1 Tema 2. Métodos y fuentes de estudio. Técnicas de microscopía óptica y electrónica. Los métodos y fuentes de estudio de la Citología e Histología se basan en la observación, mediante instrumentos de aumento, de los tejidos animales. Los métodos de aumento son el microscopio óptico y el microscopio electrónico. Pero para que los tejidos animales puedan ser observados deben sufrir una serie de manipulaciones, que se conocen con el nombre de técnicas histológicas. Entre éstas últimas, merecen un capítulo aparte las técnicas inmunocitoquímicas aplicadas a la microscopía y óptica y electrónica. MICROSCOPÍA ÓPTICA La observación se consigue mediante lentes y el aumento máximo es de 1400 (en la práctica 1000), debido a que está limitado por el poder de resolución. El poder de resolución expresa la distancia mínima entre dos puntos para que sus imágenes aparezcan separadas. Por debajo de esta distancia, ambos puntos se verán como uno, independientemente de los aumentos. Mientras el del ojo humano es de 0.2 mm (200 µm), el del microscopio óptico es 0.25 µm (0.00025 mm). 1 mm= 1000 µm (micrómetros) 1 µm= 1000 nm (nanómetros) Tipos de microscopios ópticos: - Convencional: es el de uso habitual en los estudios histológicos. La diferenciación de los objetos observados se debe a las diferencias de la amplitud de la onda lumínica que los ha atravesado como consecuencia de la absorción natural o provocada por una coloración apropiada. Como los tejidos y células son transparentes es necesario colorearlos, ya que las distintas estructuras tienen distinta apetencia por los colorantes. - Contraste de fases: convierte las variaciones de fase en variaciones de amplitud y las hace perceptibles para el ojo. Se pueden observar por este
método objetos transparentes que no difieren en sus estructuras más que por
2 variaciones de grosor o por variaciones de índice entre ellas y el medio. Permite el estudio de células y tejidos vivos sin ser sometidos a las manipulaciones necesarias para tefiirlas, y de esta manera, también permite comprobar los artefactos o diferencias existentes entre el aspecto de los tejidos procesados con su estado natural. - Fluorescencia: permite la observación de sustancias fluorescente cuando son iluminadas con una luz de una longitud de onda determinada. - Luz polarizada: informa sobre las propiedades ópticas de las estructuras atendiendo a su birrefringencia, permitiendo determinar la naturaleza química del objeto. La birrefringencia es la capacidad de un objeto de restablecer parcialmente la luz al colocarlo entre dos polarizadores. Se utiliza sobre todo para el estudio de minerales y materiales duros (hueso). - Confocal: utiliza rayos laser y permite evidenciar la estructura celular por planos y hacer reconstrucciones tridimensionales de los tejidos. Técnicas histológicas para microscopía óptica Las técnicas histológicas se definen como la secuencia de manipulaciones a la que deben someterse los tejidos para su observación microscópica, para que éstos conserven la forma más exacta posible a la estructura real en vivo. Para el estudio de las técnicas histológicas es necesario conocer una serie de conceptos: Artefactos: alteraciones que dan lugar a imágenes no reales de un tejido viviente. Para conocerlas es aconsejable realizar tinciones vitales como control. Estudios vitales: son aquellos que se realizan a partir de células o tejidos vivos sin que éstos hayan sido separados del ser que los contiene, como por ejemplo la microcirculación sanguínea sobre un lecho capilar traslúcido.
