COMPARACIÓN DE TRES SOLUCIONES HIPOSMÓTICAS PARA EVALUAR LA MEMBRANA PLASMÁTICA DEL ESPERMATOZOIDE CRIOPRESERVADO DE TORO

REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS PROGRAMA DE ESPECIALIZACIÓN EN REPRODUCCIÓN BOVINA COMPARACIÓN DE TRES SOLUCIONES HIPOSMÓTICAS PARA EVALUAR LA MEMBRANA PLASMÁTICA DEL ESPERMATOZOIDE CRIOPRESERVADO DE TORO Trabajo especial de grado para optar al título de Especialista en Reproducción Bovina Autora: JEXENIA VALENTINA NAVA. M.V. Tutor: PROF. ARMANDO QUINTERO MORENO. M.V., MSc., Dr. Maracaibo, Febrero de 2013

DEDICATORIA Este trabajo está dedicado primeramente a mis hijos kriss Katherine, kevin Kelly torres Nava y Cesar Andrés Boscán Nava, que ellos son la razón de ser cada día, a mi esposo Julio César Boscán Ocando, por su apoyo incondicional en mí formación académica, mi mamá Edelita Mercedes Nava Cárdenas por darme la vida y apoyo, mis hermanas Jenny Belén y Jocsiris Delida por su entusiasmo, apoyo y colaboración, sin dejar mencionar a mis abuelos Francisca María Cárdenas de Nava y Rafael Ángel Nava que desde el cielo están orgullosos de mi preparación profesional, a Dios y a la Virgen por darme las bendiciones y por permitirme llegar hasta donde he alcanzado mis metas y que me de la misma fuerza para continuar luchando en la vida. IV

AGRADECIMIENTOS A Dios todo poderoso y la virgen por darme salud, protección y fortaleza para seguir adelante. A los profesores miembros del Comité Tutorial, Prof. Armando Quintero Moreno por su valiosa orientación y apoyo, durante mi formación como estudiante de la Especialidad en Reproducción Bovina y colaboración a los profesores Decio González Villalobos, Jorge Luis Rubio Guillen y Aitor d Ondiz. Al profesor Armando Quintero Moreno por facilitarme y permitirme analizar las muestras seminales en el Laboratorio de Andrología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad del Zulia (LANDROVET). A La Universidad del Zulia, División de Estudios para Graduados, a su personal Docente y Administrativo. A mis compañeros de la Especialidad, María Lourdes Ramírez y Evelio Urdaneta por los momentos vividos y compartidos durante la escolaridad. A todos aquellas personas que de alguna u otra manera compartimos durante mi formación, de corazón gracias a todos!!! V

Nava Jexenia Valentina. Comparación de tres soluciones hiposmóticas para evaluar la membrana plasmática del espermatozoide criopreservado de toro. Facultad de Ciencias Veterinarias. División de Estudios para Graduados. Programa de Especialización en Reproducción Bovina. Maracaibo, Venezuela. 2013. 31 pp. RESUMEN El objetivo de este trabajo fue comparar la sensibilidad de tres test hiposmóticos (HOST) para valorar la integridad funcional de la membrana plasmática (IFMP) de espermatozoides obtenidos de semen criopreservado de 12 toros, además de conocer el grado de asociación entre estas pruebas, la motilidad y la vitalidad espermática. Se compararon 3 soluciones con diferentes osmolaridades (0, 102 y 154 mosm/l) que se incubaron a 37 C en baño María. La solución con 0 mosm/l (A: agua ultra pura) fue incubada durante 5 min., mientras que las 2 restantes con diferentes concentraciones de cloruro de sodio se incubaron durante 30 min. La solución B y C constan de medios hiposmóticos a 102 mosm/l y 154 mosm/l respectivamente. Se tomaron tres muestras (100 μl) de semen descongelado por toro que se introdujeron en viales que contenían 1000 μl de cada solución hiposmótica. Sobre frotis realizados con cada medio hiposmótico y teñidos con Eosina-nigrosina (EN) se evaluaron 100 espermatozoides para determinar (en conjunto) el porcentaje de supervivencia y de flagelos flectados (FF). La asociación del HOST con la EN fue realizada para identificar los espermatozoides vivos o muertos con FF o intactos. Los resultados del HOST arrojan un mejor porcentaje de espermios con FF para los tratamientos B (49,75±4,17) y C (56,33±4,17) versus el tratamiento A (32,16±4,17) (P<0,05). Cuando se asociaron los FF con el porcentaje de supervivencia se observó la misma tendencia (A= 8,75±1,56 versus B: 26,33±3,46 y C: 29,41±2,67). Estos valores indican que las condiciones B y C son medios hiposmóticos apropiados para la valoración de los espermios, ya que propician la torsión helicoidal del flagelo y manteniendo la IFMP del espermatozoide en el 52% de los casos. Por otro lado se estableció una correlación positiva y significativa (0,64, P<0,05), entre la vitalidad espermática y la motilidad individual al utilizar las soluciones con menor osmolaridad (0 mosm/l versus 102 mosm/l). A pesar de demostrarse esta asociación se concluye afirmando que la condición osmolar A no se recomienda debido a que causa perdida de la IFMP y muerte celular, lo cual quedo en evidencia al apreciar que solo un 8% de espermatozoides con flagelos reaccionados sobreviven luego del un estrés osmótico tan bajo. Palabras clave: HOST, toro, espermatozoide, vitalidad. Correo: yvalentina2002@hotmail.com VI

