METODOLOGÍAS PARA OPTIMIZAR LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE ARGÁN (Argania spinosa, L.) Skeels. Realizado por: Mohammed Naji Hafiane
Índice: Introducción Objetivo Materiales y métodos Resultados y discusión Conclusiones 2
Introducción: Qué es el argán? El argán, Argania spinosa (L.) Skeels, es una especie forestal endémica de la zona suroeste de Marruecos (especialmente el Souss) en las zonas áridas. Es una de las especies forestales más originales del África del norte por su interés botánico y sus múltiples usos de carácter socio-económico. 3
Introducción: Descripción botánica: El argán es un árbol robusto con longevidad de más 100 años, de gran talla con tronco corto. Hojas verdes perennes y alternas son pálidas sobre sus caras inferiores. Flores amarillas verdosas monoicas, florecen en primavera, cinco sépalos pilosos y cinco pétalos verdosos. los frutos son falsas drupas rayadas en rojo, tiene frecuentemente un solo núcleo. la cascara es gruesa, dura y muy lisa de color marrón pálido 4
Características ecológicas: Introducción: El argán puede soportar unas temperaturas desde 3 hasta 50 ºc y conformarse con una baja precipitación. Se desarrolla en altitudes de nivel 0 hasta 1500 m sobre las laderas sur y hasta 700 m sobre las laderas norte de montañas. Se adapta muy bien a las condiciones de aridez del medio. Producción agrícola significativa en condiciones climáticas difíciles 5
Introducción: Qué es el Test de tetrazolio? La prueba con la sal de cloruro de 2,3,5 trifenil de tetrazolio (TTC): Aporta resultados más rápidos y completos que los proporcionados por la prueba de germinación. Proporciona un índice de vigor Revela las causas de la debilidad de la semilla, como daños mecánicos, deterioro del campo y almacenamiento, daño por parásitos (chinches) y por calor o heladas. 6
Introducción: Qué es el Test de tetrazolio? 7
Introducción: Cultivo in vitro de tejidos El cultivo in vitro, se basa en el desarrollo sobre un medio de cultivo, dentro de un recipiente, normalmente de vidrio, de parte o la totalidad de una planta en base a la totipotencia de la célula vegetal. Debe realizarse en condiciones estériles y aisladas. SEMILLAS Eliminación de dormancias Mecánica (por eliminación de la cubierta leñosa) Olivo Argán Cerezo 8
Introducción: Cultivo in vitro de tejidos Química (por adición al medio de sustancias inhibidoras) ácido giberélico (GA3) GA 3 9
Objetivo: El objetivo principal de este trabajo, es la optimización de sistemas de germinación de semillas de la especie Argania spinosa. Dentro de este objetivo general, se incidirá en semillas de plantas seleccionadas que se someterán a germinación tanto en sustratos tradicionales, como en condiciones in vitro. En ambos casos, se ensayará la eliminación del endocarpo leñoso, del endospermo obteniéndose el embrión aislado y diferentes condiciones de luz. En el presente trabajo se realizará el estudio de los efectos de diferentes intensidades y franja de emisión de luces LED, usando mezclas de LEDs mono cromáticos azules y rojos y además de adición de LEDs blancos, sobre la germinación de semillas y embriones cigóticos de argán y posterior desarrollo de las plantas cultivadas in vitro. 10
Materiales y métodos: Materia vegetal Las semillas provienen del sur de Marruecos en la región de Agadir Tiznit (coordenadas: 29 42 00 N 9 43 37 O). Durante el periodo comprendido entre julio-agosto del año 2017(Lote 1) y también del año 2018(Lote 2). Lote 1 Lote 2 11
