Espectrometría de masas Fundamentos y teoría CONSTRUYENDO UNA CIENCIA MEJOR ENTRE AGILENT Y USTED

Espectrometría de masas Fundamentos y teoría CONSTRUYENDO UNA CIENCIA MEJOR ENTRE AGILENT Y USTED 1

Agilent Technologies es una empresa comprometida con la comunidad educativa y no duda en ofrecer acceso a materiales de su propiedad. Esta presentación ha sido creada por Agilent Technologies con fines exclusivamente educativos. Si desea utilizar las imágenes, los esquemas o los dibujos para otros fines distintos, póngase en contacto previamente con Agilent Technologies. 2

Introducción La espectrometría de masas (MS) es una técnica de química analítica que ayuda a identificar la cantidad y tipo de compuestos químicos presentes en una muestra midiendo la relación masa/carga y la abundancia de iones en fase gaseosa. Un espectro de masas (espectros) es un gráfico de la señal del ión en función de relación masa/carga. A partir de los espectros, se utilizan la masa del ión molecular y los fragmentos para determinar la composición elemental o la firma isotópica de un compuesto. Esta información se utiliza para determinar las estructuras químicas de las moléculas, como los pesticidas o péptidos. La espectrometría de masas funciona ionizando los compuestos químicos para generar moléculas cargadas o fragmentos de moléculas y medir su relación masa/carga. Fuente: Wikipedia 3

Introducción Ganador del Premio Nobel de Tecnología John Fenn y Koichi Tanaka fueron galardonados con el Premio Nobel de Química en 2002 por el desarrollo de dos tecnologías de ionización suave: Tecnología por electrospray, Dr. Fenn Desorción láser suave, Dr. Tanaka Sala de Conciertos, Estocolmo, Suecia, Dic. 2002 El Dr. Fenn recibiendo su Premio Nobel del Rey de Suecia 4

Introducción Consideraciones básicas Masas y espectrometría de masas Pasos fundamentales Funcionamiento Ionización Impacto electrónico Ionización química Consideraciones de la muestra (LC/MS) Electrospray Ionización química a presión atmosférica Fotoionización a presión atmosférica Ionización multimodo MALDI ICP Funcionamiento Analizador de masas Cuadrupolo simple Triple cuadrupolo Trampa de iones TOF (Tiempo de vuelo) Resultados Espectro de masas Cuadrupolo simple frente a TOF Iones con carga múltiple y deconvolución Más información Página web de Agilent para instituciones académicas Publicaciones 5

Introducción Consideraciones básicas Los elementos se pueden identificar de manera inequívoca por su masa. La espectrometría de masas es un método analítico para medir el peso molecular o atómico. Los compuestos, formados por distintos elementos, pueden distinguirse por su masa: Glucosa C 6 H 12 O 6 PM: 180,1559 g/mol Penicilina C 16 H 18 N 2 O 4 S PM: 334,39 g/mol Fuente: Tabla periódica, póster SI-0186 6

Introducción Masas y espectrometría de masas La masa media de una molécula se obtiene sumando las masas atómicas medias de los elementos que la forman. Masa media del agua (H 2 O): 1,00794 1,00794 15,9994 = 18,01528 Da La masa monoisotópica es la suma de las masas de los átomos de una molécula utilizando la masa en reposo, en estado fundamental, no unida, del isótopo principal (más abundante) de cada elemento en lugar de la masa media isotópica. La masa monoisotópica se expresa generalmente en unidades de masa atómica unificada. La masa exacta (más correctamente, la masa exacta medida) es una masa determinada experimentalmente que permite determinar la composición elemental. Para las moléculas con masa por debajo de 200 u, la precisión de 5 ppm es normalmente suficiente para determinar de forma única la composición elemental. Fuente: Wikipedia 7

Intensity Introducción Pasos fundamentales Procedimiento de MS típico: Se ioniza la muestra (sólida, líquida, gaseosa) Durante la ionización, las moléculas de la muestra podrían romperse en fragmentos cargados Los iones se separan según su relación masa/carga (m/z) Los iones se detectan mediante un mecanismo capaz de detectar partículas cargadas (p. ej. multiplicador de electrones) Los resultados se muestran como espectros de abundancia relativa como una función de la relación m/z La identificación se produce mediante la correlación de masas conocida con masas identificadas o mediante un patrón de fragmentación característico Muestra Ionización (positiva o negativa) Manipular según la relación masa/carga (o el tamaño a cargar) Detección m/z 8