Nava Jexenia Valentina. Comparison of three hyposmotic solutions to evaluate the plasmatic sperm membrane in cryopreserved bull semen. Facultad de Ciencias Veterinarias. División de Estudios para Graduados. Programa de Especialización en Reproducción Bovina. Maracaibo, Venezuela. 2013. 31 pp. ABSTRACT The objective of this study was to compare the sensitivity of three hyposmotic test (HOST) to evaluate the functional integrity of the plasmatic sperm membrane (IFMP) obtained from cryopreserved semen of 12 bulls, besides knowing the grade of association between these tests, motility and sperm vitality. Were compared 3 solutions with different osmolarities (0, 102 and 154 mosm/l) which were incubated at 37 C in a water bath. The solution with 0 mosm/l-1 (A: ultra pure water) was incubated for 5 min, while of 2 remaining with different concentrations of sodium chloride were incubated for 30 min. Solution B and C comprise a hyposmotic media at 102 mosm/l and 154 mosm/l, respectively. Three samples were taken (100 μl) of thawed semen per bull, that were Introduced in vials containing 1000 μl of each hyposmotic solution. About smears performed with each medium hyposmotic and stained with eosin and nigrosin (EN) 100 spermatozoa were evaluated to determine (together) the percentages of live sperm and swelling flagellas (FF). The association of the HOST with EN was performed to identify the percentage of spermatozoas live or dead with FF or intact. The results of the HOST showed a better percentage of sperm with FF for treatments B (49.75 ± 4.17) and C (56.33 ± 4.17) versus treatment A (32.16 ± 4.17) (P <0.05). When the FF were associated with the sperm survival percentage was observed the same trend (A = 8.75 ± 1.56) versus B (26.33 ± 3.46) and C (29.41 ± 2.67). These values indicate that the conditions B and C are optimal solution, propitiating the helical twist of the flagellum, maintaining the IFMP of the sperm in 52% of cases. A significabt correlation (0.64, P <0.05) was established between the two solutions with lower osmolarity (0 mosm/lt versus 102 mosm/lt). However, in spite of demonstrated this association is possible affirm that the A osmolar condition is not recommended because it causes loss of IFMP and cell death, thus was in evidence to appreciate that only 8% of sperm with flagella reacted survive after osmotic stress as low. Keywords: HOST, bull, sperm, vitality. Correo: yvalentina2002@hotmail.com VII

ÍNDICE DE CONTENIDO PÁGINAS DEDICATORIA AGRADECIMIENTOS RESUMEN ABSTRACT ÍNDICE DE CONTENIDO ÍNDICE DE TABLAS IV V VI VII VIII X INTRODUCCIÓN 1 JUSTIFICACIÓN 4 OBJETIVOS 5 REVISIÓN DE LITERATURA 6 Valoración de la calidad espermática 6 Prueba de respuesta osmótica 6 Test de Hinchamiento Osmótico (HOST) 7 Test de Resistencia Osmótica (ORT) 8 Test de Resistencia Hiperosmótica (HRT) 9 MATERIALES Y MÉTODOS 10 Ubicación del ensayo 10 Unidades experimentales 10 Colección y criopreservación de semen (fase 1) 11 Evaluación de semen criopreservado (fase 2) 11 Evaluación de la motilidad espermática 12 Evaluación de la Vitalidad 12 Evaluación de la membrana plasmática del espermatozoide mediante la prueba de endosmosis (HOST) 13 Análisis estadístico 14 VIII

RESULTADOS 15 Valoración de la calidad seminal mediante pruebas rutinarias de laboratorio en muestras criopreservadas de semen de toro. 15 Evaluación de la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides mediante el test de endósmosis (HOST). 16 Correlación entre los parámetros que valoran la calidad seminal en muestras de semen de toro criopreservadas. 19 DISCUSIÓN 20 CONCLUSIONES 26 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 27 IX

ÍNDICE DE TABLAS Páginas Tabla 1. Características seminales en muestras de semen de toro criopreservadas. 15 Tabla 2. Tabla 3. Tabla 4. Efecto del test de endósmosis (HOST) sobre los parámetros que determinan la calidad seminal en semen criopreservado de toros. 16 Respuesta de los espermatozoides criopreservados de toro sometidos al test de endósmosis (HOST) bajo diferentes condiciones de osmolaridad y teñidos mediante la coloración de eosina-nigrosina. 17 Correlación de Pearson entre los test de endósmosis celular y las características de calidad seminal del semen criopreservado (n=36). 19 X

INTRODUCCIÓN El análisis seminal estándar es considerado actualmente como la aproximación más idónea para evaluar la habilidad reproductiva de los toros (Beletti y Mello, 2004). Habitualmente la concentración, la motilidad y la morfología espermática son los parámetros que verifican la calidad de una muestra seminal y se asume que estas mediciones proveen una información veraz del estatus de la espermatogénesis; sin embargo, estos parámetros han demostrado limitaciones y no deberían de ser usados a manera individual como predictores de la fertilidad. Investigaciones importantes han sido realizadas para evaluar diferentes descriptores de la funcionalidad de la membrana plasmática (MP), sin embargo, varias de estas pruebas presentan limitaciones en cuanto al tiempo de ejecución o su aplicabilidad bajo condiciones clínicas o de finca (Correa y Zavos, 1994). De esta búsqueda constante destacan dos pruebas sencillas, económicas y de fácil acceso, que valoran la funcionalidad de la MP en alguno de sus 5 dominios, entre las cuales destacan el Test de Endósmosis Celular HOST, desarrollado en humanos (Jeyendran y col, 1984), Test Resistencia Osmótica ORT (Schilling y col., 1986) y el uso de tinciones supravitales. Diferentes aspectos de la MP son medidos en cada una de estas pruebas. Las tinciones supravitales valoran si la MP esta físicamente rota o dañada, lo cual es evidencia de que la célula esta muerta y la prueba de Endósmosis celular verifica si la MP está biológicamente activa (Zaneveld y col, 1990). Para la valoración de la vitalidad espermática se pueden utilizar tinciones fluorescentes y tinciones no fluorescentes: Estas últimas son económicas, prácticas y de fácil aplicación, tanto en los laboratorios convencionales como en fincas o granjas. Las más utilizadas son la eosina-nigrosina y el azul tripán (Januskauskas y Zilinskas, 2002). La tinción de eosina-nigrosina permite observar la cabeza del espermatozoide de color rosado o rojo poco intenso cuando esta muerto y el espermatozoide vivo se 1

observa incoloro o de color blanco sobre un fondo teñido. En la coloración de azul tripán se aprecia los espermios muertos de color azul y los vivos se aprecian incoloros. 2 La prueba de Endósmosis Celular, con su denominación en inglés HOST test o Hiposmótic Swelling Test ha sido diseñada originalmente para evaluar la actividad bioquímica de la MP fisiológicamente intacta del espermatozoide (Jeyendran y col, 1984), lo cual refleja la valoración de la integridad de la MP. La prueba consiste en someter los espermatozoides a un medio de presión osmótica más baja que la fisiológica (<240 mosm/l), lo que causa una entrada de agua en la célula en un intento de equilibrar la presión osmótica intracelular con la del medio extracelular ocasionando un aumento de volumen celular y enrollamiento del flagelo (Hossain y col, 1998). La osmolaridad de la solución debe ser la óptima para inducir la torsión helicoidal del flagelo sin que ocurra la lisis de la membrana plasmática; es decir, para que esta respuesta se produzca, la MP deberá estar íntegra y sin daño alguno; por lo cual, las células espermáticas con la MP dañada no experimentarán modificación en la forma del flagelo. Esta prueba ha sido desarrollada en varios mamíferos, incluyendo el bovino (Correa y Zavos, 1994; Revel y Mrode, 1994; Rota y col, 2000; Rubio y col, 2007), observando una correlación positiva y consistente (0,79) entre la tasa de no retorno en vacas y los resultados del HOST (Revel y Mrode, 1994); en contraste, Rota y col (2000) fallaron en demostrar que existe una correlación positiva entre esta prueba y la fertilidad in vitro. Hasta ahora, las pruebas HOST han sido diseñadas con soluciones de agua destilada que contienen citrato de sodio y fructosa a diferentes osmolaridades, incubándose en baño de María a 37 C por media hora, tanto en semen recién colectado como en semen criopreservado, concluyendo que la mejor osmolaridad se encuentra alrededor de 100 mosm/l, sin embargo, otros mencionan que 150 mosm/l es una alternativa viable y muy segura al evitar la lisis celular (Rubio y col, 2007). Por otro lado, se han hecho pocos intentos de conducir investigaciones que experimenten con otro tipo de materias primas distintas al citrato de sodio y fructosa que se sometan a diferentes condiciones de osmolaridad inferior a la fisiológica que podrían generar resultados similares o inclusive superiores utilizando alternativas viables y de muy bajo

