DETERMINACIÓN DE TOXINA PARALIZANTE DE MOLUSCOS BIVALVOS (VPM) Método HPLC, MANUAL ON HARMFUL MARINE MICROALGAE

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1 PRT Página 1 de 7 1. OBJETIVO Separar, identificar y cuantificar las toxinas principales del grupo de toxinas paralizantes. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este procedimiento es aplicable a moluscos bivalvos, univalvos, crustáceos al estado fresco, congelado o procesado. 3. FUNDAMENTO Se basa en la extracción ácida de la toxina y posterior análisis por cromatografía líquida de alta presión con derivatización post columna, provisto de detector de fluorescencia. 4. REFERENCIAS 4.1 Oshima: Manual on harmful marine Microalgae p UNESCO. 5. TERMINOLOGÍA 5.1 HPLC: cromatografía líquida de alta resolución. 5.2 Saxitoxina (STX): toxina paralizante más estudiada y conocida. 5.3 Gonyautoxinas (GTX): toxinas paralizantes, se conocen 5 GTXs. 5.4 VPM: veneno paralizante de moluscos bivalvos.

2 PRT Página 2 de 7 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES E INSUMOS Jeringa de vidrio o plástico desechable de 5 ml con dispositivo para filtración de muestras y estándares Membrana filtrante Millipore GVWP de 0.22 um, para la fase móvil Membrana filtrante Millipore GVWP de 0.22 um para muestras Columna HPLC C-8, 250mm * 4,6 mm * 5 um Columna Sep-Pak C Tubos Eppendorf. 6.2 REACTIVOS Solución tetrabutil amonio fosfato: Solubilizar 8.45 g (P.M ) en 50 ml (500 mm) Solución 1-heptenosulfonato de sodio (C 7 H I5 0 3 SNa) 100 mm: Solubilizar 2.02 g (P.M ) en 100 ml de agua. Guardar en refrigerador Ácido acético 50 mm: Tomar 5,75 ml de ácido acético glacial y aforar a 2 L con agua Ácido fosfórico (ácido orto-fosfórico) 500 mm: Solubilizar 28.8 g (P.M. 98.0) y diluir a 500 ml con agua Solución hidróxido de amonio 1 N: Diluir 1 volumen (25 %) con 13 volúmenes de agua Ácido periódico 350 mm: Solubilizar 7.98 g (HI0 4 x 2H 2 0 P.M ) en 100 ml de agua Solución fosfato dipotásico 250 mm: Solubilizar g de K2HP04 (P.M ) o 28.5 g de K2HP04 x 3H20 (P.M ) en 500 ml de agua Solución de hidróxido de potasio 1 N: Solubilizar 5.6 g de KOH en 100 ml de agua Fase móvil: Para saxitoxina y neosaxitoxina: 2 mm heptenosulfonato en 30 mm fosfato de amonio buffer ph 7.1: acetonitrilo (100+4) Diluir 10 ml de la solución stock (6.2.2) y 30 ml de (6.2.4) en 440 ml de agua. Ajustar a ph 7.1 con solución (6.2.5) y llevar a 500 ml, mezclar y desgasificar por sonicación. Posteriormente preparar la fase móvil con acetonitrilo (100+4)

3 PRT Página 3 de Para C1 - C4: 2 mm tetrabutyl amonio en buffer acetato ph 6.0. Tomar 2 ml de solución stock (6.2.1) y agregar a 450 ml de agua filtrada. Ajustar a ph 5.8 con solución de ácido acético (6.2.3). Llevar a 500 ml con agua filtrada Para gonyautoxinas 1-6: 2 mm heptenosulfonato en 10 mm buffer fosfato de amonio ph 7.1. Diluir 10 ml de las soluciones (6.2.2) y (6.2.4) en 450 ml de agua. Elevar el ph a 7.1 con solución de hidróxido de amonio (6.2.5) (aprox. 9 ml) y enrasar a 500 ml con agua. Guardar en refrigerador Reactivo oxidante: 7.0 mm ácido periódico en 10 mm buffer fosfato de potasio ph 9.0. Tomar 10 ml de solución stock (6.2.6) y 100 ml de (6.2.7) y llevar a 300 ml con agua. Ajustar a ph 9.0 con solución (6.2.8), aforar a 500 ml con agua filtrada. Guardar en refrigerador Reactivo acidificante: 500 mm de ácido acético. Preparar agregando ml de ácido acético glacial más 972 ml de agua desionizada y filtrada Acetonitrilo 25 % y 50 % Solución estándar de: saxitoxina, neosaxitoxina, gonyautoxina I a IV Solución de trabajo: preparar curva entre 0.3 y 4 um en ácido acético 0.05 N y guardar a temperatura <40 C hasta su uso Al preparar una solución agregar los reactivos al agua para que estos no precipiten. 6.3 EQUIPOS Balanza de precisión de 0.1 g Centrífuga para tubos, capaz de alcanzar rpm Equipo para la filtración de solventes Cromatógrafo líquido de alta resolución con detector de fluorescencia Bomba de doble cabezal Pickering, para derivatización post columna.