Ionización Antes de que se pueda analizar la masa de la muestra, debe desionizarse en la fuente de iones. Introducción de muestras gaseosas: Ionización electrónico (EI) Ionización química (CI) Introducción de muestras líquidas: Ionización de electrospray (ESI) Ionización química a presión atmosférica (APCI) Fotoionización a presión atmosférica (APPI) Ionización multimodo (MMI) Desorción/ionización de matriz asistida por láser (MALDI) Plasma acoplado inductivamente (ICP) 9

Peso molecular Funcionamiento Ionización La polaridad de los analitos determina la fuente de ionización. 100.000 ESI ESI APPI Ionización de electrospray Fotoionización a Presión Atmosférica APPI GCMS APCI APCI Ionización Química a Presión Atmosférica GC/MS Cromatografía de gases/ Espectrometría de masas 10 no polar Polaridad del analito muy polar 10

Ionización Impacto electrónico (EI) El impacto electrónico (EI) es el método más común de ionización en cromatografía de gases (GC). Las moléculas que salen del cromatógrafo de gases son bombardeadas por un haz de electrones (70 ev) que elimina un electrón de la molécula lo que da como resultado un ión cargado. CH 3 OH 1 electrón CH 3 OH 2e - Ión molecular El EI normalmente produce moléculas iónicas de una sola carga y fragmentos iónicos (las partes más pequeñas de las moléculas originales) que se utilizan para la elucidación de estructuras. CH 3 OH CH 2 OH H o CH 3 OH CH 3 OH Fragmento iónico Un electrón o fotomultiplicador detecta los iones separados. El espectro de masas generado traza la intensidad de la señal a una relación m/z dada. 11

Ionización Impacto electrónico (EI) La interfaz GC/MS funciona a temperaturas altas. Cubierta del calentador Aislamiento Cámara de ionización Columna Cámara del analizador MS Horno de GC Conjunto calentador/sensor El extremo de la columna sobresale de 1 a 2 mm en la cámara de ionización. Interfaz EI GC/MS. Fuente: Manual de funcionamiento del Sistema GC/MS de triple cuadrupolo Agilent 7000 (pág. 46) 12

Ionización Ionización química (CI) El es un proceso de transferencia directa de energía con la energía cinética del electrón depositada directamente en una molécula del analito. La CI es un proceso indirecto que involucra un agente químico intermedio. Esto se da sobre todo en la ionización química positiva (PCI). En la PCI, la fuente de iones se llena con un gas reactivo que se ioniza para crear iones reactivos que reaccionan con el analito. Los gases reactivos que se usan de forma más frecuente son: metano, iso-butano y amoníaco. El gas reactivo aplicado determina el comportamiento de la ionización y la fragmentación del analito. Las reacciones principales del metano son: CH 4 e - CH 4, CH 3, CH 2 El gas reactivo se ioniza por electrones que se introducen en la fuente de ionización. CH 4 CH 4 CH 5, CH 3 CH 2 CH 4 C 2 H 4 H 2 CH 2 CH 4 C 2 H 3 H 2 H CH 3 CH 4 C 2 H 5 H 2 C 2 H 3 CH 4 C 3 H 5 H 2 Consulte las notas para obtener más información 13

Ionización Consideraciones de la muestra (LC/MS) ESI APCI APPI Volatilidad no necesaria Técnica preferida para los analitos termolábiles Iones formados en solución Alguna volatilidad necesaria Los analitos deben poseer estabilidad térmica Iones formados en fase gaseosa Alguna volatilidad necesaria Los analitos deben poseer estabilidad térmica Iones formados en fase gaseosa Puede formar iones multicargados Forma solo iones con una sola carga Forma solo iones con una sola carga Muchos compuestos ionizarán correctamente mediante estas tres fuentes. APCI/APPI pueden ionizar moléculas que son demasiado no polares para que ESI las ionice. 14