3 costo; por lo tanto, es necesario diseñar nuevos protocolos que generen condiciones óptimas para obtener resultados de igual o de mayor precisión que los obtenidos con los protocolos convencionales que determinan la integridad de la MP del espermatozoide. En base a lo expuesto, se planteo la necesidad de comparar la sensibilidad de tres soluciones con diferentes condiciones osmolares (agua ultra pura: 0 mosm/l; agua + cloruro de sodio a 102 y 154 mosm/l) para establecer cual o cuales generan mejor respuesta.

4 JUSTIFICACIÓN Desde los años 80 se han diseñado diferentes soluciones hiposmóticas para evaluar la funcionalidad de la membrana plasmática del espermatozoide de mamíferos, las cuales son diseñadas principalmente con fructosa y/o citrato de sodio e incubadas con una muestra seminal a 37 C durante media hora o más, según el protocolo a seguir. Estas soluciones no son manufacturadas por empresas farmacológicas, sino que son diseñadas en los laboratorios de las universidades, utilizando los insumos señalados anteriormente y agua bidestilada de calidad garantizada. Para precisar la osmolaridad exacta de una solución se necesita un osmometro, el cual es costoso. Por otro lado, actualmente en Venezuela escasean muchos insumos utilizados en la industria farmacológica, además de que es difícil encontrar agua destilada de calidad para crear fórmulas magistrales y/o manufacturar productos, lo que hace más difícil formular estas pruebas. La utilización de soluciones hiposmóticas de cloruro de sodio a muy bajo costo (sueros de uso intravenoso) y a diferentes concentraciones hiposmóticas (102, 154, 252 mosm/l) se distribuyen con facilidad en el mercado farmacológico, ya que, son imprescindibles para la utilización ambulatoria u hospitalaria en pacientes con desordenes hídrico- electrolítico. Este hecho permite su fácil accesibilidad para realizar cualquier experimento o uso que se le quiera dar. En el mismo orden de ideas se hace interesante experimentar en busca de una variante óptima al test de endósmosis celular, que se pueda realizar en corto tiempo (<30 min.) y con materias primas de fácil adquisición, que a su vez se pueda implementar a nivel de granja o finca y que propicie resultados rápidos, repetibles y confiables. Es por ello que en este ensayo se propone comparar tres pruebas de endósmosis (HOST), dos de ellas utilizando las soluciones hiposmóticas de cloruro de sodio (102, 154 mosm/l) citadas anteriormente y una tercera con solución de agua bidestilada ultra pura (0 mosm/l), en la cual se incubará el semen por 5 min con el fin de determinar si podría ser una alternativa viable para valorar la funcionalidad de la membrana plasmática del espermatozoide de toro.

5 OBJETIVOS Objetivo general Comparar la sensibilidad de tres soluciones hiposmóticas a diferentes osmolaridades para valorar la integridad de la membrana plasmática del espermatozoide criopreservado de toro mediante el test de endósmosis. Objetivos específicos 1. Determinar cual solución hiposmótica proporciona la mejor valoración de la integridad de la membrana plasmática del espermatozoide de toro criopreservado mediante el test de endósmosis. 2. Determinar si existe una relación entre la vitalidad y motilidad individual cuantificada en la pajuela recién descongelada y los resultados obtenidos de valorar la integridad de la membrana plasmática del espermatozoide criopreservado de toro mediante el test de endósmosis.

REVISIÓN DE LITERATURA Valoración de la calidad espermática Para evaluar la viabilidad de los espermatozoides se debe llevar a cabo una serie de pasos y pruebas que evalúan diversos factores o funciones de la célula espermática. Asimismo como resultado del análisis seminal, podemos calificar a la muestra como apta o no apta para su uso en Inseminación Artificial (IA) (Vera, 2001). Al realizar la evaluación seminal en machos reproductores de la especie bovina es importante tomar en cuenta la edad, raza, estado nutricional, condición corporal, actividad sexual, método de colección, época y estado de salud del animal (Madrid-Bury y col., 2002). Pruebas de respuesta osmótica. Los espermatozoides como células eucariotas, presentan diversos mecanismos de adaptación a los cambios bruscos de osmolaridad del medio. Estos mecanismos involucran vías metabólicas complejas, como son todos los canales de iónicas ATP-asa depende del Na + /K + o el intercambio por Na + /H +, lo que implica la puesta en marcha de un complicado sistema de regulación por parte de al célula (Jeyendran y col., 1984). Por lo tanto, la capacidad de respuesta ante un estrés osmótico por parte del espermatozoide se encuentra relacionada directamente con la capacidad funcional general de esta célula y, por lo tanto será in buen indicador de su estado funcional general, por otra parte, la integridad del plasmalema no sólo es fundamental para el metabolismo del espermatozoide, sino que también lo es para una adecuada capacitación y reacción del acrosoma y, por lo tanto, para la fertilidad del macho (Yanagimachi, 1994). Bajo esta premisa, en los últimos 15 años se han desarrollado un conjunto de pruebas de calidad seminal basadas en las respuestas de los espermatozoides frente a un shock osmótico. Todas estas respuestas, de hecho, 6