3 Estudios supravitales: se realizan sobre células o tejidos vivos, pero separados del organismo del que proceden. Se mantienen vivos mediante técnicas de cultivo in vitro. Para teñir las células se utilizan colorantes que aunque tóxicos tienen cierta compatibilidad con el metabolismo de las células como el azul trypán o el azul de metileno. Estudios postvitales: todos aquellos que se realizan sobre células muertas en estado natural (no fijadas). Extensión citológica: es un conjunto de células independientes procedente de un tejido y extendidas sobre un portaobjetos en forma de capa unicelular que permite su observación microscópica. Frotis: extensión citológica correspondiente a sangre. Impronta: capa unicelular obtenida por contacto con el portaobjetos de un órgano donde las uniones intercelulares y con las estructuras tisulares son débiles (como órganos hematopoyéticos: ganglios, bazo, médula ósea, etc.). Preparación histológica: es un fragmento de tejido que está dispuesto para su observación. Se trata de una porción de escaso grosor (3-4 µm) obtenida mediante un microtomo a partir de un bloque o masa de tejido incluido en un medio de homogenización (habitualmente parafina) y coloreado a tal fin. Generalmente, la lámina se encuentra adherida a un portaobjetos mediante un pegamento y cubierta por un cubreobjetos. El conjunto de manipulaciones y métodos que tienen por objeto la confección de las preparaciones histológicas recibe el nombre de procesamiento histológico de los tejidos y comprende los pasos de: toma de muestras, fijación, tallado, inclusión, corte, tinción y montaje. 1.-Toma de muestras Las muestras pueden proceder de necropsias y biopsias. Si proceden de una necropsia el animal debe estar recién muerto, no debemos utilizar muestras de
4 animales muertos varias horas (pues comienza la autólisis y putrefacción), ni congelados para su mantenimiento (pues se forman cristales en el interior de las células de gran tamafio y al descongelar se produce la rotura de las mismas, con la consiguiente alteración de la estructura a observar). En estudios experimentales, y sobre todo para microscopía electrónica, se puede recurrir a la perfusión de los animales, que consiste en la sustitución de la sangre por un líquido fijador, en el momento del sacrificio, comenzando en ese instante la fijación de los tejidos. 2.- Fijación El objetivo de la misma es interrumpir los procesos de degradación que aparecen tras la muerte celular para conservar la arquitectura y composición celular en un estado lo más próximo a su estado vivo. Los procesos de degradación son la autólisis o autodigestión celular enzimática por la liberación del contenido de los lisosomas y la putrefacción que se produce por el efecto de toxinas y enzimas bacterianos. Existen diferentes métodos de fijación. Entre los métodos físicos destaca la congelación, que permite la detención de los procesos de autólisis y el endurecimiento de las piezas para las manipulaciones posteriores. Las ventajas de este tipo de fijación son la rapidez en la obtención de las muestras y la conservación de sustancias, enzimas o epítopos antigénicos que son eliminados o destruidos mediante el uso de otros métodos de fijación y la posterior inclusión. Entre los métodos químicos existen numerosas sustancias, siendo la más habitual el formol que actúa provocando la desnaturalización de las proteínas al romper los puentes de hidrógeno determinantes de la estructura helicoidal de las proteínas (se utiliza en una dilución al 10%). 3. -Tallado Consiste en seleccionar detalladamente a partir de las piezas fijadas las áreas sobre las que se van a realizar el estudio. No deben de tener un grosor superior a los 3 mm de espesor para su correcta inclusión. Las muestras se introducen en cestillos o casetes individuales con perforaciones para permitir el intercambio de sustancias entre el tejido y el medio, y además, puede escribirse sobre ellos para la identificación de cada muestra.
5 4.-Inclusión A excepción de las muestras fijadas por congelación, las muestras requieren de su inclusión en un medio sólido que confiera a los tejidos la dureza necesaria para impedir que se fragmenten durante el corte, mantenga la estructura y las relaciones entre los distintos elementos y asegure la obtención de cortes muy finos, regulares y homogéneos. El proceso de inclusión consiste en hacer penetrar lo más íntimamente posible en el tejido a estudiar una sustancia homogénea solidificable capaz de ser dividida en secciones delgadas, además, esta sustancia debe ser ópticamente neutra o fácilmente eliminable. Las etapas a seguir serian la deshidratación, aclaramiento e infiltración. - Deshidratación: tiene por objeto la eliminación completa del agua de la muestra tisular para que se pueda embeber adecuadamente en medios de inclusión. Puede ser empleando agentes químicos (alcoholes) o físicos (criodesecación y criosustitución). Este