Los Marcadores Moleculares y su aplicación en la agricultura moderna Dr. Luis Wong Vega Instituto de Innovación en Biotecnología e Industria (IIBI)
La biotecnología posee un impacto potencial significativo en la tarea de alimentar al planeta...
...To advance agricultural research into new technologies, including biotechnology...the use of tried and tested new technologies including biotechnology should be accomplished in a safe manner and adapted to local conditions to help improve agricultural productivity in developing countries. http://www.fao.org/worldfoodsummit/english /documents.htm
De qué manera puede ayudar la biotecnología a las personas afectadas por el hambre y la desnutrición? -Mejorando el rendimiento -Provocando menores costos de producción -Generando resistencia a enfermedades y a la sequía - Creando mayor valor nutricional - Garantizando calidad e inocuidad en los alimentos
Las modernas biotécnicas aplicadas a la agricultura están teniendo un fuerte impacto en la investigación y en la producción agrícola modernas, afectando también a fenómenos diversos como la comercialización, aspectos de salud pública y patentes y derechos de marca, entre otros...
APLICACIONES BÁSICAS DE LA BIOTECNOLOGÍA 1. productividad y estabilidad en áreas marginales degradadas 2. eficiencia en el uso del agua 3. manejo integrado de plagas y reducción del uso de plaguicidas 4. resistencia de los cultivos a las enfermedades 5. calidad nutricional
Las técnicas de los llamados Marcadores Moleculares van cobrando cada vez más un impacto significativo sobre diversos aspectos de las ciencias agropecuarias modernas...
Desde la prehistoria, el hombre ha seleccionado y mejorado especies vegetales, animales y microbianas basándose en el fenotipo.
Las mejoras genéticas eran posible gracias a la variabilidad genética, a la heredabilidad del carácter que se quería aislar, a la eficacia e intensidad de la selección aplicada, y al tiempo necesario para realizar un ciclo de selección.
Sin embargo, con estos métodos quedan muchos aspectos desconocidos, como son el número y efecto de los genes implicados en la expresión de un carácter, la localización de estos genes, y su función fisiológica.
Por otra parte, la taxonomía siempre ha estudiado características morfológicas, lo cual requiere observaciones muy exhaustivas de los organismos en diferentes estadios de desarrollo
Los criterios utilizados en la selección clásica carecen muy a menudo de definición y objetividad y, en cualquier caso, son marcadores ambiguos debido a las influencias ambientales.
Afortunadamente la aparición de los marcadores moleculares está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva.
Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético.
Las biomoléculas que pueden ser marcadores moleculares son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida).
Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequívocamente con un rasgo genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables).
Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos los organismos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan hipervariable.
Los primeros marcadores desarrollados a finales de los 70 se basaron en la identificación de proteínas e isoenzimas por electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida.
Con ellos se abrió el conocimiento de la estructura y heterogeneidad genética entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen geográfico.
Pero esta técnica tenía una limitación muy importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo entre variedades o especies próximas debido a que las proteínas son el resultado de la expresión génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente a otro, y de una época del año a otra.
Los avances de la tecnología del DNA recombinante han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificación de especies y variedades.
Los cromosomas, localizados en el núcleo de las células vegetales y animales, contienen las unidades de información que son transferidas de una generación a otra. Cada cromosoma contiene una larga y única molécula de ADN, además de proteínas que actúan en el empaquetamiento de esta molécula.
Las tecnologías de análisis molecular de la variabilidad del ADN y sus productos de expresión, permiten determinar puntos de referencia en los cromosomas, técnicamente denominados marcadores moleculares.
Las técnicas de biología molecular, basadas en el análisis de ácidos nucleicos (PCR, microsatélites, AFLP, etc.), permiten la incorporación de nuevas alternativas para acelerar los procesos de selección. De esta forma, es posible explorar aspectos teóricos y prácticos relacionados con la genética de plantas, mejoramiento y análisis de germoplasma.
La PCR (reacción en cadena de la polimerasa), descrita en 1988, es una de las técnicas esenciales para la preparación de huellas dactilares, si bien no vale para elaborar marcadores por sí sola.
La reacción básica de la PCR comienza con la desnaturalización del DNA molde para separar las cadenas, continúa con el alineamiento de un par de oligonucleótidos con su DNA molde, y termina con la polimerización para sintetizar un nuevo DNA entre los dos oligonucleótidos. De aquí se vuelve a la desnaturalización para comenzar un nuevo ciclo.
Hoy en día todo el proceso esta completamente automatizado en un aparato llamado Termociclador, y existe una batería de enzimas y condiciones que permiten polimerizar hasta 35 kpb sin errores, aunque las condiciones normales amplifican sin problemas fragmentos de 3 a 6 kpb de longitud.
El número de técnicas de marcadores moleculares descritas en la literatura científica es cada vez más numeroso, por lo que vamos a reunirlas en 3 categorías: RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción), MAAP (Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación) y STS (Sitios de secuencia etiquetada).