Ionización Consideraciones de la muestra (LC/MS) ESI APCI APPI Iones en solución p. ej. catecolamina, conjugados de sulfato, aminas cuaternarias Compuestos con heteroátomo p. ej. carbamatos, benzodiacepinas Compuestos que multiplican la carga en la solución p. ej. proteínas, péptidos, oligonucleótidos Compuestos de PM y polaridad intermedios p. ej. PAHs, PCBs, ácidos grasos, ftalatos, alcoholes Compuestos con heteroátomo p. ej. carbamatos, benzodiacepinas Compuestos que son demasiado no polares para la respuesta de ESI Compuestos de PM intermedia y polaridad de intermedia a baja p. ej. PAHs, PCBs, ácidos grasos, ftalatos, alcoholes Compuestos con heteroátomo p. ej. carbamatos, benzodiacepinas Compuestos que son demasiado no polares para la respuesta de ESI 15

Ionización electrospray (ESI) La ionización de electrospray (ESI) es una técnica de ionización suave. Se rocía (nebuliza) el eluyente del LC en una cámara de nebulización a presión atmosférica en presencia de un campo electrostático fuerte y de gas de secado calentado. El campo electrostático se produce entre el nebulizador, que en este diseño se encuentra a tierra y el capilar, que está a alta tensión. Moléculas adecuadas: Pequeñas moléculas (glucosa) y biomoléculas mayores (proteínas, oligonucleótidos) La carga múltiple es el fenómeno en ESI, que permite analizar moléculas mayores (-> Deconvolución) Nebulizador Spray disolvente Inyector de HPLC Capilar Gas de secado calentado Fuente de ionización de electrospray. Fuente: Guías de concepto de LC/MS (pág. 22) 16

Ionización Proceso ESI De gotas cargadas a iones de analitos El nebulizador produce un tamaño uniforme de la gota. Las gotas cargadas son atraídas hacia la capilaridad dieléctrica. La corriente de nitrógeno caliente que rodea el capilar reduce el tamaño de las gotas. Este proceso se llama desolvatación. Las gotas siguen reduciéndose hasta que las fuerzas electrostáticas de repulsión (Coulomb) superan a las fuerzas de cohesión de las mismas, lo que provoca la explosión de dichas gotas. Este proceso se repite hasta que los iones del analito finalmente se desorben en la fase gaseosa, llevados por un campo eléctrico fuerte en la superficie de las microgotas. Este proceso se llama evaporación de iones. Evaporación Explosiones de coulomb Clúster de disolvente del ión Ión del analito 17

Ionización Ionización química a presión atmosférica (APCI) APCI es un proceso de ionización química en fase gaseosa. Por lo tanto, el analito necesita estar en fase gaseosa para realizar la ionización. El eluyente del LC atraviesa una aguja de nebulización, que crea un spray fino. Las gotas se vaporizan completamente en un tubo cerámico calentado (~ 400 a 500 C). Evaporar (calentador) Inyector de HPLC Nebulizador (pulverizador) Moléculas adecuadas: Moléculas 1.500 u Compuestos menos polares y no polares (analizados normalmente mediante cromatografía de fase normal) Aguja de descarga de corona Gas de secado Capilar Fuente de ionización química a presión atmosférica. Fuente: Guías de concepto de LC/MS (pág. 27) 18

Ionización Proceso APCI Esto muestra los procesos de evaporación e ionización de APCI. Evaporación Tenga en cuenta que el analito no se ioniza hasta después de la evaporación y después de que se ionice el gas reactivo. Después, el gas reactivo transfiere una carga al analito. La APCI genera normalmente solo iones con una sola carga, sin embargo, es posible obtener iones con doble carga donde las zonas de carga estén separadas (normalmente por una región hidrofóbica). Gas reactivo cargado formado Carga transferida al analito Vapor Iones del analito Consulte las notas para obtener más información 19

Ionización Fotoionización a presión atmosférica (APPI) Con la técnica de APPI, el eluyente del LC pasa a través de una aguja de nebulización para crear un spray fino. Las gotas se vaporizan completamente en un tubo cerámico calentado. La mezcla de gas/vapor pasa a través de la luz ultravioleta de una lámpara de criptón para ionizar las moléculas de la muestra. Los iones de la muestra se introducen en el capilar. La APPI se aplica a muchos de los mismos compuestos que normalmente se analizan mediante APCI. La APPI ha demostrado ser particularmente valiosa en análisis de compuestos no polares y aromáticos. Evaporar (calentador) hu Lámpara de UV Inyector de HPLC Nebulizador (pulverizador) Capilar Gas de secado Fuente de fotoionización a presión atmosférica. Fuente: Guías de concepto de LC/MS (pág. 29) 20

