SECCIÓN 2.3. ENFERMEDADES DE LOS CRUSTÁCEOS CAPÍTULO I.3. INFORMACIÓN GENERAL 1. ENFERMEDADES DE LOS CRUSTÁCEOS INCLUIDAS EN LA LISTA DE LA OIE Los crustáceos pueden verse afectados por una variedad de enfermedades. Un caso evidente es el del camarón peneido producida por acuicultura. Todas las enfermedades de los crustáceos que tienen un gran impacto social o económico son de tipo infeccioso. Las enfermedades de los crustáceos y sus agentes etiológicos que aparecen en el Código de animales acuáticos tienen una distribución geográfica restringida, no tienen tratamiento ni remedios terapéuticos, son potencialmente excluibles y tienen un fuerte impacto social y económico. En la última edición del Código de animales acuáticos aparece la lista de la OIE con las enfermedades de los crustáceos. Debido al tamaño e importancia de la acuicultura industrial del camarón peneido los principios y métodos que se discutirán en este capítulo se centran sobre todo en el camarón peneido. En 1997 (14) se revisó la taxonomía del camarón peneido. Los subgéneros del peneido adquirieron estatus de auténticos géneros. Puesto que ese cambio en la taxonomía del peneido no se ha tenido una aceptación unánime, en consonancia con los objetivos perseguidos por el presente Manual de animales acuáticos, utilizaremos la taxonomía de los peneidos esbozada por Holthuis (8) 2. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Los métodos disponibles para el diagnóstico de las enfermedades referidas más arriba incluyen los métodos tradicionales utilizados para afrontar la patología morfológica (microscopía de campo claro, histopatología, y microscopía electrónica), los métodos de bioensayo con hospedadores susceptibles y los métodos moleculares (sondas génicas y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Aunque el cultivo celular se considera como la herramienta estándar en los laboratorios de diagnóstico médico y veterinario, y en los de diagnóstico para crustáceos, aún debe perfeccionarse como herramienta rutinaria útil para el diagnóstico de los patógenos de los crustáceos. La química clínica, como herramienta de diagnóstico, aún no se utiliza de forma rutinaria por los patólogos especialistas en crustáceos. 2.1. Métodos de diagnóstico para las enfermedades de los crustáceos En el momento de redactar esta sección del Manual de animales acuáticos, los métodos que están disponibles y se pueden seleccionar para el diagnóstico de las enfermedades de los crustáceos de la lista de la OIE o para la detección de sus agentes etiológicos se basan en: Síntomas clínicos y signos evidentes Microscopía de campo claro, de contraste de fases o de campo oscuro, preparaciones montadas de tejidos teñidos o sin teñir, aplastamientos tisulares, frotis de impresión y preparaciones montadas a base de hilos fecales. Histología de muestras fijadas Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 383
Bioensayos con portadores sospechosos o subclínicos en los que se utilice un hospedador muy susceptible (ya sea una especie o distintas fases de la vida del crustáceo) como indicador de la presencia del agente patógeno. Microscopía electrónica de transmisión o escaneo Pruebas de detección del agente patógeno basadas en anticuerpos policlonales (PAbs) o monoclonales (MAbs) obtenidos de sueros inmunes. Métodos moleculares Sondas de ADN en pruebas puntuales de hibridación, utilizando muestras de tejido fresco o extracciones de ADN. Sondas de ADN o de ARN para pruebas de hibridación in situ con cortes histológicos de tejidos fijados. PCR y (RT)-PCR estándar y en tiempo real para el ensayo directo con muestras de tejido fresco o extrayendo ADN o ARN. En cada capítulo de este Manual de animales acuáticos, se describe una enfermedad y se esbozan los procedimientos detallados a seguir en la aplicación de cada uno de los métodos disponibles (analítico, presuntivo y confirmativo) para el diagnóstico de una le las enfermedades de los crustáceos que aparecen en la lista de la OIE. Es escaso el número de pruebas basadas en anticuerpos de las que se dispone para diagnosticar los agentes patógenos causantes de las enfermedades de los crustáceos. Como