PRACTICA Núm. 3 PREPARACIONES DE EXTENSIONES O FROTIS Y TINCION SIMPLE I. OBJETIVO Conocer el procedimiento para preparar extensiones ó frotis y los diferentes métodos de tinción, así como su utilidad en el estudio microscópico de los microorganismos. II. INTRODUCCION Un procedimiento útil para el examen de muestras es el estudio microscópico de preparaciones fijas - extensiones o frotis - preparados a partir de ellas y coloreadas por el método adecuado. Esto permite eliminar el movimiento que presentan los microorganismos en las preparaciones en fresco. La retención de colorantes de alquitrán de hulla por las bacterias permite su fácil observación bajo el microscopio. La forma más común de preparar un frotis es extender un poco de muestra sobre un portaobjetos desengrasado, con el asa bacteriológica, pero también se puede hacer con un hisopo ó presionando el portaobjetos sobre la muestra impronta. Dependiendo del tipo de microorganismo o estructura del mismo que se desee observar es el tipo de tinción que se emplea. P. ej. Tinción Simple, Diferencial de Gram, Negativa, para cápsulas (Método de Anthony), para flagelos, para endosporas, para núcleo, para bacterias ácido alcohol resistentes (Tinción de Ziehl Neelsen), entre otras. Los colorantes son productos químicos sintéticos del tipo de la anilina capaces de combinarse con una gran variedad de sustancias impartiéndoles color. El color es impartido por su estructura química. Los colorantes de alquitrán de hulla usan bases de anillos aromáticos tales como benceno, naftaleno o antraceno. Varios grupos químicos son ligados a los anillos aromáticos para impartir los diferentes colores. Los grupos productores del color son llamados cromóforos, siendo los más comunes p-quinona y diazo. Ciertos grupos químicos llamados auxocromos, tales como los grupos amino e hidroxilo ayudan a fortalecer a los cromóforos. 21
Las propiedades ácidas o básicas de los colorantes permiten su fácil clasificación en: Acidos. Estos ionizan en soluciones acuosas para producir un núcleo colorante con carga (-), es decir el grupo iónico que imparte el color tiene carga negativa, o sea, es un anión. Estos colorantes tiñen material citoplasmático, no son muy usados en Microbiología. Por ejemplo: eosina, rojo congo, fucsina ácida Básicos. En los que el ion que lleva el color tiene carga (+). Estos colorantes tienen afinidad por el material nuclear y otros componentes. Estos son los más usados en microbiología, ya que debido a la gran cantidad de ribosomas que contienen ácido ribonucleico en todo el protoplasma de la célula bacteriana, éstas se tiñen fácilmente. Ej. Azul de metileno, fucsina básica, cristal violeta. Neutros. Se obtienen cuando se mezclan colorantes ácidos y básicos, donde la carga eléctrica de éstos es cero. P ej. Giemsa, derivado de sal de amonio y eosina. Tinción Simple. Se denomina así, porque solo se utiliza un colorante, generalmente básico. Con este tipo de coloración no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares. Las técnicas de coloración simple pueden ser positivas cuando el colorante es fijado por las células apareciendo los microorganismos de color oscuro o coloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando los microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tiñe y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro. III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS 4 portaobjetos. Gradilla. 22
Asa bacteriológica. Mechero Bunsen. Cerillos ó encendedor. Lápiz graso. Papel absorbente. Hisopos. Microscopio. Aceite de inmersión. Cristal violeta. Azul de metileno. Verde de malaquita. Safranina. Cultivo en medio sólido. Cultivo en medio líquido. IV. TECNICA A. Preparación de Extensiones o Frotis. Se deberán emplear portaobjetos perfectamente limpios y sin raspaduras para evitar interferencias en la observación. 1. Flamear el portaobjetos para desengrasarlo. 2. Si el cultivo es sólido, colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos, y con el asa bacteriológica estéril, tomar una pequeña cantidad de material, emulsionar y extender uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm 2. 3. Si la muestra es líquida, tomar directamente el material con el asa estéril y extenderlo uniformemente sobre la superficie indicada anteriormente. 4. Dejar secar la extensión al aire. 5. Una vez seca la extensión, fijarla al calor suave, pasando rápidamente el portaobjetos sobre la flama del mechero, sin calentar demasiado, unas 10 veces. Las extensiones deberán ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz a través de ellas y facilitar su observación. (Fig. 3.1) Preparar 2 extensiones a partir de cada cultivo. 23
B. Tinción. 1. Cubrir la extensión debidamente preparada con la solución colorante. 2. Dejar actuar el colorante por 1 minuto. 3. Lavar con agua corriente hasta eliminar exceso de colorante. 4. Dejar secar al aire o presionando el portaobjetos entre 2 capas de papel absorbente como papel filtro ó papel sanitario. 5. Una vez seca la extensión, colocar sobre ella una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio con el objetivo de inmersión. 6. Dibujar lo observado: Cultivo en medio sólido. Cultivo en medio líquido. V. CUESTIONARIO 1. Consultar las estructuras de 2 colorantes ácidos y 2 básicos. 2. Qué significa fijar la extensión y qué sucede durante este proceso? Mencionar otros 2 métodos de fijación. 3. Qué característica presenta el aceite de inmersión? 4. Por qué es necesario teñir las extensiones? 5. Consultar otras 2 técnicas para la preparación de extensiones. 24
25 MICROBIOLOGIA APLICADA