Ionización Proceso APPI Esto muestra los procesos de evaporación e ionización de la fotoionización. Tanto APPI como APCI son similares, con APPI para realizar la ionización, se sustituye una lámpara por la aguja de corona. Además, normalmente en la APPI se utiliza un disolvente adicional o modificador de fase móvil, llamado "dopante" (D) para ayudar con el proceso de fotoionización. APPI directa: APPI dopante: M hu M M D SH D hu D D M M M e M H S e M H D D El dopante se fotoioniza y actúa como gas reactivo Evaporación h h Vapor El fotón ioniza el analito Iones del analito Consulte las notas para obtener más información 21

Ionización Ionización multimodo (MMI) La fuente multimodo es una fuente de iones que puede funcionar de tres maneras diferentes: APCI ESI APCI/ESI simultáneos Incorpora dos zonas separadas eléctricamente, una para ESI y otra para APCI. Durante la APCI/ESI simultáneas, los iones que forman ambos modos de ionización se introducen en el capilar y el espectrómetro de masas los analiza de forma simultánea. MMI es útil para los cribados de especies desconocidas, o cualquier muestra que contenga una mezcla de compuestos donde algunos responderán por ESI y otros por APCI. Zona APCI Aguja de descarga de corona Inyector de HPLC Nebulizador Zona ESI Contenedor térmico Capilar Gas de secado Fuente multimodo. Fuente: Guías de concepto de LC/MS (pág. 30) 22

Ionización Desorción/ionización de matriz asistida por láser (MALDI) La desorción/ionización de matriz asistida por láser (MALDI) es una técnica de ionización suave. La muestra se mezcla con la matriz y se aplica a una placa de metal. Un láser pulsado irradia la muestra, activando la ablación y la desorción. Las moléculas del analito se ionizan en la pluma caliente de los gases ablacionados. Los iones se aceleran en el espectrómetro de masas. Moléculas adecuadas: Biomoléculas (ADN, proteínas, azúcares) Moléculas orgánicas grandes (polímeros) Haz del láser Ión del analito Ión de la matriz Zona del analito/matriz en la diana MALDI Rejilla de extracción Lente de enfoque al espectrómetro de masas 23

Interfaz Funcionamiento Ionización Plasma acoplado inductivamente (ICP) Un instrumento de plasma acoplado inductivamente (ICP) utiliza una fuente de plasma en la que la energía se suministra mediante corrientes eléctricas producidas por inducción electromagnética, es decir, por campos magnéticos que varían con el tiempo. El plasma es tan energético que reduce las moléculas en los elementos ionizados. Existen distintos tipos de geometrías ICP disponibles que pueden acoplarse a las distintas tecnologías: ICP-AES Espectroscopia de emisión atómica ICP-OES Espectroscopia de emisión óptica ICP-MS Espectrometría de masas ICP-RIE Grabado con iones reactivos Separación HPLC GC CE FFF Otra Detector(es) convencional(es) opcional(es) Detección MS orgánico opcional ICP-MS Detector(es) convencional(es) opcional(es) Diagrama esquemático que muestra las interrelaciones de varios componentes en un sistema de ICP-MS acoplado Fuente: Wikipedia 24

Analizador de masas Después de la ionización y del desplazamiento de los iones, los analitos entran en el analizador de masas. El espectrómetro de masas mide las señales del ión lo que da como resultado el espectro de masas, que puede proporcionar información valiosa sobre el peso molecular, estructura, identidad y cantidad de un compuesto. Existen distintos tipos de analizadores de masas: Cuadrupolo simple (SQ) Triple cuadrupolo (QQQ) Tiempo de vuelo (TOF) Trampa de iones (IT) 25

Analizador de masas Cuadrupolo simple (CS) Los iones cargados generados en la fuente de iones entran en el analizador de masas. El analizador de masas cuadrupolar se escanea secuencialmente para que solo un único ión m/z pueda pasar de una vez. El resto de iones se pierde. m/z - relación masa/carga: Masa de un ión (Daltons o u) dividido por el número de cargas en el ión Información recibida: MS solo Fuente de ionización externa Filtro cuadrupolo Modelo masasconceptual - cuadrupolo simple Modelo conceptual - cuadrupolo simple Detector 26