los crustáceos no producen anticuerpos, es limitada la aplicación de pruebas de diagnóstico basadas en anticuerpos. Se han desarrollado métodos de diagnóstico basados en anticuerpos, tal como se refleja en la literatura sobre el tema; dichos métodos se desarrollaron a base de anticuerpos de ratón o conejo contra virus purificados procedentes de hospedadores infectados. Como los virus de los crustáceos (y la bacteria de la hepatopancreatitis necrotizante [NHP]) no se pueden cultivar in vitro (i.e. producirse en cultivo celular) de una forma rutinaria, para la producción de anticuerpos, deben utilizarse virus purificados procedente de hospedadores infectados. Esto ha limitado seriamente el desarrollo y la disponibilidad de esa herramienta de diagnóstico. Las aplicaciones más recientes de la tecnología MAb para la solución de ese problema han propiciado que se pueda contar ya con algunas pruebas basadas en anticuerpos. Ya se dispone de MAbs para detectar agentes de varias de las enfermedades de los crustáceos incluidas en la lista de la OIE (el virus del síndrome de las manchas blancas [WSSV], el virus del síndrome de Taura [TSV], el virus de la cabeza amarilla [YHV], el virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoyética [IHHNV], y la bacteria de la hepatopancreatitis necrotizante [NHP-B]). Están disponibles en varias fuentes comerciales los kits/reactivos para el diagnóstico basado en anticuerpos de las infecciones por TSV, WSSV, YHV, y NHP-B. Se han desarrollado métodos moleculares, y varios de ellos son de uso extendido para la detección de muchos de los patógenos víricos, bacterianos y protozoicos del camarón peneido. Los métodos de detección basados en el ácido nucleico se pueden consultar en la literatura y algunos están disponibles como kits comerciales para la detección de los siguientes patógenos de la lista de la OIE: el TSV, el WSSV y el virus de la enfermedad de la cabeza amarilla (YHV/GAV), IHHNV, el baculovirus del tipo Penaeus monodons (MBV), Baculovirus penaei (BP), y el virus de la mionecrosis infecciosa (IMNV). Para todos estos virus, se dispone de las técnicas PCR o RT- PCR, que se utilizan de forma rutinaria en ciertos sectores de la acuicultura industrial de los crustáceos. Para los agentes patógenos de otras enfermedades de la lista de la OIE, hay sondas de ADN etiquetadas como no marcadas radiactivamente, que se describen en la literatura o están comercialmente disponibles para su aplicación en formatos puntuales con extractos de hemolinfa o de tejido, o para su utilización con cortes histológicos rutinarios mediante la utilización de la hibridación in situ. 384 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
3. MUESTREO El muestreo de los concentrados de crustáceos relacionado con las enfermedades de la lista de la OIE se puede realizar con tres fines: 1) vigilancia; 2) certificación de existencias o de la instalación; y 3) diagnóstico de la enfermedad. El número y tipo de muestras que deben tomarse para el análisis varían en función de cuál de esos tres fines se persiga. En el capítulo 1.1.4 de este Manual de animales acuáticos se describe la metodología para a la vigilancia y el muestreo. El muestreo debe diseñarse de tal forma que se pueda realizar la detección en animales infectados con un margen de confianza del 95%. En la sección que sigue, se ofrece información relevante para el muestreo de los crustáceos. Para aquellas pruebas de diagnóstico cuya sensibilidad y especificidad ya estén establecidas, el tamaño de la muestra puede determinarse mediante métodos como el FreeCalc (www.ausvet.com.au) o similares, tal como aparece esbozado en el capítulo 1.1.4. (Requisitos para la vigilancia a efectos del reconocimiento internacional de la ausencia de infección). Sin embargo, para aquellas pruebas de diagnóstico cuya sensibilidad y especificidad no están establecidas, se debe determinar el tamaño de la muestra por defecto, utilizando para tal fin el cuadro 1 del presente capítulo. 