PROTOCOLO DE UTILIZACIÓN Hibridación para cortes de tejidos preservados en parafina
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- José Antonio Moreno Rey
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1 PROTOCOLO DE UTILIZACIÓN Hibridación para cortes de tejidos preservados en parafina Materiales Provistos: ADN marcado con moléculas fluorescentes (sonda). Buffer de Hibridación Reactivos para preparar solución de montaje (Antifade y DAPI) Sales para preparar 80ml de Buffer de Desparafinado* Sales para preparar 80ml de Buffer de Pretratamiento* *ver protocolos de preparación mas abajo. Materiales extras requeridos: 2XSSC* Soluciones de etanol 70, 90 y 100% Acido clorhídrico 0.2N Agua destilada Pepsina 0.5%* Detergente no-iónico ph-metro o papel para medir ph Cubreobjetos Soluciones de enjuague (1 y 2)* Cemento de contacto removible Tubos 0,2 o 0,5ml Recipientes para enjuagues (Coplin) Aceite de inmersión Cámara húmeda Termómetro *ver protocolos de preparación mas abajo. Equipamientos requeridos: Microscopio de fluorescencia: No siempre un microscopio utilizado en reacciones de inmunohistoquímica u otro tipo de análisis con fluorescencia resulta adecuado. Los requerimientos para observar correctamente una reacción de FISH son los siguientes: o Fuente de Excitación: Se recomienda una lámpara de mercurio de 100 Watt con una vida útil de 200horas. Es necesario que una vez colocada, la lámpara sea alineada correctamente. o Objetivos: Para la ubicación del blanco (interfases o metafases) se recomiendan objetivos de 10, 20 y/o 40X. Para el análisis de la reacción es necesario un objetivo de inmersión especial para fluorescencia con una apertura numérica 0,75.
2 o Filtros de excitación-emisión: Cada fluorocromo observado requerirá de diferentes filtros. Los requerimientos para nuestras sondas se muestran en el cuadro a continuación: Fluorocromo Excitación (nm) Emisión (nm) Verde Rojo DAPI Micropipetas (1-10µl o similar) Microcentrífuga Vórtex Timer Baño de inmersión Incubadora 37ºC) Placa termostática o hibridizador Preparación de soluciones extras: Buffer de Deparafinado Agregar las sales provistas en el tubo rotulado Buffer de Desparafinado a 70ml de H2O ultrapura. Agregar de 400ul de detergente no iónico (NP40, Tween o similar) Llevar a ph 8 con HCl. Completar hasta volumen final (80ml) con H2O ultrapura. Luego de preparado mantener en heladera a 4ºC Buffer de Pretratamiento: Agregar las sales provistas en el tubo rotulado Buffer de Pretratamiento a 50ml de H2O ultrapura. Llevar a ph 8.5 con HCl. Completar hasta volumen final (80ml) con H2O ultrapura. Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC Pepsina Solución Stock: 10% [0.1g/ml] Diluir 0.1g de pepsina en 1ml de Agua Ultrapura (Importante el ph debe ser = 2) Luego de preparado guardar a -20ºC Solución de trabajo: 0.05% [0.5mg/ml] Pepsina solución Stock: 0.4ml HCl 12N (fumante): 0.66ml H2O destilada: 79ml (Importante el ph final debe ser = 2) Luego de utilizar, guardar a 4ºC hasta 30 días o 4 usos. 2XSSC: Cloruro de Sodio (NaCl) 300mM Citrato de Sodio (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) 30mM Ajustar a ph:7 con Acido clorhídrico (HCl) 1N Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC Enjuagues 1 y 2: En un coplin adecuado para 80ml, agregar 80ml de 2XSSC y 0,080ml de detergente no-iónico. Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC
3 Precauciones y advertencias (Leer atentamente): Reactivo analítico. Para uso en investigación solamente. Este producto NO está probado para uso diagnóstico o terapéutico. Las reacciones así como la interpretación de las mismas deben ser realizadas por personal idóneo debidamente entrenado. Todas las muestras biológicas deberían ser tratadas como posibles transmisores de agentes infecciosos. Se debe evitar la exposición de la muestra a ácidos o bases en alta concentración así como también al calor extremo. Estos factores dañan el DNA y pueden causar el fallo de la reacción de FISH. Una vez extraída la alícuota a utilizar, la sonda debe ser guardada nuevamente a -20ºC. La falla u omisión de cualquiera de los pasos del protocolo detallado más abajo puede generar resultados erróneos o inaceptables. Las soluciones de enjuague pos-hibridación (ver protocolo) deben ser renovadas periódicamente debido a que son propensas de contaminación. El buffer de hibridación contiene formamida, un teratógeno, por lo que debe evitarse el contacto con la piel y las mucosas. Se recomienda el uso de guantes y chaqueta de trabajo durante todo el proceso. Es necesario controlar siempre la temperatura de las soluciones que se utilizan calientes. Todos los materiales peligrosos deben ser descartados de acuerdo a las normativas de su institución.
