de gran valor para la Identificación. La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias, por medio de las cuales podemos identificarlas hasta especie, es realizando un subcultivo de la colonia pura, aunque es posible efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario, selectivo o diferencial. Se recomienda que de una sola colonia hacer una suspensión bacteriana en 1 ml de solución salina fisiológica 0.85 p/v para que de ahí se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioquímicas. Los siguientes pruebas de Identificación para bacterias están agrupados por bacterias Gram (-) y +). PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.) TSI (fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico y producción de gas) LIA ( Descarboxilación de la lisina) MIO (movilidad, Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol) SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico) Rojo de metilo Producción de urea Reacción de Voges Proskauer Utilización de Malonato Utilización del citrato Licuefacción de la gelatina Crecimiento en caldo nutritivo Utilización de la esculina Utilización del gluconato Requerimientos de oxígeno Catalasa Oxidasa Reducción de nitratos Fermentación O/F PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.) TSI (fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico y producción de gas) LIA ( Descarboxilación de la lisina) MIO (movilidad, Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol) SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico) Catalasa 82
Oxidasa Reducción de nitratos Hemólisis Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 % Crecimiento en bilis al 40 % Coagulasa Licuefacción del a gelatina Hidrólisis de la esculina Voges - Proskauer Prueba de la fosfatas Prueba de la DNAsa Incubación a 10 y 45 C Reducción con azul de metileno Hidrólisis del hipurato Formación de cápsula Hidrólisis del almidón Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura para hacer una selección de pruebas recomendable y lograr el objetivo lo más rápido posible y sin perdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas. UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS 1.- HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN Fundamento. Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo. a.- En una caja con agra almidón se procede a inocular por estrías simple la placa b.- Incubar la caja a 35 C durante 24 h. c.- Después de la incubación añadir unas gotas de lugol cubriendo la superficie de la placa. - RESULTADOS: + Positivo.- Si se forma un halo claro alrededor de la estría. - Negativo.- No se forma un halo claro alrededor de la estría. Fig. 96 Siembra en agar almidón y realización de la prueba con lugol 2.- FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL 83
Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio, produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene rojo de fenol por lo que: Indicador de ph: rojo de fenol ph ácido: Color amarillo ph alcalino: Color rojo Prueba positiva: da una coloración amarilla y con la producción de gas (aerogénica) Prueba negativa el color se mantiene de color rosa-rojiza. El tiempo de incubación es de 24 h a.- Al tubo con campana de Durham y caldo rojo de fenol más el carbohidrato por ejemplo sacarosa, inocular 0.1 ml de la suspensión microbiana. b.- Incubar a 35 C de 24 a 48 horas c.- Observar el tubo - RESULTADOS: + Positivo.- Si hay cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham - Negativo.- Si hay no cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham Fig. 97 Fermentación de un azúcar con campana de Durham 3.- FERMENTACIÓN DE AZUCARES EN MEDIO TSI. Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar hierro (TSI). Fundamento: Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro. La formula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar esta preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2 cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, pico de flauta expuesta en toda su superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamado fondo está protegida del aire y es relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de flauta, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, para ello utilizar tubos de 13 X 100 mm. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18-24 h. Indicador de ph: rojo de fenol ph ácido: Color amarillo 84
ph alcalino: Color rojo RESULTADOS: Prueba positiva: La fermentación de la glucosa se lleva a cabo en anaerobiosis, por lo cual la prueba se lee en el fondo del tubo. Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo Glucosa negativa: Fondo alcalino, sin cambio. Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla Sacarosa y lactosa negativas: superficie roja Lactosa positivo: Color amarillo en el pico de flauta. Lactosa negativo: De color rojo en el pico de flauta. Producción de H 2 S: Presencia de una coloración negra. Producción de CO 2 y H 2 : Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio del fondo dejando un espacio libre. a.- Inocular con el asa recta por picadura y después por estría abierta en forma de S sobre el pico de flauta en un tubo con agar TSI a partir de la suspensión. b.- Incubar el tubo a 35 C durante 24 h y observar los cambios en el tubo. Fig 98 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: Tubo sin inocular2.- A/A con producción de gas, 3 A/A sin producción de gas, 4 K/A sin producción de gas y H 2 S negativo, 5 A/A y H 2 S positivo sin producción de gas, 6K/A con producción de H 2 S y sin producción de gas. Fig 99 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: A/A sin producción de gas y H 2 S negativo, 2: K/K y H 2 S negativo sin producción de gas, 3 K/K sin producción de gas y H 2 S negativo e inmóvil, 4 K/A con producción de gas y H 2 S negativo, 5: K/A con producción de gas y H 2 S positivo y móvil y Tubo 6: A/K 85
4.- PRUEBA DE ROJO DE METILO Fundamento: El rojo de metilo es un indicador de ph con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es cualitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos láctico, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen muchos microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos organismos que puedan mantener este ph bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h), contrarrestando el sistema estabilizador de ph del medio. La preparación de este medio se hace en tubos de 13 X 100, colocando 4 ml del medio de RM VP y se inocula con el cultivo puro del organismo en estudio. Incubar el caldo a 35 C durante 48 72 h (no menos de 48 h, finalizando este período, añadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo. Indicador de ph: Rojo de metilo Rojo de metilo positivo: Color rojo estable en la superficie del medio que indica la producción de ácido suficiente como para bajar el ph a 4,4. Rojo de metilo negativo: dado que algunos microorganismos produzcan cantidades menores de ácido puede producirse un color entre el amarillo y rojo lo que indicara que la prueba es negativa. Controles Prueba Control negativo Control positivo Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes a.- Inocular con 0.1 ml de la suspensión al caldo rojo de metilo. b.- Incubar el tubo a 35 C durante 48 h. c.- Después de la incubación, añadir al tubo 2 gotas de la solución de rojo de metilo y observar. RESULTADOS: Prueba positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo. Prueba negativa: El cultivo no cambia de color. Fig. 100 Resultados del medio rojo de metilo 5.- PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER Fundamento: La reacción de Voges Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en diacetilo por acción del KOH al 40 % y el oxígeno atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el α - naftol actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo. Indicador de ph: Rojo de metilo 86
Prueba Control negativo Control positivo Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp a.- Inocular un tubo que contenga caldo Voges Proskauer con 0.1 ml de la suspensión b.- Incubar el tubo a 35 C durante 24 h. c.- Después de incubar, agregar 6 gotas de solución de alfa-naftol y 2 gotas de solución de KOH, en ese orden estricto y agitar suavemente, dejar en reposo 10-15 minutos y observar los cambios en el medio. RESULTADOS: Prueba positiva: Color rojo ladrillo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetoina) Prueba negativa: No hay cambio en el color del medio. Fig. 101- Resultado de la prueba de VP, tubo 1 negativo, tubo 2 positivo y tubo 3 medio sin inocular UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS 6.-CITRATO DE SIMMONS Fundamento Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de ph. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de ph, de verde a azul. Controles Control positivo: Enterobacter aerogenes Control negativo. Escherichia coli. a.- Inocular por estría abierta en forma de S un tubo que contenga agar Citrato de Simmons a partir de la suspensión. b.- Incubar el tubo a 35 C durante 24 h. c.- Observar los resultados RESULTADOS: Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul). Negativa: No hay desarrollo (medio de color verde). 87