EXAMEN PRACTICO NIVEL II Tema: Microbiología General

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1 EXAMEN PRACTICO NIVEL II Tema: Microbiología General Puntaje Total: 50 puntos Introducción Una de las principales áreas de la Microbiología es la Microbiología diagnóstica, en la cual un microbiólogo aísla e identifica agentes infecciosos mediante diferentes pruebas que permiten cuantificar reacciones bioquímicas y metabólicas particulares de estos agentes. Para la mayoría de los microorganismos, se necesitan tres o cuatro pruebas para una identificación inequívoca. Cada vez resulta más notoria la importancia que tiene la identificación exacta del patógeno para luego tratar correctamente una infección. OBJETIVO Identificar una especie bacteriana empleando pruebas metabólicas de uso frecuente en un laboratorio microbiológico. Materiales (reactivos y equipamiento) - 1 Mechero - 1 placa de Petri rotulada MUESTRA - 2 portaobjetos - 1 ansa - 1 gotero con agua - 1 pinza de madera - 1 bandeja con soporte para el portaobjetos - 1 recipiente plástico con agua para enjuagar - 1 gotero con cristal violeta - 1 gotero con lugol - 1 gotero con solución de alcohol acetona - 1 gotero con safranina - 1 gotero con agua oxigenada. - Papel absorbente Controlar que el material esté completo, dado que el mismo NO se repone. Importante: El laboratorio dispone de goteros con aceite de inmersión (para ser utilizado cuando sea necesario), recipientes con hipoclorito de sodio al 7% para descartar el material. Antes de proceder, por favor, se solicita tener en cuenta algunas normas de BIOSEGURIDAD: - Utilizar el mechero con precaución. - Ser cuidadoso al manipular los reactivos y demás elementos, evitando derrames y salpicaduras, dado que las cantidades provistas permiten la realización de la prueba UNA SOLA VEZ. - Descartar el material ya usado en el recipiente con hipoclorito de sodio al 7%. ÉXITOS!!!! 1

2 METODOLOGÍA A-Tinción de Gram La tinción de Gram es una tinción diferencial que se utiliza para distinguir distintas clases de bacterias. a- Colocar una gota de agua en el centro de un portaobjeto (como se muestra en la figura). b- Realizar un extendido, tomando con el ansa una colonia de la placa de Petri rotulada como MUESTRA, homogeneizarla con la gota de agua. c- Secar el extendido acercándolo al mechero y luego fijarlo con calor. d- Colocar el extendido sobre el soporte para portaobjetos y comenzar a realizar la tinción, para ello deben: * Cubrir con una gota de cristal violeta la zona del portaobjeto que tiene la preparación. Dejar 20 segundos y luego lavar con un chorro fino de agua por 10 segundos. * Cubrir con lugol. Dejar 30 segundos. * Decolorar el preparado con solución de alcohol-acetona, haciendo presión en el frasco plástico, para que salga un chorro fino que arrastre el colorante. No se debe exponer el preparado más de 10 segundos a la acción de esta solución. Lavar con chorro fino de agua por 10 segundos. * Cubrir con safranina. Dejar 20 segundos. Lavar con agua. * Colocar el extendido verticalmente en el soporte de portaobjetos, permitiendo que se seque el extendido. e- Observar al microscopio en 100X (IMPORTANTE: UTILIZAR ACEITE DE INMERSIÓN). f- Llamar al responsable del práctico para corroborar lo observado. Nota: El tiempo puede ser tomado utilizando reloj pulsera o contando la cantidad de segundos necesarios en cada paso. Si bien este tiempo es importante en la coloración, no requiere de exactitud sino de estimación. Preguntas 1- Según lo observado al microscopio en cuanto a morfología, coloración y disposición, el microorganismo es: a) bacilo Gram positivo en cadenas. b) bacilo Gram negativo en cadenas. c) coco Gram positivo en cadenas. d) coco Gram negativo en cadenas. e) coco Gram positivo en racimos. f) coco Gram negativo en racimos. 2