7 pueden clasificarse en tres tipos, que describiremos a continuación: la prueba de hinchamiento hiposmótico (HOS test), la prueba de resistencia osmótica (ORT) y la prueba de resistencia hiperosmótica (HRT). Test de Hinchamiento Osmótico (HOST) Unas de las pruebas a nivel mundial más conocidas y aplicadas por Investigadores, Especialistas en Reproducción Animal, Médicos Veterinarios han mostrado interés al evaluar las células especializadas como el espermatozoide, mediante el Hiposmótic Swelling Test (HOST), descrita por (Jeyendran y col., 1984), esta prueba permite evaluar la funcionalidad de la membrana plasmática de los espermatozoides mediante la observación de alteraciones morfológicas que sufren las células espermáticas al ser expuestas a condiciones hipotónicas ocasionando un desequilibrio osmótico entre el medio extracelular y el intracelular, situación que el espermatozoide trata de vencer difundiendo agua al compartimento intracelular y como consecuencia la célula un aumenta en su volumen y se hincha (Bredderman y Foote, 1969; Rota y col., 2000), a su vez provocando la torsión helicoidalmente del flagelo (Vázquez y col., 1997). Este mecanismo es realizado para tratar de equilibrar su contenido iónico con el del medio externo. Este hinchamiento, regulado como se ha descrito en el párrafo anterior está relacionado por los mecanismos con la bomba de intercambio iónico e hídrico en las células eucariotas. Las células con la membrana física o funcionalmente dañada no experimentarán cambios en la forma del flagelo (Pérez-Llano y col., 1999). Ahora bien, la estructura del espermatozoide hace que el hinchamiento hiposmótico se manifiesta de una manera única. En concreto, los espermatozoides sometidos a un estrés hiposmótico manifiestan un enrollamiento de sus colas. Este enrollamiento puede ser más o menos intenso o adquirir diversas formas dependiendo de una gran variedad de factores, desde el tipo individual de respuesta osmótica hasta la composición del medio.

8 El HOST se ha aplicado en diversas especies; en humanos (Jeyendran y col., 1992; Van den Saffele y col., 1992), caninos (Kumi-Diaka, 1993; Rodríguez-Gil y col., 1994; Sánchez y col., 2002), equinos (Caiza de la Cueva y col., 1997), cerdos (Gadea y col., 1998; Pérez Llano y col., 1998; Quintero-Moreno y col., 2004), toros (Correa y Zavos, 1994; Correa y col., 1997; Rubio-Guillén y col., 2007; Quintero-Moreno y col., 2011) con resultados variables. Así, mientras algunos autores como Vázquez y col. (1997), observaron una buena correlación entre este test y la calidad seminal (en cerdos), otros resultados no muestran esta relación, debido a un bajo porcentaje de reacción al medio hiposmótico (flagelos flectados). Esta variabilidad parece indicar la existencia de factores individuales que controlan en alguna medida la capacidad de hinchamiento del espermatozoide porcino frente un medio hiposmótico. A pesar de estas discrepancias el HOST puede tener su utilidad como donador de información práctica debido básicamente a su facilidad de aplicación e interpretación, así como la rapidez al realizar dicho test (Campi y col., 2004). Tes de Resistencia Osmótica (ORT). El ORT, se basa en la capacidad que tiene el acrosoma de resistir un shock hiposmótico. Para ello, se evalúa el estado de la membrana acrosomal del espermatozoide. Esto hace que la evaluación morfológica del acrosoma a groso modo sea mucho más fácil que en otras especies, como el perro, o el caballo (Drevius y Eriksson, 1966). Esta particularidad permite la observación directa de la integridad acrosomal de manera rápida y a muy bajo precio. En estas condiciones, la valoración del acrosoma se realiza mediante la visualización del borde acrosomal, lo cual se aprecia muy bien con un microscopio óptico convencional con objetivo de inmersión, sin utilizar ningún sistema de contraste de fases (Quintero-Moreno y col., 2004). Un acrosoma intacto se manifiesta por un borde acrosomal uniforme, bien delimitado y con un cierto grosor, que marca el límite externo del acrosoma. Cualquier observación irregular del borde del acrosoma, bordes discontinuos o ausentes implica la presencia

9 de alguna alteración en la estructura celular. Teniendo en cuenta esto, el ORT determina la proporción de acrosomas alterados en espermatozoides incubados en un medio isosmótico respecto a otros incubados en un medio equivalente hiposmótico. Recientemente se ha tratado de implementar la misma metodología en semen de bovino criopreservado y los resultados son promisorios (Rubio- Guillen y col., 2009). El ORT posee un buen valor predictivo para evaluar el espermatozoide de cerdo, ya que es una célula grande y tiene la peculiaridad de que la membrana del acrosoma se aprecia muy bien utilizando la tinción de eosina-nigrosina (Bamba, 1988), lo cual es transferible al bovino al tener un espermatozoide muy parecido al cerdo. Tes de Resistencia Hiperosmótica (HRT). El test de (HRT), consiste en evaluar la resistencia sobre la membrana acrosomal del espermatozoide al someterlo a un cambio brusco de la osmolaridad, incubado por un periodo de 10 minutos desde una solución hiperosmótica de más de 1000 mosm/l, para luego tratar de equilibrar la osmolaridad al someterla a un medio isosmótico de 300 mosm/l y observando las reacciones acrosómica. Estudios realizados por (Liu y Foote, 1998), han encontrado que las células espermáticas bajo condiciones hiperosmótica afecta la integridad de la membrana espermática y su motilidad. Otros hallazgos, manifiestan que cualquier deterioro en la membrana plasmática ha sido asociado con la pérdida de la viabilidad espermática. Sin embargo, investigaciones (Rigau y col., 1995; Caiza de la Cueva, 1998), concluyen que en la medida que ocurran más reacciones acrosómica o pérdidas completas del acrosoma luego de la exposición del semen, se relacionaron una menor resistencia al cambio osmótico y por ende, la célula espermática podría poseer mayor susceptibilidad a los procesos de congelación y por ende repercute en la capacidad fecundante a nivel de campo.