3.1. Diagnóstico en condiciones de enfermedad Durante los episodios de la enfermedad clínica, se deben obtener ejemplares cualificados de crustáceos, vivos o moribundos, cuidadosamente seleccionados y con lesiones representativas. Para el diagnóstico, no debería escatimarse esfuerzo alguno por conseguir muestras de diagnóstico integradas por ejemplares moribundos o enfermos, que sean representativos de la enfermedad o enfermedades que afectan a las poblaciones de crustáceos. No deben incluirse en la muestra ejemplares muertos. Cuando las reservas de crustáceos libres o cultivados presentan síntomas clínicos de una enfermedad activa, indicativos de que nos hallamos ante una le las enfermedades de la lista de la OIE, hay que asegurarse de que las muestras recogidas se conserven de forma adecuada para su uso en pruebas preliminares de diagnóstico (véase la sección sobre la conservación de las muestras para su uso en las pruebas recomendadas). La cantidad mínima de ejemplares de una muestra a utilizar en una prueba de diagnóstico es de 100 para los estadios larvarios de la mayoría de los crustáceos, 50 para los estadios post-larvarios, y 10 para los jóvenes y adultos. Esas cantidades pueden ser mayores si los ejemplares presentan signos evidentes de la enfermedad. En cualquier caso, esos mínimos son orientativos, debiendo enfatizarse que los ejemplares de calidad y que se han seleccionado con esmero son mucho más valiosos (y con mejor relación entre calidad y coste) que docenas o cientos de ejemplares recogidos al azar para inflar la muestra. 3.2. Diagnóstico con crustáceos portadores subclínicos Cuando las muestras recogidas se utilizan con fines de vigilancia, para ensayar portadores subclínicos de epizootias anteriores, para la certificación de estado libre de patógenos (SPF) o de erradicación de una enfermedad concreta dentro de un país, región o instalación, el tamaño de la muestra a recoger se determinará mediante la utilización de una tabla estadística de tamaño de muestra o un programa similar al FreeCalc. El tamaño mínimo de la muestra para cada lote ensayado debería propiciar un nivel de confianza del 95% en el sentido de que la muestra contendrá ejemplares infectados, asumiéndose una prevalencia mínima de la infección igual o superior al 2%, 5% o 10%. A efectos de vigilancia y certificación de las enfermedades incluidas en la lista de la OIE, las muestras recogidas para pruebas de diagnóstico procedentes de sitios de acuicultura o de poblaciones silvestres deberían contener un número adecuado de ejemplares de cada lote que haya que ensayar, de acuerdo con el cuadro 1 (o con el número calculado mediante FreeCalc, en el caso de que éste fuese aplicable). Para las enfermedades de la lista de la OIE, es muy recomendable la planificación del calendario de muestreo (i.e. calendario del criadero, la estación climática, etc.), de tal forma que el muestreo incluya la fase o fases de la vida del Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 385
crustáceo en las que sea más probable la detección del patógeno. Lo anterior es de especial importancia si los métodos de diagnóstico disponibles son los basados en microscopía simple o histología y no los métodos moleculares. Las muestras de ejemplares larvarios y post-larvarios son las más adecuadas para usar en conexión con los baculovirus BP y MBV; las muestras de ejemplares jóvenes y pre-adultos lo son para el TSV, el IHHNV, el WSSV, el IMNV, el NHP-B y el YHV/GAV; para la plaga del cangrejo de río, son adecuadas las muestras de jóvenes y adultos. Las muestras recogidas para las pruebas moleculares o las basadas en anticuerpos, relacionadas con enfermedades de la lista de la OIE, se pueden combinar como muestras agrupadas con no más de cinco ejemplares por cada muestra agrupada. 