paso no es necesario si el medio de inclusión que se utilice es soluble en agua. - Aclaramiento: consiste en la sustitución del agente deshidratante por una sustancia miscible con el medio de inclusión que va a utilizarse. Con ello se pretende que toda la muestra se halle embebida en un agente químico líquido, en el que pueda disolverse el medio de inclusión para que penetre en el tejido completamente y de forma homogénea. Entre estos agentes, el más empleado es el xilol o sustitutivo de xilol. - Infiltración: el objeto es infiltrar o rellenar la muestra con el medio de inclusión que se va a utilizar para la imbibición del tejido. Consiste en una ocupación completa de los espacios intra y extracelulares. Su finalidad es proporcionar a la pieza homogeneidad y dureza suficientes para que se puedan obtener secciones finas de calidad. Entre los medios de inclusión, los más utilizados son las parafinas, que son mezclas complejas de carburos procedentes de la destilación del petróleo. Son sustancias blancas, cristalinas, untuosas al tacto, insolubles en agua y alcohol y
ó solubles en la mayoría de las esencias, el cloroformo y los hidrocarburos bencénicos. Su consistencia, elemento esencial de su aplicación histológica, depende de su punto de fusión, que varía entre 45º y 70º. Para la elaboración de los bloques se utilizan unos moldes, donde se pone parafina fundida y la muestra impregnada de parafina. Los moldes se enfrían rápidamente, solidificándose la parafina que contiene la pieza en un bloque. El bloque se extrae del molde y se guarda en el frigorífico hasta realizar los cortes. 5. -Cortes A partir de los bloques, se obtienen secciones de 3 a 5 µm de grosor utilizado un instrumento capaz de realizar secciones muy finas denominado microtomo. Los cortes se depositan sobre un baño de agua caliente y se recogen mediante un portaobjetos sobre los que quedan adheridos. Los cortes de piezas fijadas por congelación se obtienen mediante un aparato denominado criotomo, que es como un microtomo pero que mantiene la congelación de la pieza. Una vez obtenidos, son recogidos directamente sobre el portaobjetos. 6. -Tincidn Los tejidos de origen animal son incoloros, salvo que contengan algún tipo de pigmento. El principio de las tinciones se basa en la afinidad particular de ciertos tejidos o formaciones celulares por una sustancia colorante determinada. Existen diferentes tipos de colorantes: Colorantes básicos: son sales cuya propiedad colorante está en relación con el componente básico de su molécula. Sus afinidades tintoriales son muy variadas, aunque fundamentalmente tiñen estructuras ácidas y dependen mucho de la preparación previa del tejido. Entre ellos, se encuentran los mejores colorantes de los gránulos de secreción y de los núcleos, ya que las estructuras ácidas de las células están constituidas por ADN y ARN. Las estructuras teñidas por estos colorantes se denominan basófilas. Entre los colorantes básicos destacan: hematoxilina, fucsina básica, azul de metileno,
violeta de metilo y verde de metilo.
7 Colorantes ácidos: son sales cuya propiedad colorante va unida a las estructuras ácidas de su molécula. Tifien estructuras básicas, que se encuentran normalmente en el citoplasma celular. Las estructuras tefiidas por estos colorantes se denomina acidófilas. Entre ellos destacan: eosina, eritrosina, verde brillante, naranja y fucsina ácida. Colorantes neutros: formados por la unión de colorantes ácidos y básicos. Colorean conjuntamente o por separado diferentes estructuras. En solución acuosa la sal se inestabiliza y los iones liberados actúan sobre las estructuras. Colorantes indiferentes: no poseen grupos capaces de formar sales. Estos colorantes producen el color al incorporase a disolventes presentes dentro del tejido que van a tefiir. Estas sustancias colorean por impregnación física. Entre ellos están el sudán y el rojo escarlata que se utilizan para tefiir lípidos. Colorantes metacromáticos: son colorantes que tifien estructuras histológicas con una concentración elevada de polianiones que hacen que la célula se polimerice y adquiera un color diferente al de la solución diluida del colorante. Entre ellos destacan el azul de tolouidina, violeta de metilo, etc. A las estructuras así tefiidas se les denomina metacromáticas. Las tinciones utilizadas tanto en histología como posteriormente en histopatología son muy numerosas y variadas, según la finalidad que pretendamos o los componentes concretos que queramos revelar. De forma resumida, pueden clasificarse en los siguientes tipos: Tinciones topográficas: también llamadas rutinarias, dan una visión de conjunto de la estructura de un tejido o de una lesión. Suelen ser técnicas generalmente sencillas y rápidas. Son las coloraciones de rutina, suficientes en la mayoría de los casos para establecer un diagnóstico histopatológico correcto. Las más utilizadas son:
