COMMISSIONE TECNICA SSOG

Transcripción

1 COMMISSIONE TECNICA SSOG SOTTOCOMMISSIONE OLI VEGETALI Metodo in inchiesta pubblica Determinación de los biofenoles de los aceites de oliva mediante HPLC. Derivados naturales u oxidados de la oleuropeína y del ligustrósido, lignanos, flavonoides y ácidos fenólicos. 1 OBJETIVO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN La presente norma describe un procedimento para la extracción y la cuantificación de los componentes menores polares de naturaleza biofenólica (BMP), como los derivados naturales u oxidados de la oleuropeína y del ligustrósido, los lignanos, los flavonoides y los ácidos fenólicos presentes en el aceite de oliva, utilizando la técnica HPLC. El campo de medición va de 30 mg/kg a 800 mg/kg. ADVERTENCIA: la aplicación de la presente norma puede requerir el uso de aparatos y sustancias peligrosos o la ejecución de operaciones que conlleven un cierto riesgo. La presente norma internacional no prevé todos los problemas de seguridad relacionados con la aplicación de la misma, por lo cual será el usuario el responsable de definir los procedimientos de seguridad e higiene pertinentes y de cumplir la legislación vigente. 2 PRINCIPIO El método se basa en la extracción de los componentes menores polares de naturaleza biofenólica directamente a partir del aceite de oliva mediante una solución metanólica y su posterior cuantificación mediante HPLC con revelador UV a 280 nm, utilizando ácido siríngico como patrón interno. El contenido en derivados naturales u oxidados de la oleuropeína y del ligustrósido, de los lignanos, de los flavonoides y de los ácidos fenólicos se expresa en mg/kg de tirosol. 3 APARATOS 3.1 Cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC), con gradiente ternario, provisto de columna (4,6 mm x 25 cm) de fase inversa C18, de tipo Spherisorb ODS-2 5µm, 100 A, equipado con revelador espectrofotométrico UV a 280 nm e integrador. Temperatura ambiente. El registro de los espectros con vistas a su identificación se realiza con ayuda de un revelador de fotodiodos con intervalos de adquisición entre 200 nm y 400 nm. 3.2 Matraces de 10 ml y 100 ml Clase A. 3.3 Pipeta electrónica de 100 µl y de 5000 µl. 3.4 Probeta con tapón roscado de 10 ml.

2 3.5 Agitatodor para probetas Embudo de vidrio para filtrado de unos 4 cm de diámetro. 3.7 Papel de filtro. 3.8 Baño de ultrasonidos. 3.9 Filtros de jeringa 13 mm tipo PVDF 0,45 µm Centrífuga con velocidad de centrifugación de r.p.m Balanza con precisión de ± 0,001 g Jeringa de plástico de 5 ml Cristalería normal de laboratorio. 4 REACTIVOS Reactivos puros para análisis cromatográfico HPLC. 4.1 Ácido ortofosfórico 85% (V/V). 4.2 Sulfato de sodio anhidro. 4.3 Metanol para cromatografía. 4.4 Acetonitrilo para cromatografía. 4.5 Agua para cromatografía. 4.6 Gradiente ternario lineal de elución: agua 0,2 % H 3 PO 4 (V/V) (A), metanol (B), acetonitrilo (C). Los solventes de elución han de desgasarse. La evolución del gradiente será la del siguiente esquema: Gradiente de elución Tiempo Flujo A B C min ml/min % % % 0 1, , , , , , , (4 - hidroxifenil) etanol (tirosol) 99,9%. 4.8 Ácido 3,5 dimetoxi 4- hidroxi benzoico (ácido siríngico) 100%. 1 tipo Vortex.