Materiales y métodos: Materia vegetal Las semillas provienen del sur de Marruecos en la región de Agadir Tiznit (coordenadas: 29 42 00 N 9 43 37 O). Durante el periodo comprendido entre julio-agosto del año 2017(Lote 1) y también del año 2018(Lote 2) 12
Materiales y métodos: Protocolo experimental Viabilidad de la semilla: Tratamiento con sales de tetrazolio. Se han preparado una concentraciones (TTC): 0.1% (100 mg en 100 ml de agua destilada) Tiempo de imbibición 90 minutos. El protocolo final se describe a continuación: 1.- Imbibición de semillas (Lote 1 y Lote2)en agua durante 24 horas. 2.- La solución del TTC se conserva en frascos de cristal topacio y en oscuridad al ser fotosensibles. 13
Materiales y métodos: Protocolo experimental Viabilidad de la semilla 3.- Incluir semillas en soluciones TTC. Mantener en estufa a 35ºC. 4.- Extraer las semillas a los 90 minutos. Lavar con agua corriente y mantenerlas sumergidas para evitar la deshidratación hasta su evaluación. 5.- Separar ambos cotiledones. 6.- Observar a la lupa binocular el grado de tinción de las semillas. 7.- Se han ensayado dos situaciones: a)semillas con cubierta externa. b)semillas desprovistas de esta cubierta. 14
Materiales y métodos: Protocolo experimental Viabilidad de la semilla Los controles del grado de tinción se han efectuado de visu con el siguiente criterio cualitativo: 1: poco teñido (<25% de tinción). 2: medianamente teñido (25% -50% de tinción). 3: bastante teñido (50%-75% de tinción). 4: completamente teñido (>75%). 15
Materiales y métodos: Protocolo experimental Viabilidad de la semilla Semillas sin cubierta Diseño experimental Al pasar 24h sumergidas en agua se le han eliminado las envueltas. Para corroborar la viabilidad de las semillas tras el tratamiento con TCC se llevan las 50 semillas del Lote 1 y otras 50 del Lote 2, a una bandeja de alveolos con 50% turba+50% perlita. 16
Materiales y métodos: Protocolo experimental Viabilidad de la semilla Semillas sin cubierta Diseño experimental Al pasar 24h sumergidas en agua se le han eliminado las envueltas. Para corroborar la viabilidad de las semillas tras el tratamiento con TCC se llevan las 50 semillas del Lote 1 y otras 50 del Lote 2, a una bandeja de alveolos con 50% turba+50% perlita. 17
Materiales y métodos: Protocolo experimental Germinación ex vitro Pretratamientos de semillas 18
Materiales y métodos: Protocolo experimental Germinación ex vitro Siembra de semillas 240 semillas --120por cada lote Semillas Lote 2 Semillas Lote 2 Semillas Lote 1 Semillas Lote 1 Turba 100%, Turba 75% + perlita 25%, Turba 50% + perlita 50%, Turba 25% + perlita 75%, Perlita 100%, Vacío 19
Materiales y métodos: Protocolo experimental Germinación ex vitro Siembra de semillas Cámara de cultivo (111 µe m -2 s -1 de intensidad luminosa y 16 horas de fotoperiodo) la temperatura 24±1ºC. 20
Materiales y métodos: Protocolo experimental Germinación in vitro Las semillas han sido despulpadas. 21
Materiales y métodos: Protocolo experimental Germinación in vitro Desinfección de almendras la cámara de flujo TELSTAR AH-100 Tratamiento con etanol absoluto durante 3 min. Inmersión en hipoclorito sódico al 60%+ gotas de mojante Tween-20, durante 5 min,con agitación 3 Lavado de semillas con agua estéril durante 5 min. Cada uno 22
Materiales y métodos: Protocolo experimental Germinación in vitro Germinación de almendras in vitro 96 semillas(48l1,48l2) en tubos de cristal +10 cmᶟ de MS/3 la cámara de flujo TELSTAR AH-100 Cámara de cultivo (iluminación LEDs blanca, intensidad lumínica de 2.7 Klux ), 18 horas de fotoperiodo y 24±1ºC de temperatura. Distribución : L1=L2 MS/3 Sin GA3 = MS/3 con GA3. 8 tubos LEDs B. 8 tubos LEDS 66% B + 33% R. 8 tubos LEDs 25% Az + 75% R. 23