3.3. Pruebas de verificación o mantenimiento de la ausencia de enfermedades concretas Tras constatar que, después de 2 años de vigilancia mediante la aplicación de pruebas de laboratorio y en ausencia de cualquier signo clínico sospechoso, una instalación está libre de todas o de algunas de las enfermedades inventariadas en el Código de animales acuáticos, se deben seguir realizando inspecciones bianuales. No obstante, la recogida de ejemplares de prueba puede limitarse a 30 crustáceos (camarones), incluidos, sobre todo, los adultos. Durante las visitas de inspección, deben recogerse los camarones moribundos para su examen en el laboratorio. Cuadro 1. Tamaño de muestra aleatoria en función de la supuesta prevalencia del patógeno en el lote, adjudicando a la técnica un 100% de sensibilidad y especificidad. Tamaño del lote Tamaño de la prueba a prevalencia del 2% Tamaño de la prueba, a prevalencia del 5% Tamaño de la prueba, a prevalencia del 10% 50 50 35 20 100 75 45 23 250 110 50 25 500 130 55 26 1.000 140 55 27 1.500 140 55 27 2.000 145 60 27 4.000 145 60 27 10.000 145 60 27 100.000 o más 150 60 30 Según Ossiander & Wedemeyer, 1973. 4. TIPO DE MUESTRA Y SU CONSERVACIÓN 4.1. Muestras para miscroscopía directa Las muestras para observación microscópica deben examinarse a la mayor brevedad tras su recogida. En la medida de lo posible, se utilizarán ejemplares vivos o, si estos no son viables, ejemplares frescos, refrigerados o fijados con formalina tamponada al 10%. Si está disponible un laboratorio de campo adecuado, se debería utilizar el mismo para procesar y examinar las muestras cerca del lugar de recogida. 4.2. Muestras para histología Se recogen los camarones por cualquier medio disponible procurando no producirles estrés durante su manipulación. Se trasportan al laboratorio en un recipientes de agua bien oxigenada. Hay que procurar que el recipiente esté bien aireado por si transcurre algún tiempo antes de la fijación. Para el estudio de los camarones presuntamente enfermos, se seleccionan los que estén moribundos o decolorados, y los que tengan un comportamiento anormal, excepto en el caso de 386 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
que el muestreo aleatorio se haya realizado de forma explícita para la estimación de la prevalencia de la enfermedad. i) Debe disponerse de una cantidad adecuada de fijador. Como norma general, debe usarse un mínimo de diez volúmenes de fijador por un volumen de muestra tisular (i.e. para una muestra de 10 g de camarón se requieren 100 ml de fijador). ii) Fijador AFA (alcohol, formalina, y ácido acético) de Davidson El fijador AFA de Davidson se recomienda para la mayoría de las aplicaciones histológicas. El fijador es rápido, reduce los cambios autolíticos en los crustáceos tropicales (i.e. en el camarón peneido) y su contenido ácido descalcifica la cutícula. La formulación para un litro de AFA de Davidson es como sigue: 330 ml de alcohol etílico al 95% 220 ml de formalina al 100%* (una solución acuosa de gas de formaldehído saturada al 37 39% 115 ml de ácido acético glacial ** 335 ml de agua corriente (para crustáceos marinos, se puede utilizar agua de mar) Se guarda el fijador en botellas de vidrio o de plástico a temperatura ambiente y con tapones seguros. * Para preparar el fijador AFA de Davidson no se debe usar formalina al 10% que se haya preparado con anterioridad, ya que el contenido del AFA de Davidson no es adecuado para realizar una fijación satisfactoria. ** No se deben utilizar otros ácidos, tales como el HCL, para la obtención del ácido acético. Los cortes histológicos preparados en solución de HCL-Davidson no son adecuados para la tinción histológica rutinaria con hematoxilina y eosina. iii) Procedimientos de fijación con AFA de Davidson Para larvas y post-larvas que son demasiado pequeñas para poder inyectarlas con fijador utilizando una jeringuilla de tuberculina: utilizando una malla de filtro o una pipeta de Pasteur, se seleccionan y recogen los ejemplares. Se sumergen los camarones de la muestra en el fijador. Se fijan durante 12-24 horas en el fijador, luego se transfieren a alcohol etílico al 50-70% para su almacenamiento. Para post-larvas más grandes y juveniles de tamaño minúsculo, que resultan demasiado pequeños para poder ser inyectados: se seleccionan y recoger los ejemplares como se describió en la sección 3. Se utiliza una aguja o unas pinzas de punta fina para hacer una incisión en la cutícula. Se sumerge el camarón de muestra en el fijador. Se deja que se fije durante 12 24 horas y, a continuación, se transfiere a alcohol etílico al 50-70% para su almacenamiento. Para post-larvas más grandes, juveniles y