3 4.9 Solución para la extracción: metanol/agua 80/20 (V/V) Solución de los patrones externos de calibrado (tirosol y ácido siríngico). Pesar exactamente 0,030 g de tirosol (4.7) y 0,015 g de ácido siríngico (4.8) en un matraz aforado de 10 ml (3.2). Diluir a volumen con la solución de metanol/agua 80/20 (V/V) (4.9). Tomar 100 µl (3.3) de la solución y transferirla a un matraz aforado de 10 ml. Diluir a volumen con la solución de metanol/agua 80/20 (V/V). Las concentraciones de solución de calibrado externa son las siguientes: tirosol 0,030 mg/ml, ácido siríngico 0,015 mg/ml. Dicha solución se mantiene estable durante 3 meses en frigorífico a + 4 C Preparación de la solución de patrón interno (ácido siríngico). Pesar exactamente 0,015 g de ácido siríngico (4.8) en un matraz aforado de 10 ml y llevar a volumen con la solución de metanol/agua 80/20 (V/V). Tomar 1 ml (3.3) de la solución, trasferirlos a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con la misma solución de metanol/agua 80/20 (V/V). La concentración final es de 0,015 mg/ml. Dicha solución se mantiene estable durante 3 meses en frigorífero a + 4 C. 5 PROCEDIMIENTO Preparar un embudo (3.6) con papel de filtro (3.7) y añadir unos 20 g de sulfato de sodio (4.2). Filtrar unos 40 ml de aceite de oliva bien homogeneizado a través de la fase adsorbente de sulfato de sodio. Pesar exactamente 2,0 g de aceite de oliva anhidro en una probeta con tapón roscado de 10 ml (3.4). Transferir 1 ml de la solución de patrón interno (4.11) a la muestra previamente pesada. Cerrar con el tapón roscado y agitar durante 30 seg exactos (3.5). Añadir 5 ml de la solución de extracción constituida por metanol/agua 80/20 (V/V) (4.9). Agitar (3.5) durante 1 min exacto. Extraer en baño de ultrasonidos (3.8) durante 15 min a temperatura ambiente. Centrifugar a r.p.m. durante 25 min (3.10). Tomar una alícuota del sobrenadante y filtrar en jeringa de plástico de 5 ml (3.12), con filtro de PVDF de 0,45 µm (3.9). El espectrofotómetro UV se ha de encender al menos 1 hora antes del análisis. La columna cromatográfica debe acondicionarse durante al menos 15 min con el solvente de elución de composición inicial (agua 0,2 % H 3 PO 4 (V/V) /metanol/acetonitrilo 96/2/2 (V/V/V)) (esquema). Es preciso hacer una primera prueba cromatográfica sin gradiente (para asegurarse de que no se producen picos de interferencia por coelución), consistente en la inyección de 20 µl de metanol/agua 80/20 (V/V) en el sistema HPLC. Inyectar 20 µl de la solución de patrones externos de calibrado (4.10), registrando el cromatograma a 280 nm. Calcular los valores de los factores de respuesta RF correspondientes a 1 µg de tirosol y 1 µg de ácido siríngico. Calcular la relación entre el factor de respuesta del ácido siríngido respecto al tirosol, denominado RRF sir/tir. Apuntar los valores en un cuaderno destinado a tal efecto. Inyectar 20 µl de la solución final de la muestra en el sistema HPLC, registrando el cromatograma a 280 nm. Efectuar dos determinaciones independientes con la misma muestra y comprobar que los resultados están dentro de los parámetros de precisión del método. En la Figura 1 se presenta un trazado típico de los biofenoles de un aceite de oliva virgen extra desglosado por componentes.

4 Para determinar el contenido total han de sumarse las áreas de los distintos picos. Al final de la jornada, inyectar en la columna cromatográfica metanol/acetonitrilo 1/1 (V/V) con flujo de 1,0 ml/min durante un mínimo de 15 min y conservar la columna en metanol/acetonitrilo 1/1 (V/V). Figura 1 Cromatograma HPLC registrado a 280nm correspondiente a los biofenoles típicos presentes en un aceite de oliva virgen extra. 6 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS 6.1 Cálculo de los factores de respuesta de los patrones externos de calibrado (RF) RF 1µg (ácido siríngico) = Área acido siringico/ µg ácido siríngico inyectado RF 1µg (tirosol) = Área tirosol/ µg tirosol inyectado 6.2 Cálculo de la relación entre dos factores de respuesta (RRF) RRF sir/tir = RF 1 µg (ácido siríngico)/ RF 1 µg (tirosol) El valor de RRF sir/tir ha de ser constante y estar comprendido en el intervalo 5,1 ± 0,4; deberá permitir expresar el resultado final en tirosol, utilizando ácido siríngico como patrón interno. 6.3 Cálculo del contenido en biofenoles del aceite de oliva virgen El contenido en biofenoles (derivados naturales u oxidados de la oleuropeína y del ligustrósido, lignanos, flavonoides y ácidos fenólicos) expresado en mg/kg se calcula sumando las áreas de los distintos picos cromatográficos (Cuadro 1), mediante la siguiente fórmula, expresando el resultado sin decimales. (ΣA) 1000 RRF sir/tir (P ac.sir.) (mg/kg) =