10 MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación del experimento. El experimento se encuentra dividido en dos fases, la primera comprende los procedimientos de recolección, procesamiento y criopreservación de los eyaculados y la segunda fase corresponde a la valoración del semen descongelado. La primera fase fue realizado en la empresa: Venezolana de Inseminación Artificial y Transferencia de Embriones, C.A. (VIATECA ), ubicada en el Km. 104 de la carretera que conduce a Perijá, Villa del Rosario, Estado Zulia, a 100msnm (COPLANARH, 1975), entre las coordenadas 10º 15 latitud norte y 72º 25 longitud oeste. Esta zona se clasifica agro ecológicamente como bosque seco tropical con temperaturas anuales que oscilan entre 28 y 29,5ºC, con intervalo de precipitación anual entre 1040,4 y 1100 mm, siendo los meses con mayor precipitación Abril, Mayo, Octubre y Noviembre, y los meses más secos Diciembre, Enero, Febrero y Agosto. Una vez procesado el semen, almacenado en pajuelas y conservados en termos de nitrógeno se trasladaron para su estudio al laboratorio de Andrología de la Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV) de la Universidad del Zulia (LUZ), ubicado en Maracaibo, estado Zulia donde se realizó la segunda fase del experimento. Unidades experimentales. La unidad experimental corresponde a cada espermatozoide valorado de la muestra seminal de cada reproductor. En total se evaluaron 100 espermatozoides por cada parámetro establecido en este experimento, los cuales serán descritas mas adelante. Se valoraron 36 pajuelas de semen descongelado provenientes de 12 toros. Estos toros corresponderán a las razas Holstein (4), Brahman (4) y mestizos Holstein x

Brahman (4), los cuales fueron mantenidos bajo el mismo programa de manejo sanitario y alimentación. 11 Colección y criopreservación del semen (fase 1). Los eyaculados fueron colectados los días martes y viernes entre las 5:00 y 8:00 de la mañana, mediante vagina artificial. Después de la evaluación seminal de rutina (volumen, motilidad masal e individual y concentración espermática), las muestras clasificadas como idóneas para congelar eran diluidas con un diluyente (A), que contenía yema de huevo al 20,4 %, hidroximetilaminometano (TRIS), ácido cítrico, fructosa, además de antibióticos (Tilosina 0,56%, Linco-Espectina 0,56%, Gentamicina 0,74%) en una solución final con ph ajustado a 6,8 y que se agregaba al semen para ser refrigerada a 5ºC durante 2 horas. Posteriormente se agregaba el diluyente B, solución similar a la anterior, pero que contenía un azúcar-alcohol trihidrico como crioprotector (Glicerol al 12%) y antibióticos al 5%. Tras unir el diluyente A+B, el semen diluido era identificado y envaso automáticamente en pajuelas de 0,50 ml, con una concentración espermática mínima de ~30x10 6 espermatozoides/ml, para posteriormente ser congelado en vapores de nitrógeno líquido (NL), 4 cm sobre la superficie durante 10 minutos y luego se sumergieron en NL a 196 C. Las pajuelas permanecieron por un período mínimo de una semana en NL antes de ser descongeladas. La descongelación seminal se realizo en baño de María (37ºC) por 30 segundos y se estabilizaron por 5 minutos antes de la evaluación. Una vez garantizada su calidad, la gran mayoría se comercializaba y unas 20 pajuelas por toro eran trasladadas al Laboratorio de Andrología (FCV-LUZ) para comenzar con la segunda fase del experimento. Evaluación del semen criopreservado (fase 2). Para descongelar cada pajuela de semen, se sumergió en baño de maría (modelo YCW-03S. Taipei, Taiwan) a 37 C durante 30 seg., luego se vertió su

contenido en un vial de microcentrífuga de 1,5 ml, ubicado en una gradilla sumergida en el mencionado baño de maría. 12 Evaluación de la motilidad espermática. Se extrajo 10 μl de semen descongelado y se vertió sobre un portaobjetos precalentado a 37 C sobre una platina termo-regulable (Osaka, modelo OK51, España) y se procedió a colocar un cubreobjetos para estimar el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva, al observar varios campos con un microscopio óptico a 400X (Globe, LEM 1600, Alemania). La valoración se realizará porcentualmente como sigue: Movimiento progresivo muy lento y errático < 30%. Movimiento progresivo lineal lento y generalizado 31 50%. Movimiento progresivo lineal moderadamente rápido 51 70%. Movimiento progresivo lineal rápido >80%. Evaluación de la Vitalidad. Se extrajo 10 μl del semen recién procesado y se mezcló con una gota de igual volumen del colorante EN (Swanson y Bearden, 1951), en un portaobjeto temperado a 37ºC ubicado sobre una platina termo-regulable (Osaka, modelo OK51, España), inmediatamente se homogenizó suavemente y se hizo un extendido fino (frotis), dejando secar por 30 minutos. Los frotis se observaron en el microscopio óptico (Globe, LEM 1600, Alemania) con el objetivo de inmersión (1000X) y se cuantificó un total de 100 espermatozoides con el fin de valorar el porcentaje de espermatozoides vivos en la muestra seminal. La proporción de espermatozoides muertos con membranas plasmáticas permeables se tiñen, y sus cabezas se observaban de color rosado en sus diferentes tonalidades, que van desde el rojizo hasta el rosado pálido, en

13 cambio, los espermatozoides vivos presentan las cabezas de color blanco y/o claros, lo cual es producto de que tienen sus membranas plasmáticas intactas, lo cual no permite el paso del colorante. (Swanson y Bearden, 1951). Evaluación de la integridad de la membrana plasmática del espermatozoide mediante el la prueba de endósmosis (HOST). Para la valoración de la funcionalidad espermática se utilizó el test de hinchamiento hiposmótico o endósmosis celular (HOST). En el procedimiento se utilizaron 3 soluciones comerciales a diferentes osmolaridades (0, 102 y 154 mosm/l) incubadas a 37 C en baño de María. La solución con 0 mosm/l (A: agua ultra pura) se expuso durante 5 minutos, mientras que las 2 restantes con diferentes concentraciones de cloruro de sodio se incubaron durante 30 minutos. La solución B consto de una solución hiposmótica con una osmolaridad de 102 mosm/l (51mEq/L Na + y 51mEq/L Cl - ), mientras la otra solución (C) presento una osmolaridad de 154 mosm/l (77mEq/L Na + y 77mEq/L Cl - ). Luego de describir la utilización de las soluciones hiposmótica se descongelaron las muestras seminales (pajuela) por un período de 30 segundos en baño de María a 37Cº, posteriormente se preparan 3 viales de 1,5 ml para cada una de las muestras seminales. Seguidamente se vertió en cada uno de los viales 1000 μl de la solución A (cero osmolar), B (102 mosm), C (154 mosm) y 100 μl del semen descongelado, luego la solución A + semen descongelado se incubará en baño de maría por 5 min., mientras que la solución B y C + semen descongelado será expuesto por 30 minutos en baño de María a 37 ºC. Al termino del tiempo, se obtendrán 10 μl de la solución (semen + medio) para mezclar suavemente con 10 μl del colorante eosina-nigrosina, sobre un portaobjetos a 37 C previamente temperado, seguidamente se realizó el extendido y se dejó secar para la observación al microscopio óptico convencional.

