I. Objetivos Producir la hidrólisis de la urea por medio de la enzima amidohidrolosa denominada UREASA. Analizar el electo que produce la variación de la concentración del sustrato (UREA), corn respecto a!a velocidad de la reacción enzimática Determinar por mélodo experimental los principales parámetros que rigen la cinética enzimática, tales como: constante de Michaelis; velocidad máxima, constante de velocidad y energía de activación. II.Conceptos Previos Oué significan los siguientes términos: Biocatalizador; proteína; Enzima; Cinética química; Velocidad de reacción; específica de velocidad, Energía de activación; Sustrato; Hidrólisis; Incubación; ph; Solución buffer; Tilulación; lnhibidores enzimáticos? III.Fundamento Teórico La UREASA es una enzima amídohidrolosa de peso molecular: 480.000 Daltons, punto isoeléctrico: 5.0 y ph óptimo entre 6 y 7. Cataliza la hidrólisis de la urea produciendo gas carbónico, hidróxido de amonio, seqún la reacción H2N-CO-NH2 + 3H2O Ureasa ph=7,0,t=37 C 2NH4OH + CO2 En presencia de una solución buffer de_fosfatos con ph = 7.0 y a una 1
temperatura de incubación de 25 c, presenta una constante de Michaelis de 10,5 mmol/l. Los principales inhibidores de su actividad enzimática. Son los iones metálicos pesados tales corno la plata (Ag +1 ) el mercurio (Hg+ 2 ) e igualmente el ácido hidroxámico y la tiourea Se encuentra en varios tejidos vegetales como en el haba de soya lo cual implica que pueda ser usada en análisis de alimentos para determinar urea, ya Sea por el método de Kjeldhal o por titulación del amonio liberado. De esta forma, al titular el hidróxido de amonio producido por la hidrólisis, se puede calcular la cantidad de urea hidrolizada, utilizando el método estequiométrico, puesto que se producen 2 moles de NH 4 OH por cada mol de urea desdoblada. Por lo tanto, esta reacción puede utilizarse con éxito en la determinación de urea en sangre, orina, suelos y otros materiales orgánicos. Dada la alta especificación por el sustrato sobré el que actúa, la reacción permite observar el curso de la cinética de Míchaelis-Menten. Para ello, se varía!a concentración de la urea con respecto a, posteriormente, las soluciones se incuban durante un tiempo determinado, a! cabo de! cual se proceden a titular con He! de concentración conocida. Así, a partir de la cantidad de urea hidrolizada y el tiempo de reacción se calcula la velocidad de la hidrólisis en rnicromol/minuto. CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTEN El efecto de la variación de la concentración del sustrato sobre!a velocidad do una reacción enzimática puede describirse gráficamente así: 2
Gráfica 2.Curva cinética de Michaelis Menten La cual indica, que a bajos concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción varía directamente proporcional a este, comportándose como una cinética de primer orden. A medida que se incrementa el sustrato, los centros activos de la enzima se saturan y por lo consiguiente se establece un límite de velocidades denominada velocidad máxima (V máx ), que representa una cinética de orden cero puesto que es constante. Un parámetro útil en este análisis, lo constituye una constante denominada de michaelis (Km), la cual está relacionadas con la concentración del sustrato en el cual la velocidad es la mitad de la velocidad máxima. La ecuación de la hipérbola anterior es:. Como se puede observar, la expresión anterior se caracteriza por dos valores prácticos: V máx y K m Para determinar estos parámetros, se utiliza frecuentemente e! método de Linneweaver y Burk, llamado de la doble recíproca, puesto que utiliza el inverso de la concentración del sustrato y de la velocidad para relacionarlos en una gráfica aproximadamente lineal: 3
Gráfica 1:Gráfica de la doble recíproca de Linneawer and Burk 4
Se puede demostrar que la pendiente de esta gráfica es equivalente al cociente entre Km y Vmáx y el intercepto vertical representa el inverso de la velocidad máxima, por lo tanto, Sí la gráfica se linealizanpor el método estadístico de los mínimos cuadrados, los parámetros Michaelianos se determinan así: Otro método para encontrar Km y Vmáx es el propuesto por Eadie-Hofstee. En el cual se gráfica velocidad contra el cociente entre V y concentración del sustrato. La pendiente de la gráfica nos proporciona la constante de Michaelis Otros parámetros cinéticos que se pueden determinar por método experimental son: la constante de velocidad específica de la reacción, que se puede calcular a partir de la velocidad máxima y la concentración inicial de la enzima, es decir: como: Vmáx = K 3 [ E ]; entonces: 5
Además, si el experimento se realiza a dos temperaturas diferentes, se puede encontrar la energía de activación (Eac) y el factor de frecuencia (A) por la ley de Arrhenius Así: IV.Lista de Materiales y Reactivos 1. Lista de Materiales:Tubos de ensayo con gradilla, pinzas para bureta, erlenmeyer de 125mL, pipetas de 5 y 10mL,matraz aforado de 100mL, baño termostatado, beaker de 400mL,bureta de 25mL, soporte universal. 2. Lista de Reactivos:Ureasa al 0,1 % en buffer, fosfato de ph = 7.0, Urea 0,25M, HgCl 2 al 1%, HCl 0,1N, indicador de Tashiro V.Procedimiento 1. Alistar 6 tubos de ensayo, rotularlos así: B, 1, 2, 3, 4, 5 y colocarlos en la gradilla Reactivos(mL) / Tubos B 1 2 3 4 5 Urea 0,25M 5,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Buffer fosfatos ph=7,0 5,0 8,5 7,5 6,5 5,5 4,5 6
HgCl 2 (Gotas)* 4 - - - - - Agitar los tubos (10seg),colocarlos en baño de maría a 37 C,durante 3min,luego,sin sacarlos adicionar: UREASA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Dejar en baño de maría a 37 C,durante 20min, al final adicionar: HgCl 2 (Gotas) - 4 4 4 4 4 Agitar vigorosamente los tubos(10seg),adicionar 2 gotas de indicador de Tashiro y volver a mezclar(15seg) un color azul- verdoso indicará prueba positiva para la actividad ureásica en la RBE ;posteriormente, sacar el blanco y depositar la solución en un erlenmeyer. 2. Preparar el baño termostatado a una temperatura de 37 C (sí no dispone de éste, alistar el equipo para baño de María (mechero, trípode, malla de asbesto y un beaker de 400 a 600 ml.) controlar la temperatura del baño con un termómetro. 3.Pipetear en el orden dado, los reactivos, de acuerdo a la siguiente tabla: 4.Alistar el montaje de titulación: lavar, purgar,cargar y enrasar la bureta con HCl 0,1N 5.Colocar el erlenmeyer que contiene la solución blanco, debajo la bureta y adicionar lentamente el HCl, hasta que aparezca y permanezaca un color rosadovioláceo. Esto indica que los equivalentes-gramo del hidróxido de amonio fueron neutralizados por los equivalentes-gramo del ácido clorhídrico. 6.Registrar en su tabla de datos, los ml de HCl gastados en la titulación del blanco. 7.Repetir el procedimiento anterior, con el tubo 1 y anotar los ml empleados de HCl 8.Continuar el proceso con los tubos 2,3,4,5 y registrar los ml gastados de HCl 7
en la tabla de datos. VI. Tabla de Datos Tabla 1.Volúmenes de HCl 0,1N,empleados en la titulación del NH 4 OH Tubos ml de úrea 0,25 M ml gastados de HCl 0,1N B 1 2 3 4 5 8