3 2- Se presentan características sobre la composición de la pared celular de las bacterias, indicar con GP si son Gram positivas, y con GN si son Gram negativas. I. ( GP ) Está compuesta por varias capas de peptidoglucano que conforman una estructura gruesa y rígida. II. ( GN ) Está compuesta por una delgada capa de peptidoglucano y una membrana externa. III. ( GP ) Contiene ácidos teitoicos compuestos principalmente por un alcohol y fosfato. IV. ( GN ) El peptidoglucano que la constituye está unido a lipoproteínas de la membrana externa mediante enlaces covalentes. V. ( GP ) Los ácidos teitoicos contribuyen al desarrollo celular al prevenir la ruptura de dicha pared y reducir el riesgo de lisis. B- Prueba de la catalasa La enzima catalasa es capaz de destruir las formas tóxicas del oxígeno. a- Colocar una gota de agua oxigenada en el centro de un portaobjeto (como se muestra en la figura). b- Tomar con el ansa una colonia de la placa de Petri rotulada como MUESTRA, mezclarla con el agua oxigenada y observar. Preguntas 1- La presencia de la enzima catalasa, se puede evidenciar por la formación de burbujas, para esta prueba, el microorganismo es: a) positivo. b) negativo. 2- La enzima catalasa convierte: a) el peróxido de hidrógeno en agua y radicales hidroxilo. b) el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. c) el peróxido de hidrógeno en agua. d) los radicales libres superóxido en agua y radicales hidroxilo. e) los radicales libres superóxido en agua y oxígeno. f) los radicales libres superóxido en agua. C- Detección de hemolisinas La enzima hemolisina es capaz de romper los glóbulos rojos. a- Se tomó con el ansa una colonia de la placa de Petri rotulada como MUESTRA y se sembró mediante estrías por agotamiento en una placa de Petri con Agar Sangre al 5% como medio de cultivo (placa A). b- Luego de incubar durante 24 hs a 37ºC, se observa el siguiente resultado (placa B): Importante: Los resultados de esta prueba se encuentran disponibles en el lugar indicado en el laboratorio. 3

4 Preguntas 1- Según lo observado en cuanto a la producción de hemolisinas, el microorganismo es: a) positivo b) negativo 2- La presencia de hemolisinas en este medio de cultivo se pone de manifiesto por: a) el lisado de los glóbulos rojos presentes en dicho medio b) el buen desarrollo del microorganismo en dicho medio c) la formación de áreas claras alrededor de las colonias desarrolladas en dicho medio d) a y b son correctas. e) a y c son correctas. f) b y c son correctas. g) a, b y c son correctas. D- Prueba de la coagulasa La enzima coagulasa es capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina. a- Se tomó con el ansa una colonia de la placa de Petri rotulada como MUESTRA y se sembró en un tubo conteniendo 0.5 ml de plasma de conejo como medio de cultivo (tubo A). b- Luego de incubar durante 24 hs en un baño termostatizado a 37ºC, se observa el siguiente resultado (tubo B): Importante: Los resultados de esta prueba se encuentran disponibles en el lugar indicado en el laboratorio. 4