Analizador de masas Cuadrupolo simple (CS) Monitorización de ión único (SIM) Modo de barrido El analizador de masas se configura para El analizador permitir de que masas solo de iones de configura un único para m/z permitir pasen que solo por los el iones detector la m/z simple pasen por el detector El analizador de masas se analiza secuencialmente pasando cada m/z que hay en el rango de masas seleccionado al detector Se monitoriza un ión diana con m/z específico. La SIM en un cuadrupolo simple permite obtener la mejor sensibilidad para realizar la cuantificación, sin embargo se pierde especificidad. Tiempo ( s) ---> En el modo MS de barrido, el analizador de masas cuadrupolar se escanea secuencialmente permitiendo el paso por el detector de 1 m/z cada vez. 27

Analizador de masas Triple cuadrupolo (QQQ) Los iones cargados generados en la fuente de iones entran en el analizador de masas. El analizador está formado por tres cuadrupolos (Q1-Q3) y por lo tanto varios modos de funcionamiento que darán como resultado información diferente. Una configuración común es la siguiente: Q1: se utiliza como filtro para la m/z específica (ión precursor) Q2: se utiliza como celda de colisión para fragmentar el ión precursor y generar iones producto Q3: configurado para la m/z específica (SRM o MRM) o en modo de barrido (barrido del ión producto) Filtro cuadrupolo matriz Q1 Filtro cuadrupolo Q3 del producto Ionización externa Modelo conceptual - Triple cuadrupolo Esquema que muestra el modo SRM Celda de colisión Detector Información recibida: MS y MS/MS 28

Analizador de masas Triple cuadrupolo (QQQ) Monitorización de reacción múltiple (MRM) Modo MS/MS de barrido completo Celda de colisión con gas nitrógeno Celda de colisión Celda con de gas colisión nitrógeno con gas argón. Los iones precursores con una m/z única pasan a la celda de colisión. Los fragmentos iónicos se generan mediante la colisión con moléculas de nitrógeno. Q3 se configura para una m/z única de fragmento iónico específico. Este método es muy sensible y se utiliza para realizar cuantificaciones. La diferencia entre el modo de barrido completo y SRM o MRM es la función de barrido. Q3 se escanea secuencialmente permitiendo el paso por el detector de 1 m/z cada vez. Se genera un espectro de ión del producto. Este modo de funcionamiento es menos sensible que el SRM o MRM. 29

Analizador de masas Trampa de iones (IT) Los iones cargados generados en la fuente de iones entran en el analizador de masas. Todos los iones de la polaridad seleccionada por encima del rango de masas seleccionado pueden almacenarse a la vez en la trampa. Los iones pueden manipularse en el analizador de masas de trampa de iones, realizando múltiples etapas de aislamiento y fragmentación, hasta el momento de detectar. En vez de cuatro varillas paralelas, la trampa de iones está formada por un electrodo con forma de anillo circular más dos tapas que forman una "trampa". Información recibida: MS y MS/MS Modelo conceptual - Trampa de ión 30

Analizador de masas Trampa de iones (IT) Paso 1: Aislamiento del ión precursor Paso 2: Fragmentación del ión precursor a a Analizador de masas de la trampa de ión b Una vez han finalizado la inyección y acumulación del ión, la puerta de iones se cierra y los iones no se inyectarán más en el analizador de masas. A las masas expulsadas se les aplica formas de ondas por encima y por debajo del ión precursor. La excitación resonante del ión precursor provoca la disociación inducida por colisión (CID) y se generan los iones del producto (a). Los iones producto de barrido completo se expulsan hacia el detector (b). 31

Analizador de masas Tiempo de vuelo (TOF) Los iones cargados generados en la fuente de iones entran en el analizador de masas. Componentes del analizador: Filtro de masas (Q1) opcional Tubo de vuelo Celda de colisión (Q-TOF) Después de que los iones hayan atravesado el cuadrupolo o la celda de colisión llegan al pulsador de iones. Se aplica un pulso de alta tensión que acelera los iones en el tubo de vuelo. Un espejo de iones en el extremo del tubo refleja los iones y los envía al detector que registra su tiempo de llegada. Información recibida: TOF: MS solo Cuadrupolo TOF: MS y MS/MS Filtro cuadrupolo de masas (Q1) Fuente de iones Celda de colisión Óptica de transferencia Espejo de iones Pulsador de iones Turbo 1b Turbo 1a Turbo 2 Turbo 3 Esquema de un espectrómetro de masas de TOF. Fuente: Time-of-Flight Mass Spectrometry (Espectrometría de masas TOF). El gráfico muestra un Q-TOF. Detector de iones 32