Materiales y métodos: Protocolo experimental Germinación in vitro Germinación de embriones in vitro Hidratación durante 48 h + eliminación de la envolturas la cámara de flujo TELSTAR AH-100 144 semillas(72l1, 72L2) en tubos de cristal +10 cmᶟ de MS/3 Cámara de cultivo (iluminación LEDs blanca, intensidad lumínica de 2.7 Klux ), 18 horas de fotoperiodo y 24±1ºC de temperatura. Distribución : L1=L2 MS/3 Sin GA3 = MS/3 con GA3. 12 tubos LEDs B. 12 tubos LEDS 66% B + 33% R. 12 tubos LEDs 25% Az + 75% R. 24
Materiales y métodos: Tratamientos estadísticos Para la conveniente interpretación de los datos obtenidos se ha usado el paquete estadístico informático IBM SPSS Statistics V.24 y 25, con el que se han calculado estimadores de centralización, dispersión y la comparación entre medias a través del cálculo ANOVA mediante test de Tuckey. La comparación entre porcentajes se ha efectuado usando la prueba z (t de Student), la corrección de Bonferroni, el test de Levene para comprobar la homogeneidad de las varianzas, el test de normalidad de Kolmogorov Smirnov y el test de Mann-Whitney del mismo paquete informático. 25
Resultados y discusión: Biometría de las semillas Peso por semilla completa 1.7 g Peso por semilla sin endocarpo 0.3 g Número de semillas por fruto 2-3 % del endocarpo en el peso total de la semilla 82 % Medidas de los ejes longitudinal de la semilla Con endocarpo 2-3 cm Sin endocarpo 1-2 cm Medidas de los ejes transversal de la semilla N= 10 Con endocarpo 1,2-1,8 cm Sin endocarpo 0,7-1 cm 26
Resultados y discusión: Viabilidad de la semilla Semillas sin cubierta Distribución de frecuencias (%) de los dos lotes de semillas en el ensayos de tinción con (TTC) de semillas desnudas de argán. Escala de tinción Frecuencia % (*) Lote 1 Lote 2 1 (poco teñido) 28 22 2 (medianamente teñido) 20 32 3 (bastante teñido) 32 18 4 (completamente teñido) 20 28 Grado de tinción Media (**) 2,44 2,52 D.S. 1,11 1,13 (*) La distribución de frecuencias de cada lote sigue una distribución normal según el test de Kolmogorov-Smirnov (p=0,000) y las distribuciones de frecuencias son similares según el ambos lotes según el test de Man-Whitney. (**) La diferencia de medias entre lotes son estadísticamente no significativas (p = 0.722) según la prueba t de muestras independientes 27
Resultados y discusión: Viabilidad de la semilla Semillas sin cubierta Distribución de frecuencias (%) de los dos lotes de semillas en el ensayos de tinción con (TTC) de semillas desnudas de argán. Escala de tinción Frecuencia % (*) Lote 1 Lote 2 1 (poco teñido) 28 22 2 (medianamente teñido) 20 32 3 (bastante teñido) 32 18 4 (completamente teñido) 20 28 Grado de tinción Media (**) 2,44 2,52 D.S. 1,11 1,13 (*) La distribución de frecuencias de cada lote sigue una distribución normal según el test de Kolmogorov-Smirnov (p=0,000) y las distribuciones de frecuencias son similares según el ambos lotes según el test de Man-Whitney. (**) La diferencia de medias entre lotes son estadísticamente no significativas (p = 0.722) según la prueba t de muestras independientes 28
Resultados y discusión: Viabilidad de la semilla Siembra de semillas TTC se llevaron 50 semillas de cada lote (Lote1 y Lote 2) a una bandeja de alveolos con una mezcla de 1:1 (Perlita: turba). La tasa de geminación: 0% de germinación. 29