5 Preguntas 1- Según lo observado en cuanto a la presencia de la enzima coagulasa, el microorganismo es: a) positivo b) negativo 2- Indicar verdadero (V) o Falso (F): I- (F.) La presencia de la enzima coagulasa se pone de manifiesto por un cambio de color en el medio de cultivo. II- (F ) Para evidenciar la presencia de la enzima coagulasa es necesario agregar sangre al medio de cultivo. III- (V.) La presencia de la enzima coagulasa se pone de manifiesto por la formación un coágulo. IV- (F ) Para evidenciar la presencia de la enzima coagulasa es necesario agregar agua oxigenada al medio de cultivo. V- (F.) La presencia de la enzima coagulasa se pone de manifiesto por la formación de burbujas en el medio de cultivo. VI- (V ) La virulencia de algunas bacterias sería facilitada por la producción de enzimas extracelulares como la coagulasa. VII- (F ) Una bacteria coagulasa negativa, puede evitar la fagocitosis porque se protege con las hebras de fibrina formadas a partir del fibrinógeno de su huésped. D- Crecimiento en ClNa al 15% Es la capacidad del microorganismo de crecer en altas concentraciones de sales. a- Se tomó con el ansa una colonia de la placa de Petri rotulada como MUESTRA y se sembró en un tubo conteniendo caldo cerebro-corazón y 15% de ClNa como medio de cultivo (tubo A). b- Luego de incubar durante 24 hs a 37ºC, se observa el siguiente resultado (tubo B): Importante: Los resultados de esta prueba se encuentran disponibles en el lugar indicado en el laboratorio. 5

6 tubo (A) antes de la incubación tubo (B) después de la incubación Preguntas 1- Según lo observado en cuanto al crecimiento en ClNa al 15%, el microorganismo es: a) positivo b) negativo 2- El crecimiento en ClNa al 15% se pone de manifiesto por: a) un cambio de color en el medio de cultivo. b) presencia de turbidez en el medio de cultivo. c) la formación de un coágulo. d) la formación de burbujas. e) a y c son correctas. f) b y d son correctas. E- Crecimiento a 45ºC Es la capacidad del microorganismo de crecer a altas temperaturas. a- Se tomó con el ansa una colonia de la placa de Petri rotulada como MUESTRA y se sembró en un tubo conteniendo caldo cerebro-corazón como medio de cultivo (tubo A). b- Luego de incubar durante 24 hs a 45ºC, se observa el siguiente resultado (tubo B): Importante: Los resultados de esta prueba se encuentran disponibles en el lugar indicado en el laboratorio. 6

7 tubo con medio de cultivo antes de la incubación tubo con medio de cultivo después de la incubación Preguntas 1- Según lo observado en cuanto al crecimiento a 45 ºC, el microorganismo es: a) positivo b) negativo 2- Los microorganismos se clasifican en función de la temperatura óptima de desarrollo: (completar con el código correspondiente) I- Los 02 son microorganismos con afinidad por las temperaturas moderadas. II- Los 04 son microorganismos con afinidad por las temperaturas muy altas. III- Los 01 son microorganismos con afinidad por las temperaturas bajas. IV- Los 03 son microorganismos con afinidad por las temperaturas altas. Códigos: 01: sicrófilos 02: mesófilos 03: termófilos 04: hipertermófilos G- Identificación final 1- Cuál de las siguientes opciones presenta el orden secuencial necesario para identificar una especie bacteriana? I- Obtención de un cultivo puro. II- Recolección de la muestra. III- Registro de resultados. IV- Incubación de muestras. V- Comparación de resultados experimentales y teóricos. VI- Resultados finales de pruebas bioquímicas: identificación del microorganismo. VII- Realización de pruebas metabólicas VIII- Examen microscópico de frotis teñido por coloración Gram. 7

8 Bacillus cereus Streptococcus pyogenes Staphylococcus epidermidis Escherichia coli Staphylococcus intermedius Staphylococcus aureus Respuesta a) II, I, VIII, VII, IV, III, V, VI. b) II, VII, I, VIII, IV, V, VI, III. c) II, I, VII, IV, VIII, VI, III, V. d) II, IV, I, VII, III, V, VI, VIII. e) II, IV, VII, VIII, I, III, V, VI. 2- Comparar los resultados obtenidos para cada prueba metabólica con la tabla a continuación: Gram Morfología bacilo coco coco bacilo coco coco Catalasa Coagulasa Hemolisinas Crecimiento en ClNa al 15% Crecimiento a 45ºC Según los resultados obtenidos, la especie bacteriana aislada es: Respuesta: S. aureus 8