adultos: se inocula fijador (en una relación peso/volumen de 5-10%) con aguja y jeringuilla en un camarón vivo (el calibre de la aguja a utilizar dependerá del tamaño del camarón i.e. una aguja del calibre 27 para postlarvas y pequeños juveniles). En primer lugar se inyecta el hepatopancreas en dos o más sitios, con un volumen suficiente para que el HP adquiera un color blanco-naranja; a continuación se inyecta el fijador en zonas adyacentes del cefalotórax, en la región abdominal anterior y en la región abdominal posterior. El fijador debe repartirse entre las diferentes regiones, aplicando una dosis mayor a la región céfalo-torácica, más concretamente al HP, que a la abdominal. Un buen criterio para lograr una fijación adecuada consiste en inyectar una proporción del 5 10% del peso del camarón o de otros crustáceos. Debería desaparecer de inmediato cualquier señal de vida, y producirse un cambio visible de color en las regiones inyectadas. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 387
Inmediatamente después de la inoculación, se practica una incisión en la cutícula con unas tijeras de disección desde el sexto segmento abdominal hasta la base del rostro, teniendo sumo cuidado de no hacer un corte profundo en el tejido subyacente. La incisión en la región céfalo-torácica debe ser lateral con respecto a la línea media dorsal, mientras que la correspondiente a la región abdominal debe ser lateral media.. Para los camarones (y para la mayor parte del resto de los crustáceos) de peso superior a ~12 g: tras inyectar el fijador, se debe biseccionar el cuerpo transversalmente al menos una vez por la parte posterior a la unión del abdomen con el céfalo-tórax, y (de forma opcional) también por la parte media del abdomen. Para crustáceos y cangrejos de mar de tamaño grande: tras la inyección de fijador, se pueden cortar los órganos que sean de interés. Se completará la fijación de esas muestras de tejidos y se manipularán tal como se ha indicado anteriormente. Tras la inyección, las incisiones y bisecciones/trisecciones, o el seccionado de los órganos clave, se sumerge el ejemplar en el fijador (se usa una proporción de fijador/ tejido de 10:1). Se deja que continúe la fijación a temperatura ambiente durante 24 72 horas, según el tamaño del camarón (o del crustáceo) que hay que conservar. Puede ser necesaria una fijación más larga con AFA de Davidson para conseguir una descalcificación completa del caparazón de los cangrejos de mar, las langostas, los cangrejos de río, etc. Tras la fijación, se transfieren los ejemplares a recipientes con alcohol etílico al 70%, para poderlos almacenar por tiempo indefinido. Debe hacerse una historia completa de los ejemplares en el momento de su recogida: observaciones claras sobre las condiciones del camarón (o de otros crustáceos), especie, edad, peso, procedencia (silvestre o de cultivo en este caso, el número de estanque o depósito, número del lote, etc.), y cualquier otro tipo de información relevante que pueda necesitarse más adelante. La etiqueta correspondiente a cada ejemplar debería acompañarle en el mismo recipiente durante la fijación, el almacenamiento y el trasporte al laboratorio. Se debe usar siempre un lápiz del número 2 y papel resistente al agua (se recomienda papelplástico; nunca se deben utilizar bolígrafos o rotuladores de de tinta, ya que ésta se disuelve en el alcohol). iv) Transporte y envío de las muestras conservadas Dado que no se deben hacer envíos de grandes cantidades de alcohol ni por correo ni por transporte ordinario, se recomiendan los siguientes modos de envío: se retiran los ejemplares del alcohol etílico al 70%. Cuando se trate de larvas, post-larvas y jóvenes de pequeño tamaño, se utilizarán viales herméticos de plástico y con tapón de rosca, siempre que estén disponibles; si se utilizan viales de vidrio, deben empaquetarse de forma que no se rompan. Para enviar ejemplares grandes, se envuelven bien las muestras con toallas de papel blanco (no se debe usar algodón crudo). Se colocan los ejemplares envueltos con toallas en una bolsa sellable de plástico y se satura con alcohol etílico al 70%. Se inserta la etiqueta y se sella la bolsa. Se coloca ésta dentro de una segunda bolsa sellable. Se pueden poner muchas bolsas sellables en un recipiente de envío adecuadamente etiquetado, que sea resistente, y a prueba de aplastamiento (véase el capítulo 1.5.6 del Código de animales acuáticos). 