Analizador de masas Tiempo de vuelo (TOF) El tiempo de vuelo (t) para cada masa es único y viene determinado por la energía (E) a la que un ión se acelera, la distancia (d) que tiene que viajar y la m/z. E 1/ 2mv 2 que está resuelto para m de esta forma: Acelerar la energía (E) Distancia de la trayectoria del vuelo (d) m 2E / v 2 v ( 2E / m) ecuación 1 y está resuelto para v así: Pulsador de iones Óptica de iones Tubo de vuelo Fuente de iones or b Celda de colisión Detector con gas argón. La ecuación indica que para una energía cinética dada, E, las masas más pequeñas tendrán velocidades mayores que las masas más grandes. Los iones con masas menores llegarán antes al detector. La velocidad viene determinada (y en consecuencia la masa) por la medida del tiempo que tarda un ión en alcanzar el detector. 33

Analizador de masas Tiempo de vuelo (TOF) La segunda ecuación es la ya conocida velocidad (v) igual a la distancia (d) dividida por el tiempo (t): v d / t Las ecuaciones 1 y 2 combinadas producen: m 2 2 ( 2E / d ) t Para una energía (E) y distancia dadas, la masa es proporcional al cuadrado del tiempo de vuelo del ión. E y d se mantienen constantes y dan como resultado una 2 variable A que simplifica la ecuación: m A t Para ser muy precisos, se debe considerar también un retraso del tiempo para aplicar la alta tensión: t t m t 0 Esto dará como resultado la ecuación final: m A( t t 0 ) m 2 34

281,0 280,0 301,0 279,1 Resultados Ejemplo 1 350.000 300.000 O O S NH N CH 3 N CH 3 [M H] Espectro de masas de la sulfametazina analizado con analizador de masas cuadrupolo simple 250.000 200.000 H 2 N Fórmula molecular: C 12 H 14 N 4 O 2 S [MH] : 279,33 150.000 100.000 50.000 0 [M Na] 100 200 300 m / z Espectro de masas de sulfametazina. Fuente: G1960-90083 (pág. 17) 35

Resultados Ejemplo 2 Espectro de masas del cocaetileno con un analizador de masas Q-TOF Fórmula molecular: C 18 H 23 NO 4 [MH] : 318,387 Espectro de masas del cocaetileno. Fuente: Una comparación de varias técnicas de LC/MS para su uso en toxicología (Fig 36, pág. 37) 36

Abundancia Abundancia Resultados Cuadrupolo simple frente a TOF de alta resolución El análisis con un cuadrupolo simple (triple) proporciona información de la masa nominal (poder de resolución bajo), los instrumentos de TOF pueden proporcionar información de la masa exacta (poder de resolución alto). Para realizar el análisis por tiempo de vuelo, se necesita realizar la calibración continua del sistema TOF y así asegurarse la mejor exactitud de masa posible. Las medidas suelen desviarse solo algunas partes por millón (ppm). Con una resolución de masas y una exactitud de masas suficiente, un espectrómetro de masas TOF puede confirmar positivamente la composición elemental. Masa diana Bajo poder de resolución Masa diana Interferencia Alto poder de resolución Interferencia Masa Poder de resolución de un cuadrupolo simple (a) frente a una fuente de TOF (b): 5989-2549EN (pág. 14) 37

281,0 280,0 301,0 279,1 Resultados Cuadrupolo simple frente a TOF Espectro de masas típico de Cuadrupolo simple 350.000 O N CH 3 [M H] Espectro de masas típico de TOF TDF MS: Experimento 2, de 0,932 a 1,007 min desde sulfa 284 a.wiff Agilent 156,0116 100% Recuento máx. 4,8e 4 300.000 O S NH N CH 3 250.000 200.000 H 2 N 150.000 307,0027 100.000 285,0207 50.000 [M Na] 149,0242 309,0000 0 100 200 300 m / z Espectro de masas de sulfametazina. Fuente: G1960-90083 (pág. 17) m/z (amu) Espectro de masas de la sulfacloropiridazina con iones aductos y fragmentos iónicos. Fuente: 5989-2549EN (pág. 25) 38