14 Posteriormente se cuantificó la integridad de la membrana plasmática del espermatozoide al observar la vitalidad conjuntamente con las modificaciones morfológicas acaecidas o no en el flagelo y generadas por los medios hiposmóticos utilizados en el ensayo. La asociación entre estas dos pruebas generaron 4 grupos de acuerdo a las siguientes características: TIPO I (EM/FNR-Host-) = Espermatozoides muertos con flagelo no reaccionado TIPO II (EV/FNR-Host-) = Espermatozoides vivos con flagelos no reaccionado. TIPO III (EM/FR-Host+) = Espermatozoides muertos con flagelos reaccionado. TIPO IV (EV/FR-Host+) = Espermatozoides vivos con flagelos reaccionado. Análisis estadístico: Todos los datos obtenidos fueron analizados mediante el Statistical Analysis System software 8.2, para Windows (SAS Inst. Inc.; Carry, NC. USA. 2002). Las variables evaluadas de las muestras seminales descongeladas se analizarán utilizaron el Análisis de la Varianza (Proc ANOVA). Cuando se encontraron diferencias entre las medias se cuantificó el efecto mediante el procedimiento de medias (DUNCAN). Para cuantificar las relaciones existente entre los test HOST y la motilidad individual se utilizó el test de rangos de Spearman. Para los dos análisis estadísticos, el nivel de significancia se estableció en P<0.05.

RESULTADOS Valoración de la calidad seminal mediante pruebas rutinarias de laboratorio en muestras criopreservadas de semen de toro. Se evaluaron 36 pajuelas provenientes de 12 toros de razas Holstein (4), Brahman (4) y mestizos Holstein x Brahman (4). De cada toro se examinaron tres pajuelas. Las medias generales (μ) y el error estándar (EE) de la motilidad individual y vitalidad, las cuales fueron características evaluadas en semen criopreservado se muestran en la tabla 1. Se pudo observar el movimiento individual de las células con el fin de determinar el porcentaje de motilidad individual (MI), siendo de 40,83 ± 2,94, el cual es muy similar al porcentaje de espermios vivos para las mismas muestras evaluadas (43,58 ± 3,27). Se puede evidenciar mediante estos parámetros valorados que la calidad en semen criopreservado al ser comparados con los valores establecidos para la especie luego de la post descongelación, se encuentran en el limite inferior recomendado para los toros destinados a inseminación artificial (Madrid-Bury, 2003; Vera, 2003), a pesar de que la MI este por encima del 30% (valor limite para descartar una muestra). Tabla 1. Características seminales en muestras de semen de toro criopreservadas Parámetro Unidad de Intervalo de Media ± EE medida Confianza al 95% Motilidad Individual % 40,83 ± 2,94 34,36 47,3 Vitalidad % 43,58 ± 3,27 36,38 50,78 n= 36 muestras seminales que corresponden a 12 toros. 15

16 Evaluación de la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides mediante el test de endósmosis (HOST) La integridad funcional de la membrana plasmática de los espermatozoides criopreservados de toros fue valorada mediante el test de endósmosis (HOST), en donde los espermatozoides fueron sometidos a condiciones osmolares inferiores (0, 102 y 154 mosm/l) a la normal (280-320 mosm/l) y la respuesta de positividad al HOST, fue evaluada en base al porcentaje de flagelos reaccionados (FR). Estando estos resultados relacionados con los la vitalidad de los espermatozoides, la cual fue valorada implementando la tinción Eosina-Nigrosina (E-N), permitiendo evaluar la integridad estructural de la membrana plasmática de los espermatozoides. En la tabla 2 se puede observar el efecto que tiene el test de endósmosis (HOST) sobre el parámetro estudiado vitalidad y flagelos reaccionados, encontrándose un diferencia estadística muy significativa (P<0,01) entre la osmolaridad de 0 con las condiciones osmolares de 102 y 154. Sin embargo, no se encontró una diferencia estadística significativa entre las diferentes condiciones osmolares evaluadas en el parámetro de vitalidad, siendo los resultados obtenidos de 38,41 ± 3,20; 44,91 ± 3,20 y 41,25 ± 3,20, respectivamente. Tabla 2. Efecto del test de endósmosis (HOST) sobre los parámetros que determinan la calidad seminal en semen criopreservado de toros Parámetros Condición Osmótica (mosm/l -1 ) 0 102 154 Vitalidad (%) 38,41±3,20 a 44,91±3,20 a 41,25±3,20 a Flagelos reaccionados (%) 32,16±4,17 b 49,75±4,17 a 56,33±4,17 a n= 36 muestras seminales que corresponden a 12 toros. (a,b): letras distintas en la misma fila implica diferencias significativas (p<0,01).

17 En la tabla 3 se observan los resultados del test de endósmosis clasificados de la siguiente manera: TIPO I, el cual hace referencia al porcentaje de espermatozoides muertos con flagelo no reaccionado y/o negativos al HOST (EM/FNR-HOST-); TIPO II, es el porcentaje de espermatozoides vivos con flagelo no reaccionado y/o negativos al HOST (EV/FNR-HOST-); TIPO III, el cual abarca el porcentaje de espermatozoides muertos con flagelo reaccionado y/o positivos al HOST (EM/FR-HOST+), y por último, el considerado mas importante, el TIPO IV haciendo referencia al porcentaje de espermatozoides vivos con flagelo reaccionado y/o positivos al HOST (EV/FR-HOST+). También se aprecia el coeficiente de variación para cada condición osmolar evaluada, diferenciada entre los resultados globales del HOST y discriminada en el tipo de integridad de membrana IV para cada osmolaridad evaluada. Tabla 3. Respuesta de los espermatozoides criopreservados de toro sometidos al test de endósmosis (HOST) bajo diferentes condiciones de osmolaridad y teñidos mediante la coloración de eosina-nigrosina. Tipos de Integridad de Condición Osmótica (mosm/l -1 ) membrana (%) 0 102 154 Tipo I (EM/FNR-HOST-) 37,58±3,13 a 31,58±3,29 a 31,83±2,93 a Tipo II (EV/FNR-HOST-) 29,66±4,59 a 18,58±4,49 b 11,83±1,77 b Tipo III (EM/FR-HOST+) 23,41±4,29 ab 23,41±3,93 ab 26,91±3,37 a Tipo IV (EV/FR-HOST+) 8,75±1,56 b 26,33±3,46 a 29,41±2,67 a CV (HOST) 52,03 55,93 39,74 CV (Tipo IV) 62,04 45,63 31,47 EV: espermatozoide vivo, EM: espermatozoide muerto, FR: flagelo reaccionado, FNR: flagelo no reaccionado, CV: coeficiente de variación de la prueba. Se evaluaron 200 espermatozoides en cada muestra seminal (n=36) (a,b): letras distintas en la misma fila implica diferencias significativas (p<0,01).