RFLP RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción). Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos
Los fragmentos más fáciles de analizar son los pequeños, derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular
En cambio, para moléculas de DNA de mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas específicas para visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a genes previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecíficas.
Aunque la RFLP evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros mapas genómicos basados en la distribución física de los genes en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se hicieron utilizando esta técnica.
Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP
Técnicas MAAP MAAP Término genérico acuñado en 1994 con el que se designan las técnicas que emplean oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas técnicas caben destacar...
RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar): Es una de las técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990. Se usa una colección de decanucleótidos para amplificar por PCR áreas específicas distribuídas al azar por el genoma. Su pequeñez y la baja temperatura de alineamiento (36 C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos fragmentos de DNA.
Estos fragmentos se pueden separar en geles de agarosa para obtener perfiles electroforéticos que variarán según el polimorfismo de los distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarán una huella dactilar característica.
Es una técnica muy cómoda, rápida, requiere poco DNA que además no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rápida y simultáneamente muchos organismos.
Sus inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algún carácter, sino redundante, y que no da información sobre el número de copias que el DNA genómico contiene de la secuencia amplificada.
Esta tecnología ha sido utilizada para la catalogación de frutos, selección de variedades, y diferenciación de líneas clonales. También se está utilizando para el análisis de las variedades de una serie de cultivos como el apio, uva, limón y olivo.
AP-PCR (PCR con oligonucleótidos arbitrarios): La idea es similar a la de la RAPD, desarrollándose a la vez que ésta, aunque se cambia el diseño de los oligonucleótidos y el tipo de PCR.
Los oligonucleótidos han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja astringencia (poco específicos) que permite la polimerización de una batería de fragmentos característicos de cada variedad
Esta fase va seguida de ciclos de alta astringencia para amplificar (visualizar) específicamente las bandas anteriores. Los fragmentos amplificados se pueden migrar en un gel de agarosa para observar las grandes diferencias entre especies, o bien se puede marcar radiactivamente y migrar en gel de poliacrilamida para obtener resultados mucho más finos y precisos.
Existe una variación denominada DAF (Huellas dactilares por amplificación de DNA) que utiliza oligonucleótidos de 5 a 15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difíciles de interpretar.
AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): Esta técnica se desarrolló en 1995 y combina el uso de enzimas de restricción y oligonucleótidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores moleculares muy específicos sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad
El DNA se corta con dos enzimas de restricción, una de corte muy frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas.y se amplifica por PCR. Jugando con la complementariedad del oligonucleótido con el sitio de restricción se puede disminuir o aumentar el número de bandas amplificadas.
Una ventaja especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola reacción. Por eso el resultado debe resolverse en un gel de poliacrilamida de alta resolución, puesto que no se resolverían en agarosa.
STS STS (Sitios etiquetados por la secuencia) o SSLP (Polimorfismo de longitud en las secuencias discretas) Desarrollada a partir de 1989, aprovecha las secuencias conocidas, únicas dentro del genoma, para amplificarlas por PCR.
Los STS (Sitios de secuencia etiquetada) son un término general dado a un marcador que se define por la ubicación exacta de su cebador y por el orden de las bases.
El polimorfismo se suele encontrar fácilmente cuando lo que se amplifican son intrones en lugar de exones. La ventaja principal es la velocidad con la que se pueden realizar los análisis una vez que las parejas de oligonucleótidos se han establecido claramente. Por tanto se combinan la rapidez de la RAPD con la especificidad de la RFLP
Por la manera en que se determinan los oligonucleótidos y por la forma de analizar los polimorfismos, estas técnicas STS han generado otras técnicas derivadas, altamente informativas pero bastante complejas.
Las aplicaciones de los marcadores moleculares son muy diversas y es de esperar que cada vez se les encuentren nuevos usos. Por ahora se vienen empleando en: la diferenciación de individuos, la discriminación entre clones, los análisis filogenéticos y taxonómicos,
el mapeo de genomas, la cuantificación de variabilidad génica intra e interespecífica, las mejoras genéticas, La detección de infecciones o propensión a sufrirlas, la localización de resistencia a enfermedades, y en la dispersión de especies.
Las Marcadores Moleculares son una herramienta fundamental en la protección nacional ante el nuevo entorno globalizado, dado que permiten, para dar unos ejemplos, cubrir funciones importantísimas tales como la detección de patógenos en bienes de consumo importados, la identificación de Organismos Genéticamente Modificados introducidos violando restricciones y controles,
Igualmente importante es el hecho de que los marcadores moleculares nos permiten tipificar de variedades y ostensiones vegetales que se desarrollan en el país, registrarlas y ponerlas bajo registro para su protección
La República Dominicana debe desarrollar sus capacidades científicotécnicas y contar con su propia unidad de marcadores moleculares, como salvaguarda de sus intereses nacionales estratégicos.
En el centro de Biotecnología vegetal del IIBI ya se están haciendo trabajos de marcadores moleculares en una diversidad de especies: Mango Aguacate Cítricos Arroz
Muchísimas Gracias