Resultados Iones con carga múltiple y deconvolución Dependiendo de la molécula analizada y de la técnica de ionización, se podrán generar iones con carga múltiple. Las moléculas pequeñas y la APCI ofrecen moléculas simples cargadas: La m/z medida se corresponde con el peso molecular después de restar (ión positivo) o sumar (ión negativo) el portador de carga. Para las moléculas grandes (péptidos, proteínas) ionizadas con ESI, existe más de un sitio de carga disponible (para la protonación o deprotonación) lo que puede dar como resultado iones con carga múltiple: Esto hace que las moléculas como por ejemplo los anticuerpos (1 Mio Da) sean accesibles a la espectrometría de masas, dado que los iones medidos se desplazan a un rango de la m/z de medida más legible. Es necesario realizar un algoritmo matemático para determinar el peso molecular real de la m/z medida. este proceso se conoce como deconvolución. 39

Abundancia Abundancia Abundancia Resultados Iones con carga múltiple y deconvolución Ejemplo 1177,68 Masa esperada de la sintetasa de glutamina sin modificar: 51.772,7 u 1205,06 1057,61 1117,6 1126,52 1102,58 1233,73 1263,80 1295,38 1328,53 1363,47 1.170 1.180 1.190 Relación masa/carga (m/z) 51772,87 1016,17 996,67 977,87 1400,31 1439,18 1480,25 922,01 700 800 900 1.000 1.100 1.200 1.300 1.400 1.500 1.600 1.700 1.800 1.900 Relación masa/carga (m/z) 50.600 50.800 51.000 51.200 51.400 51.600 51.800 52.000 52.200 52.400 52.600 52.800 Masa (u) Espectro de masas de la sintetasa de glutamina. Espectro de masas deconvolucionado de la sintetasa de glutamina expresada. Fuente: LC/TOF-MS de masa exacta para la confirmación de pesos moleculares de la proteínas intactas (Fig 1, pág. 4) 40

Abreviaturas Abreviatura Definición Abreviatura Definición APCI Ionización química a presión atmosférica LC/MS Cromatografía de líquidos/espectrometría de masas APPI Fotoionización a presión atmosférica M Ión molecular CI CID Ionización química Disociación inducida por colisión MALDI MMI Desorción/ionización de matriz asistida por láser Ionización multimodo D Dopante (APPI) MRM Monitorización de reacción múltiple Da Dalton MS Espectrometría de masas EI Impacto electrónico m/z Relación masa/carga ESI Ionización de electrospray QQQ Sistema LC/MS triple cuadrupolo GC Cromatografía de gases SIM Monitorización de ión único GC/MS GC/MS SH Moléculas de disolvente ICP Plasma acoplado inductivamente SQ Cuadrupolo simple IT Trampa de iones (Q) - TOF Tiempo de vuelo 41

Más información Para obtener más información sobre los productos de Agilent, visite los sitios web www.agilent.com y www.agilent.com/chem/academia Si tiene más preguntas o sugerencias sobre esta presentación, póngase en contacto con academia.team@agilent.com Publicación Título N.º pub. Manual Guía Compendio de aplicaciones Descripción técnica general Aplicación Agilent 7000 Series Triple Quad GC/MS Operation Manual (Manual de funcionamiento del Sistema GC/MS de triple cuadrupolo Agilent 7000) Agilent 6100 Series Quadruple LC/MS system Concepts Guide (Guía de conceptos del sistema LC/MS de cuadrupolo Agilent serie 6100) Time-of-Flight Solutions in Pharmaceutical Development the Power of Accurate Mass Time-of-Flight Mass Spectrometry (Espectrometría de masas TOF) Accurate-Mass LC/TOF-MS for Molecular Weight Confirmation of Intact Proteins G7000-90044 G1960-90083 5989-2549EN 5990-9207EN 5989-7406EN Aplicación A Comparison of Several LC/MS Techniques for Use in Toxicology 5990-3450EN Vídeos Imágenes www.agilent.com/chem/teachingresources www.agilent.com/chem/teachingresources 42

GRACIAS POR SU ATENCIÓN Número de publicación 5991-5857ES 43