8 - Hematoxilina-eosina: es el prototipo de estas tinciones, tiene una primera fase donde se colorean los núcleos con hematoxilina y una segunda de contraste con eosina del citoplasma y componentes extracelulares. - Giemsa: se utilizan derivados tiacínicos como azur A, B y azul de metileno para el núcleo y eosina para el citoplasma y conectivo. Tinciones citológicas: permiten un estudio más profundo de los componentes celulares: núcleos, gránulos de secreción, mitocondrias, etc. Son tinciones más minuciosas y exigen fijadores y colorantes especiales (azul de toluidina, azocarmín de Heidenhain, verde jano, etc.). También pueden utilizarse para identificar microorganismos, como el grocot para los hongos o el Ziehl- Neelsen para los bacilos ácido alcohol-resistentes. Tinciones histoquímicas: Se utilizan para poner de manifiesto determinados componentes químicos o funciones enzimáticas (grasas, moco, glucógeno, mucopolisacaridos, etc.). Entre éstas, destacan las tinciones para grasas, donde se tienen que utilizar cortes en congelación, gelatina o polietilengicol, nunca en parafina, pues la grasa se disuelve en los líquidos intermedios empleados para las infiltraciones en parafina, y para tefiirlas, colorantes como el sudán IV o sudán negro. La reacción de PAS (ácido periódico reactivo de Schiff) es de las más utilizadas para poner en evidencia mucopolisacáridos. Tinciones estructurales: sirven para poner en evidencia los componentes de determinadas estructuras tisulares: fibras elásticas, reticulares, colágenas, neuroglía, etc. Entre éstas, destacan los tricrómicos que utilizan tres colorantes diferentes. Gran parte de las técnicas de tinción utilizan colorantes hidrosolubles, por lo que sí se utiliza uno de este tipo, a los cortes en parafina hay que eliminarles la parafina y posteriormente hidratarlos para que puedan tefiirse.
9 7. Montaje Después de que las preparaciones hayan sido teñidas, deben sufrir una última manipulación, el montaje, destinado a facilitar el examen microscópico y especialmente, a conservar los cortes durante mucho tiempo. El montaje consiste en impregnar las secciones de una sustancia transparente inactiva (medio de montaje), secarla y cubrirla con una laminilla fina de cristal llamada cubreobjetos, que debe quedar adherida al portaobjetos protegiendo la sección. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO Pueden ser de transmisión y barrido. En el microscopio electrónico de transmisión, la luz es sustituida por un haz de electrones que pasa a través de las muestras, lo que permite un mayor poder de resolución y, por tanto, mayores aumentos. - Aumentos: 200.000-500.000 - Poder de resolución: 1 nm (0.001 µm) (en el microscopio óptico es de 0.25 µm) El haz de electrones es dispersado o concentrado mediante campos magnéticos y así, cuando choca con la muestra, una parte de los electrones rebotan y otra la atraviesan, creando la imagen en una pantalla. De ella se obtienen fotografías denominadas electronografías. Según la capacidad de ser atravesadas por el haz de electrones las estructuras se ven más o menos oscuras (electrodensas) o claras (adilectrónicas o electrolúcidas). Como en el caso de microscopía óptica, las muestras deben sufrir una serie de manipulaciones para su observación. Las muestras deben tener un tamaño muy pequeño (aproximadamente 1mm), deben ser fijadas (el fijador de elección es el glutaraldehido) y posteriormente, incluidas en resinas de tipo epoxi, obteniéndose bloques, a partir de los que, con un instrumento denominado ultramicrotomo, se obtienen secciones muy delgadas (10-100 nm), que son contrastadas con acetato de uranilo y citrato de plomo y depositadas sobre rejillas para su observación. El microscopio electrónico de Barrido, estudia superficies. Las muestras son de
mayor tamaño y se someten a un depósito de metales pesados (oro o paladio). Metales pesados hacen que los electrones se reflejen y sean capturados por
10 detectores electrónicos y a través de un monitor se reproduce la imagen tridimensional que puede digitalizarse o fotografiada. Técnicas inmunohistoquímicas o inmunocitoquímicas Son técnicas que permiten, sobre secciones de tejido, identificar células concretas, localizar en las células o tejidos cualquier componente o estructura, e incluso identificar agentes patógenos. Para ello, se emplean anticuerpos específicos frente a los antígenos a visualizar. Para localizar el lugar donde se está produciendo la reacción antígeno-anticuerpo es necesario utilizar un marcador. Entre estos marcadores, se utilizan para microscopía óptica fluorocromos (técnicas de inmunofluorecencia) y enzimas (técnicas inmunoenzimáticas), y para microscopía electrónica iones metálicos (técnicas de inmuno-oro). Hibridación in situ Evidencian secuencias de ácidos nucleicos en cortes de células y tejidos y cuando se conjugan con técnicas inmunocitoquímicas ofrecen una valiosa información topográfica sobre ADN, ARNm y proteína celular.