18 No se encontró una diferencia estadística significativa (p<0,01) en el TIPO I, entre las 3 condiciones osmolares estudiadas, obteniendo que el mayor porcentaje de espermatozoides muertos con flagelo no reaccionado y negativos al HOST se reflejo en la osmolaridad 0, siendo de 37,58 ± 3,13. En los TIPO II si hubo una diferencia estadística significativa entre las condiciones osmolares evaluadas (P<0,01), siendo la condición osmolar 0 mosm/l, la que obtuvo el mayor porcentaje de espermios vivos y con respuesta negativa al HOST, así como también la que difirió de la 102 mosm/l y 154 mosm/l, obteniendo como μ ± EE los siguientes resultados: 29,66 ± 4,59; 18,58 ± 4,49 y 11,83 ± 1,77, respectivamente. Para el TIPO III, no se encontró una diferencia estadística significativa (P>0,05) entre las condiciones osmolares 0 y 102, pero si entre estas con la 154 (P<0,05), sin embargo, no difirieron mucho, siendo similares los porcentaje entre las tres condiciones osmolares, obteniendo el mayor porcentaje de espermios muertos y positivos al HOST, la condición osmolar de 154 mosm/l, siendo de 26,91 ± 3,37. Por ultimo, se encontró una diferencia estadística significativa (P<0,01) entre las condición osmolar 0 (8,75 ± 1,56) con las condiciones osmolares 102 mosm/l y 154 mosm/l (26,33 ± 3,46 y 29,41 ± 2,67, respectivamente), siendo la condición osmolar 0 mosm/lt -1 la que obtuvo un menor numero de espermios vivos con flagelo reaccionado y respuesta positiva al HOST. En los resultados que se presentan en la tabla 3, se encuentra que hay un mayor porcentaje de espermios muertos al ser la sumatoria del TIPO I y TIPO III, y al compararla con la sumatoria del TIPO II y TIPO IV, la cual representaría el porcentaje de espermios vivos. Al evaluar el efecto que tuvo el test de endósmosis solo sobre los espermios vivos, se nota que la condición osmolar que obtuvo mayor significancia fue la 154 mosm/l, ya que dentro del porcentaje de espermios vivos, fue la que obtuvo mayor numero de espermios positivos al HOST, así mismo, se puede evidenciar que la condición osmolar 0 mosm/l es la más perjudicial para valorar la integridad de la membrana plasmática, ya que fue la que obtuvo menor porcentaje de espermios vivos con respuesta positiva al HOST. La osmolaridad 0 mosm/l fue la que obtuvo mayor porcentaje de espermios vivos y negativos al HOST (TIPO II) y el menor porcentaje de espermios vivos y positivos al HOST (TIPO IV), por lo tanto es la menos recomendada

19 para valorar la integridad funcional de la membrana plasmática de los espermatozoides, y esto lo corrobora el coeficiente de variación, siendo el mas alto de 62,04, es decir el que tiene la mayor variabilidad. El coeficiente de variación más bajo (31,47) representa la mejor osmolaridad para valorar la integridad funcional del plasmalema, y este corresponde a la condición osmolar 154 mosm/l. Correlación entre los parámetros que valoran la calidad seminal en muestras de semen de toro criopreservadas. En la tabla 4 se puede observar que no existe correlación entre los parámetros de vitalidad espermática, motilidad individual y la prueba de HOST en las condiciones osmolaridades estudiadas (0, 102 y 154 mosm/l) (p<0,05). Sin embargo, si se evidenció una correlación significativa entre la condición osmolar de 0 mosm/l con la de 102 mosm/l (r = 0,64; P<0,05), lo cual quiere decir que la respuesta y positividad al HOST están estrechamente asociadas entre la condición osmolar de 0 y 102 mosm/l. Tabla 4. Correlación de Pearson entre los test de endósmosis celular y las características de calidad seminal del semen criopreservado (n=36) Parámetro HOST (102) HOST (154) Motilidad Vitalidad HOST (0 ) 0,64* NS NS NS HOST (102) NS NS NS HOST (154) NS NS Motilidad P<0,05. NS= No significativo NS

DISCUSIÓN Durante el proceso de descongelación de una pajuela, los espermatozoides se encuentran sometidos nuevamente a una acción perjudicial, hecho que repercute sobre la capacidad fecundante del semen que será utilizado IA. Empero, previo al almacenamiento definitivo de dosis seminales, se debe proceder a la evaluación exhaustiva de las muestras criopreservadas, para así, de esta manera poder determinar si una dosis al ser descongelada resulta con una calidad aceptable para su comercialización según las características mínimas establecidas (Crespilho y col., 2009). En los centros de IA, la valoración del porcentaje de motilidad individual es la prueba que se utiliza con más frecuencia para estimar la viabilidad de los espermatozoides en el semen descongelado (Villanova y Gatica, 2002), sin embargo, la determinación de la motilidad post descongelación por si sola, no es capaz de predecir el nivel fecundante de una muestra de semen para IA (Januskauskas y Rodríguez Martínez, 1995). En el presente trabajo, al valorar la muestras seminales criopreservadas, se obtuvo una motilidad individual de 40,83 ± 2,94, encontrándose dentro de los valores establecidos por Chenoweth y col. (1993), el cual reporto que para toros adultos, la motilidad espermática no debe ser inferior al 30%. En trabajos anteriores se han registrado valores similares a los descritos en este ensayo (40%) para la especie en semen post descongelado (Rubio-Guillen y col., 2009). Es importante destacar que, existe una variabilidad entre los parámetro de motilidad individual, lo cual estas diferencias se deben a que no todos los toros responden igual ante el proceso de criopreservación (Zhu y Liu, 2000; Prathalingam y col, 2005). Así mismo se reporta que los animales en reposo sexual y con patologías testiculares y del epidídimo, producen eyaculados con baja motilidad espermática (Madrid-Bury, 2003), lo cual se descarta en este ensayo como causal de las diferencias entre toros. 20