5 (A ac. sir.) (P) siendo: (ΣA) A ac. sir. la suma de las áreas de los picos de los biofenoles (hidroxitirosol, tirosol, derivados naturales y oxidados de la oleuropeína y del ligustrósido, lignanos, flavonoides y ácidos fenólicos) registrados a 280 nm; el área del patrón interno ácido siríngico registrada a 280 nm; 1000 el factor utilizado para expresar el resultado en mg/kg; P RRF sir/tir P ac. sir. el peso en gramos de aceite utilizado; el coeficiente de mltiplicación para expresar los resultados finales en tirosol; el peso en miligramos de ácido siríngico utilizado como patrón interno en 1 ml de la solución añadida a la muestra. Cuadro 1: Identificación de los picos de los biofenoles, con indicación de los valores máximos de absorción (max UV abs) y los correspondientes tiempos de retención (RRT)*. Pico N. Biofenoles RRT* max UV abs. nm 1 Hidroxitirosol 0, Tirosol 0, Ácido vainíllico 0, Ácido cafeico 0, Ácido siríngico (patrón interno) 1, Vainillina 1, Ácido para-cumárico 1, Acetato de hidroxitirosol 1, Ácido ferúlico 1, Ácido orto-cumárico 1, ;11a Decarboximetil aglucona de la oleuropeína, forma dialdehídica oxidada 12 Decarboximetil aglucona de la oleuropeína, forma 1, dialdehídica 13 Oleuropeína 1, Aglucona de la oleuropeina, forma dialdehídica 1, Acetato de tirosil 1, ;16a Decarboximetil aglucona del ligustrósido, forma dialdehídica 1, oxidada 17 Decarboximetil aglucona del ligustrósido, forma dialdehídica 1, Pinoresinol, 1acetoxi-pinoresinol 1, Ácido cinámico 1, Aglucona del ligustrósido, forma dialdehídica 1, ;21a;21b Aglucona de la oleuropeína, forma aldehídica e hidroxílica oxidada Luteolina 1, Aglucona de la oleuropeína, forma aldehídica e hidroxílica 1, ;24a;24b Aglucona del ligustrósido, forma aldehídica e hidroxílica oxidada Apigenina 1, Metil-luteolina Aglucona del ligustrósido forma aldehídica e hidroxílica 2, (*) El valor del tiempo de retención se calcula respecto al tiempo de retención del ácido siríngico. La identificación se ha realizado para HPLC-MS.

6 7 PRECISIONES El ensayo colaborativo ha sido realizado por 9 laboratorios. El experimento se ha efectuado con 5 muestras de aceite: 1 Aceite de oliva virgen extra 2 Aceite de oliva virgen extra 3 Aceite de oliva virgen extra 4 Aceite de oliva virgen extra 5 Aceite de oliva virgen extra El análisis estadístico de los resultados del ensayo colaborativo se ha realizado según lo estipulado en la Norma Internacional ISO 5725; el examen de los valores aberrantes (outliers) se ha realizado aplicando el test de Cochran y el test de Grubbs a los resultados de los laboratorios para todas las determinaciones y muestras. Los márgenes de precisión correspondientes al contenido total de biofenoles en mg/kg se presentan en el Cuadro 2 y la Figura 2. Cuadro 2: Contenido en peso mg/1000 g de los biofenoles totales media n outliers r Sr RSDr (%) Hor 0,7 0,6 0,3 0,4 0,3 R SR RSDR (%) HoR 1,3 0,8 0,6 1,1 1,4 Leyenda: n outliers media r Sr RSDr R SR RSDR Hor HoR número de laboratorios participantes en el ensayo, excluyendo los outliers (laboratorios con resultados aberrantes); número de laboratorios con resultados aberrantes; media de los resultados aceptados; repetibilidad; desviación estándar de la repetibilidad; coeficiente de variación de la repetibilidad (Sr 100 / media); reproducibilidad; desviación estándar de la reproducibilidad; coeficiente de variación de la reproducibilidad (SR 100 / media). valor de HORRAT para la repetibilidad, igual al valor de la relación RSDr observado/rsdr calculado con la ecuación de Horwitz suponiendo que r = 0,66R; valor de HORRAT para la reproducibilidad, igual al valor de la relación RSDR observado/rsdr calculado con la ecuación de Horwitz. 7.1 Repetibilidad, r La diferencia entre dos resultados de ensayo obtenidos por un mismo operador, con los mismos aparatos y en condiciones operativas constantes, con el mismo material de ensayo, utilizando el presente método de forma normal y correcta, resulta superior a los valores indicados en el Cuadro 2 y la Figura 2, en un solo caso de veinte. r = 5,7 Ln (x) 16,5 siendo:

7 x la media de los resultados a comparar. 7.2 Reproducibilidad, R La diferencia entre dos resultados independientes, obtenidos por distintos operadores, en laboratorios distintos, con el mismo material de ensayo, utilizando el presente método de forma normal y correcta, resulta superior a los valores indicados en el Cuadro 2 y la Figura 2 en un solo caso de veinte. R = 20,2 e 0,0028x siendo: x la media de los dos resultados a comparar. Figura 2: Representación gráfica de los márgenes de precisión correspondientes al contenido total (mg/kg) de biofenoles (Cuadro 2) Y A 40 B X Leyenda: X contenido medio en mg/kg de biofenoles totales tras las dos determinaciones Y diferencia de contenido en mg/kg de biofenoles totales entre las dos determinaciones A representación gráfica de los valores de la reproducibilidad B representación gráfica de los valores de la repetibilidad 8 INFORME DE ENSAYO En el informe de ensayo deberá constar la siguiente información: a) Referencia a la presente norma. b) Resultados de ensayo expresados en mg/kg de aceite (sin decimales). c) Valor de RRF utilizado para el cálculo. d) Toda desviación respecto de la presente norma resultante de un acuerdo entre las partes o por otras circunstancias. e) Datos de reconocimiento del laboratorio, fecha de realización y firma del responsable.