4 Protocolo de utilización Desparafinado: Pasos previos Preparar 1 recipiente (coplin) con Buffer de Desparafinado. Por lo menos 30 minutos antes de comenzar el proceso de desparafinado, colocar en un baño termostático a 90ºC. (Opcional) Incubar los preparados conteniendo los cortes de tejido a 58ºC durante 30 minutos. Sumergir los vidrios en Buffer de Desparafinado a 90ºC durante minutos. Enjuagar 2 veces en Etanol 100% 3 minutos cada vez. Dejar secar Pretratamiento: Pasos previos Preparar un recipiente (coplin) con Buffer de Pretratamiento. Colocar en un baño termostático a 71ºC. Antes de utilizar corroborar que la temperatura interna de la solución sea de 71ºC (±1ºC) Preparar un recipiente (coplin) con Solución de trabajo de Pepsina en un baño termostático a 37ºC. Antes de utilizar corroborar que la temperatura interna de la solución sea de 37ºC (±1ºC) Sumergir 20 minutos los preparados en HCl 0.2N a temperatura ambiente. Enjuagar en Agua destilada 3 minutos. Sumergir los preparados en el Buffer de Pretratamiento a 71ºC durante 30 minutos. Sumergir los vidrios en 2 baches sucesivos de 2XSSC, 5 minutos en cada uno. Enjuagar brevemente en agua destilada. Sumergir los preparados en la solución de Pepsina durante 7 a 15 minutos. Enjuagar la pepsina sumergiendo los preparados en 2 baches sucesivos de H2O, 3 minutos en cada uno. Deshidratar en Etanol 70, 90 y 100% 2 minutos en cada uno. Dejar secar completamente. Co-desnaturalización: Preparación de la sonda: Descongelar la sonda, homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Atemperar el buffer de hibridación En un tubo de PCR agregar: 7µl de Buffer de hibridación 1µl de sonda Homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente
5 Revelado Co-desnaturalización: Sobre el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar (los 8µl preparados hibridan una región aproximada de 22x22mm). Agregar la solución de sonda sobre la región marcada Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado Sellar los bordes del cubreobjetos con cemento de contacto removible Colocar el portaobjetos así montado sobre una superficie caliente (hibridizador, plancha termostática, etc.). En ocasiones es conveniente colocar una gota de agua sobre la placa calefactora y luego colocar sobre ésta el portaobjetos montado, de esta forma se logra una película de agua entre el portaobjetos y la superficie caliente optimizando la transferencia de temperatura. Calentar a 71ºC durante 8 a 15 minutos. Colocar en cámara húmeda, incubar a 37ºC toda la noche. Pasos previos Por lo menos 30 minutos antes, calentar la solución de enjuague 1 a 71ºC (±1ºC) corroborando con un termómetro calibrado la temperatura dentro del recipiente. Atemperar la solución de enjuague 2 a temperatura ambiente. Atemperar la solución de contracolorante previamente preparada (ver protocolo adjunto) a temperatura ambiente. Enjuague del exceso de sonda Extraer el portaobjetos de la cámara húmeda. Quitar cuidadosamente el cemento de contacto. Sumergir el portaobjetos en una solución de 2XSSC a temperatura ambiente hasta que el cubreobjetos se desprenda (2 a 5 minutos). Sumergir el portaobjetos en el enjuague 1 durante 2 minutos exactamente. Sumergir el portaobjetos en el enjuague 2 un mínimo de 1 minuto. Drenar totalmente el exceso de líquido. Colocar sobre la región hibridada una gota (aprox. 20µl) de contracolorante. Agregar un cubreobjetos de tamaño mayor a la región hibridada. Drenar el exceso de contracolorante presionando suave y uniformemente con papel absorbente. Eliminar posibles burbujas de aire presionando suavemente con la punta de un tip. La reacción está lista para ser analizada.
6 Protocolo Resumido: Paso Tiempo Desparafinado (Opcional) Incubación a 58ºC Mínimo 30 Buffer Desparafinado 90º Etanol 100% x2 3 Dejar secar /// Pretratamiento HCl 0.2N 20 H2O 3 Buffer Pretratamiento 71ºC 30 2xSSC x2 5 Enjuagar brevemente en agua /// Pepsina 37ºC 7-15 H2O X2 3 Etanol 70, 90, 100% 2 Dejar secar /// Codesnaturalización-Hibridación Co-desnat 71ºC 8-15 Hibridación 37ºC Aprox. 18hs Revelado Enjuague 1 71ºC 2 Enjuague 2 Tº Amb Mínimo 1 Montado con Sn. Montaje ///
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