Resultados y discusión: Germinación y desarrollo de plántulas ex vitro Germinación Germinación de semillas de argán en los diferentes tratamientos ensayados. Para los dos lotes. Tipo de sustrato Parámetros de germinación: 1,25% de germinación total (240 semilla) 2,5% Lote 1 0% Lote 2 El tipo de sustrato: Nº semillas sembradas Nº de semillas germinadas 12,5% : Turba 25% + perlita 75% Lote 1 Lote 2 Porcentaje de Nº de germinación/ semillas tratamiento germinadas Porcentaje de germinación/ tratamiento Turba 100% 24 0 0 0 0 Turba 75% + perlita 25% 24 0 0 0 0 Turba 50% + perlita 50% 24 0 0 0 0 Turba 25% + perlita 75% 24 3 12,5 0 0 perlita 100% 24 0 0 0 0 30
Resultados y discusión: Germinación y desarrollo de plántulas in vitro Germinación Evolución de la germinación in vitro de semillas de argán. Parámetro % 10 semilla Lote 2 MS/3 con GA3 Luz LED blanca Germinación 70 Necrosis apical 10 Cotiledón blanco 30 Cotiledón verde 20 3 yemas 30 < 3 yemas 0 Contaminación 10 Raíz 20 Supervivencia 100 31
Resultados y discusión: Germinación y desarrollo de plántulas in vitro Germinación Según la tabla 6. porcentaje final de cotiledones verdes del 27.08%. Supervivencia 36,5% de las semillas que desarrollan raíz. Contaminación media del 42,7%. Lote 1+ GA3 en condiciones lumínicas LED de 75% de luz roja y 25% de luz azul las que presentan mayor supervivencia (87,5%) ya que desarrollan más cotiledones verdes (37,5%) y raíz (50%). Desarrollo radicular con GA3 es de 16,67%, mientras en ausencia de GA3 es de 4,17%, con una media total de 10,4%. 32
Resultados y discusión: Germinación y desarrollo de plántulas in vitro Germinación Evolución de longitud media del tallo en dos lotes de semillas a diferentes regímenes lumínicos 33
Resultados y discusión: Germinación y desarrollo de plántulas in vitro Desarrollo de plántulas Desarrollo de radícula y tallo en plántulas de argán procedentes de la germinación de semillas. 34
Resultados y discusión: Germinación in vitro de embriones de argán. Germinación Los porcentajes de respuesta a la germinación in vitro de embriones de argán. Parámetros (%) Tratamientos Régimen lumínico GA 3 Supervivencia Cotiledón blanco Contaminación 66% B/33% R + 0 0 0 66% B/33% R - 0 0 20 LED blanco + 0 0 16,67 LED blanco - 0 0 9,09 75%R/25%A + 0 0 0 75%R/25%A - 9,09 9,09 0 35
Conclusiones: 1. La germinación ex vitro en bandejas de alveolos ofrece resultados muy bajos lo que confirma la conocida dificultad y heterogeneidad de este proceso descritas en la bibliografía para el argán. 2. Las semillas desnudas más jóvenes, un año de edad, cultivadas in vitro ofrecen mejores porcentajes de germinación. Aunque este factor no incide en el desarrollo posterior de la raíz de la plántula obtenida. 2. Las semillas desnudas tratadas con ácido giberélico (GA 3 ) no mejoran los resultados de germinación frente a las no tratadas. No obstante, el GA 3 sí mejora el desarrollo de la raíz de la plántula obtenida. 36
Conclusiones: 4. El tratamiento LED de 75%R/25%A, con baja intensidad lumínica, ofrece los mejores resultados en germinación, supervivencia y desarrollo de la plántula obtenida, tanto de la parte aérea como radicular. También este régimen lumínico es el que induce una mayor germinación in vitro de embriones aislados. 5. Las plántulas obtenidas presentan un desarrollo adecuado sin síntomas de necrosis apical ni hiperhidratación. 6. Los ensayos in vitro realizados mejoran la germinación de semillas de argán y el desarrollo posterior de la planta utilizando semillas desnudas muy jóvenes, mezclas de LEDs rojo y azul con baja intensidad y concurso de GA 3. Todo ello se considera muy beneficioso para la propagación de esta especie de gran interés tanto en ganadería, como en la obtención de aceite con gran interés alimentario y 37 terapéutico.
Gracias 38