4.3. Conservación de muestras para pruebas con anticuerpos, pruebas puntuales (dot-blot) con sondas de ADN, o reacción en cadena de la polimerasa. Para las pruebas rutinarias de diagnóstico PCR, RT-PCR o para las pruebas puntuales con sondas de ADN se deben preparar muestras para conservar el ácido nucleico del agente patógeno. De 388 Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
igual modo, las muestras que se vayan a utilizar en pruebas basadas en anticuerpos deben conservarse para que retengan los lugares de los antigénicos de reacción para los anticuerpos utilizados. 4.3.1. Tipos de muestra Las muestras seleccionadas para las pruebas de diagnóstico basadas en anticuerpos o en ácido nucleico deberían manipularse y empaquetarse (en bolsas o botellas de plástico nuevas) con sumo cuidado para evitar una posible contaminación cruzada dentro del conjunto de muestras tomadas de diferentes surtidos (silvestres o de cultivo), de depósitos, estanques, criaderos, etc. Se deben utilizar bolsas o botellas de plástico para muestras. Para cada conjunto de muestras, se debe colocar en cada paquete o recipiente una etiqueta resistente al agua, con los correspondiente datos escritos con lápiz del número 2. Se ofrecen a continuación algunos de los métodos apropiados para la conservación y el transporte de muestras recogidas para su uso en pruebas moleculares o pruebas basadas en anticuerpos: Ejemplares vivos: estos pueden procesarse en condiciones de campo o enviarse a los laboratorios de diagnóstico para su ensayo. Hemolinfa: este tejido constituye la muestra preferida para ciertas pruebas de diagnóstico moleculares o basadas en anticuerpos. Las muestras se pueden recoger con jeringuilla y aguja mediante punción cardiaca, a partir del hemocoel (i.e. el seno ventral de los peneidos), o de un apéndice cortado. Ejemplares en hielo o refrigerados: este procedimiento se utiliza cuando los ejemplares se pueden transportar al laboratorio en menos de 24 horas. Se empaquetan las muestras en bolsas para muestras recubiertas con una cantidad adecuada de hielo dentro de una caja aislada con espuma de estireno (Styrofoam ) y se envían al laboratorio. Ejemplares enteros congelados: se seleccionan ejemplares vivos, según los criterios expuestos en la sección 3, se congelan rápidamente in situ a -20ºC o menos utilizando hielo seco molido, o se congelan en los laboratorios de campo utilizando un congelador mecánico. Se prepara una etiqueta y se inserta en los recipientes con las muestras, se empaquetan las muestras con una cantidad adecuada de hielo seco en una caja aislada con espuma de estireno, y se envía al laboratorio. Muestras conservadas en alcohol: en zonas en las que el almacenamiento y transporte de las muestras es problemático, se puede utilizar etanol al 90 95% para conservar, guardar y transportar ciertos tipos de muestras. Con crustáceos enteros (en cualquier fase de su vida, siempre que no sean mayores de 2 3- g) pueden conservarse en etanol al 90-95% los tejidos extirpados (i.e. los pleópodos) de crustáceos grandes, o la hemolinfa; después se empaquetan para su envío de acuerdo con los procedimientos descritos en la sección 4.2.v (para más detalles, véase el capítulo 1.5.6 del Código de animales acuáticos). Conservación de ARN y ADN tisulares utilizando RNAlater: se corta una porción de tejido de menos de 0.5 cm en una dimensión y se sumerge en 5 volúmenes de RNAlater (por ejemplo, una muestra de 0.5 gramos de peso requiere unos 2.5 ml de RNAlater). Los órganos pequeños, como el riñón, el hígado y el bazo pueden guardarse enteros en RNAlater. Esas muestras pueden almacenarse a 4ºC durante un mes, a 25ºC durante una semana o a -20ºC por tiempo indefinido. Los tejidos tratados con RNAlater se guardan a 20ºC. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006 389
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