21 La perdida de la motilidad flagelar está directamente relacionada con alteraciones del axonema e indirectamente con una disminución en la producción ATP. Es sabido que la motilidad progresiva y lineal es estimulada tras la eyaculación y es modulada durante el tránsito a través del tracto reproductivo de la hembra (Rodríguez-Martínez y col., 1997), sin embargo, el estrés de la criopreservación infringe daños irreversibles que propician la pérdida de este patrón de motilidad. El estado de la membrana plasmática marca la integridad morfológica y funcional de la célula (Rodríguez-Martínez y col., 1997), siendo la vitalidad de la célula espermática determinada al valorar su integridad a través de la capacidad de la membrana plasmática para excluir ciertas sustancias extracelulares como tintas, presumiéndose que, solamente los espermatozoides viables mantienen las membranas intactas, siendo capaces de interactuar con oocito para poder transportarse, capacitarse y fecundar (Januskauskas y Rodríguez-Martínez, 1995; Rodríguez-Martínez y col., 1997). Los resultados de vitalidad obtenidos en el presente estudio (43,58 ± 3,27) fueron similares (42.84 ± 8.92) a los reportados por Felipe-Pérez y col. (2008), pero fueron inferiores (72,80 ± 3,81) a los reportados por Rubio-Guillen y col. (2009) para muestras de semen criopreservadas. Es conocido la que la adición del crioprotector, el proceso de enfriamiento en sí, la congelación, el almacenamiento en nitrógeno líquido y la descongelación causan un marcado deterioro en la membrana plasmática del espermatozoide, viéndose reflejado en una disminución viabilidad cuando se evalúa el semen descongelado (Zhu y Liu, 2000). Aún cuando algunas técnicas para evaluar la morfología mediante una tinción supravital (Eosina-Nigrosina) proveen una información del daño estructural de la membrana plasmática, estos resultados no siempre están correlacionados con la fertilidad del toro en cuestión (Rodríguez-Martínez, 2000). Es debido a esto, que en el presente estudio se considero importante la asociación de la vitalidad con el test de endósmosis, ya que de esta manera se puede valorar no solo la integridad estructural de la membrana plasmática, sino que también se evalúa su integridad funcional.

22 Los resultados reportados en nuestro estudio arrojaron que no hubo una diferencia estadística significativa (P>0,05) para el parámetro de vitalidad en las osmolaridades implementadas (0, 102 y 154 mosm/l, ver tabla 2), pero al visualizar los valores obtenidos en la vitalidad y al compararlos con el porcentaje de flagelos reaccionados para cada osmolaridad, se obtuvo que existe una diferencia numérica entre ambos valores (vitalidad vs. flagelos reaccionados), siendo la mas notoria para la condición osmolar de 154 mosm/l, en donde la vitalidad fue de 41,25 ± 3,20 y el porcentaje de espermios positivos al HOST fue de 56,33 ± 4,17, lo cual nos indica que el porcentaje incluye tanto espermios vivos como muertos. En base a esto, fue modificada la prueba original utilizada por Jeyendran y col., (1984) para estudiar la funcionalidad de la membrana plasmática luego de la incubación en un medio hiposmótico (HOST), dicha modificación se realizo basándonos en los estudios realizados por Quintero-Moreno y col. (2011), el cual introdujo una modificación a la técnica ya descrita, donde se combina este test con una tinción supravital. Realizando de esta manera una sola prueba con la inclusión de Eosina-Nigrosina (EN) a la prueba HOST (HOST-EN), y así, también poder identificar cuatro tipos de espermatozoides según la integridad de la membrana y su función. Es así como en la tabla 3 se hizo una clasificación en base al porcentaje de espermios vivos y muertos, y a la respuesta del HOST bien sea positiva o negativa pudiendo obtener de esta manera la información más detallada, siendo de suma importancia, ya que en base a la cantidad de espermios vivos y positivos al HOST, se verifica la integridad tanto estructural como funcional de la membrana plasmática del espermatozoide. En el presente estudio, la respuesta al HOST no fue favorable para la osmolaridad de 0 mosm/l (32,16%), en cambio si lo fue para la de 102 mosm/l (49,75%) y 154 mosm/l (56,33%) en los toros evaluados. Dichos porcentajes se encuentran relacionados con los de vitalidad, siendo de 38,41%, 44,91% y 41,25% para las osmolaridad de 0, 102 y 154 mosm/l respectivamente. Al precisar la solución de 154 mosm/l hay que denotar que, en este estudio se describen valores de HOST más altos que los reportados en otro estudio (42,90%) (Nava-Trujillo, 2011), pero mas bajos para la vitalidad (53,19%); sin embargo, con la solución 0 mosm/lt -1 se aprecian valores mas altos tanto para el HOST (54,85%) como para la vitalidad (45,95%). El resultado de

23 HOST obtenido en nuestro estudio para la condición osmolar de 154 mosm/l, fue similar (50,82%) al reportado por Rubio-Guillen y col. (2009). Según los tipos de integridad de la membrana plasmática para las tres condiciones osmolares evaluadas, el porcentaje de espermios que se encontró en el TIPO I (EM/FR-HOST-), es la subpoblación de espermatozoides que representa el grupo de no-viable con defectos de membrana en las regiones de la cabeza y la cola del espermatozoide. La membrana plasmática del espermatozoide es el sitio primario donde las lesiones se producen durante la congelación-descongelación del semen y la interrupción de la misma en la cabeza y cola del espermatozoide, afecta la función normal de los mismos (Quintero- Moreno y col., 2011). En el TIPO II (EV/FNR-HOST-) esta la subpoblación de espermatozoides que representa el grupo de espermatozoides vivos con la membrana de la cola dañada. El TIPO III (EM/FR-HOST+) muestra los espermios no-viables, pero que aún reaccionan al HOST. Esto puede explicarse por el hecho de que la prolongación del estrés de los espermatozoides ante el sometimiento de osmolaridades diferentes a la normal, puede conducir a efectos irreversibles en la membrana celular y la muerte celular. Por otra parte, los espermios no viables puede exhibir una exposición espontánea de reacción flagelar, antes de estar en la solución HOST y por lo tanto puede ser considerado como respuesta positiva al HOST cuando en realidad ya eran inviables (Quintero-Moreno y col., 2011). Por ultimo en TIPO IV (EV/FR-HOST+), es el grupo de espermatozoides viables con membrana intacta. El uso de la prueba HOST- EN en este ensayo se apoya en las investigaciones previas realizadas en los toros (Correa y Zavos, 1994; Quintero-Moreno y col., 2011) donde se observó una correlación significativa entre la prueba HOST y la viabilidad mediante el uso de la tinción supravital Eosina-Nigrosina. Al comparar las respuestas de los espermatozoides criopreservados de toro sometidos al HOST-EN bajo la condición osmolar de 154 mosm/l en nuestro estudio, con resultados reportados por Quintero-Moreno y col (2011) para la misma osmolaridad, tenemos una gran diferencia porcentual, siendo nuestros resultados mas favorables para el TIPO II, teniendo un menor porcentaje de espermios vivos y negativos (11,83%) a diferencia de lo reportado por ellos (28.5%), pero fue menos favorables para el TIPO I