4 PRT Página 4 de 7 7. DESARROLLO 7.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Usar al menos 10 a 12 ejemplares por muestra Limpiar las valvas con abundante agua fresca Abrir las valvas cortando el músculo aductor.} Enjuagar el interior con agua fresca para remover la arena u otro material extraño Remover la carne de la concha por separación del músculo aductor y tejido conectado a la bisagra Abrir minimizando el daño al cuerpo del molusco Colectar g de carne Drenar sobre malla 10 por 5 minutos y descartar los restos de concha y líquido Homogeneizar en juguera a alta velocidad por segundos. 7.2 EXTRACCIÓN Pesar 100 g de muestra homogeneizada en un vaso Agregar 100 ml de HCl 0.1 N y mezclar Ajustar el ph si es necesario entre 2 y 4 preferentemente ph 3 con NaOH 0.1 N o HCl 5N agitando constantemente Calentar a ebullición suave por 5 min bajo campana de extracción. Verificar la temperatura Cubrir el vaso con vidrio reloj o equivalente para evitar la evaporación excesiva Enfriar en baño de hielo a temperatura ambiente Ajustar el ph entre 2 y 4 si es necesario Transferir el extracto a probeta y ajustar el volumen a 200 ml con HCl N Volver el extracto al vaso y dejar sedimentar, o centrifugar una alícuota en tubo a rpm por 5 a 10 minutos si fuese necesario.

5 PRT Página 5 de DETERMINACIÓN Primero activar la columna sep-pak C- 18 usando una jeringa desechable, sucesivamente con 10 ml de metanol, 10 ml de aire, 10 ml de agua desionizada y filtrada, 10 ml de aire y finalmente 2 ml de muestra con jeringa de 3 ml Recolectar 0.5 ml en tubo y mientras se trabaje debe mantenerse en hielo. (El seppak puede usarse 7 veces siempre que se limpie de la misma forma y se guarde en refrigeración) Condiciones cromatográficas Flujo de la fase móvil: 0.8 ml/min Flujo oxidante: 0.4 ml/min Flujo acidificante: 0.4 ml/min Excitación 330 nm y Emisión 390 nm Temperatura del baño: 65 C Purgar oxidante y acidificante: extraer con jeringa aproximadamente 5 ml de cada uno Verificar que el líquido de desecho salga ácido Estabilizar por 15 minutos Inyectar 10 ul de la muestra Todas las soluciones de reactivos deben sonicarse Limpiar la jeringa y el inyector con agua después de cada inyección Al final del trabajo o cuando se cambie de fase móvil, lavar la columna consecutivamente con: acetonitrilo 25 %, acetonitrilo 50 % y acetonitrilo 25 % por 15 min cada vez.

6 PRT Página 6 de EXPRESIÓN DE RESULTADOS Si se tiene antecedentes del bioensayo proceder de la siguiente forma, según el tiempo de muerte: entre 4 y 7 min: diluir 1: 10 entre 3.1 y 3.9 min: diluir 1:20 entre 2.1 y 3 min: diluir 1:50 menos de 2 min: diluir 1: Calcular la concentración de cada toxina usando estándar externo. Si x Am x Vf x D C (ng/100 g) = As x Vmi Donde: C : Concentración de toxina Si : ng de estándar inyectado As : Área del estándar Am : Área de la muestra Vmi : Volumen de muestra inyectado, en ml Vf : Volumen final del extracto, en ml D : factor de dilución Obtener la concentración total como suma de todas las toxinas 8. REGISTROS Identificación del registro RG Registro de series de cromatogramas HPLC Lachrom Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Laboratorio Toxinas Papel 5 años y Marinas y disposición en Micotoxinas basura normal Acceso restringido a funcionarios de la Sección

7 PRT Página 7 de 7 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Motivo del cambio Fecha Aprobación Modificada 4 1 Reordenamiento de frase según 10/07/2008 modelo 4 1 Cambio de características de 10/07/2008 centrífuga 4 2 Generalización de HPLC 10/07/2008 requerido 4 2 Corrección de información de 10/07/2008 columna cromatográfica, de 150 a 250 mm de largo 4 2 Remoción de información de 10/07/2008 características de método cromatográfico (Longitud de onda y volumen de inyección) de punto 6.1 Materiales y equipos 4 2 Se agrega materiales, columnas 10/07/2008 sep-pak y tubos Eppendorf 4 3 Se agrega información sobre condiciones de centrífuga 10/07/ ANEXO No Aplica