LAS PROTEINASAS COMO UN PROBLEMA EN PURIFICACION DE PROTEÍNAS. SINTOMAS QUE SUGIEREN UN PROBLEMA PROTEOLITICO: 1) Ausencia de una proteína específica (por actividad o inmunorreactividad). 2) Bajos rendimientos en la purificación o pérdida de actividad, por ejemplo durante el almacenamiento de las muestras. 3) Cambios en la actividad de la proteína. P.ej.: especificidad, dependencia del ph, etc. Puede deberse a proteólisis limitada. P.ej.: la tirosina aminotransferasa (TAT) de hígado de mamífero cuya región N-terminal se conoció sólo al secuenciar el cdna, pues se proteoliza al romper los hepatocitos. 4) Discrepancias en las propiedades de la misma proteína purificada en distintos laboratorios o por métodos alternativos (patrón de isoformas, datos de secuencia N-terminal). 1
SINTOMAS EN SDS-PAGE QUE SUGIEREN UN PROBLEMA PROTEOLITICO. 1) Pobre resolución de bandas y alto background de tinción. 2) Pérdida de bandas de alto peso molecular y aumento del material de bajo peso molecular. 3) Discrepancias en el valor de peso molecular informado por diversos laboratorios, o de la misma proteína obtenida por métodos alternativos. 4) Disminución del peso molecular aparente durante el almacenamiento. 5) Aparición de dos bandas con peso molecular menor, con pérdida de una única banda con peso molecular igual a su suma. 6) Número variable de subunidades en preparaciones de proteínas multifuncionales. 2
PROBLEMAS PROTEOLITICOS QUE PUEDEN SUCEDER DURANTE LA SDS-PAGE. 1) Las condiciones desnaturalizantes empleadas en SDS-PAGE despliegan a las proteínas y las hacen mas vulnerables a la proteólisis. 2) Algunas proteinasas no se inactivan completamente en condiciones desnaturalizantes standard, sobre todo si no se hierve la muestra a sembrar. 3) Los complejos proteinasa-inhibidor se disocian. 4) Los agentes reductores, como el β-mercaptoetanol, activan a las cisteina proteinasas. 3
FORMAS DE EVITAR (O MINIMIZAR) LA PROTEOLISIS DURANTE LA PURIFICACION DE UNA PROTEINA. 1) ph y buffers: Buscar un buffer y un valor de ph que no sea el óptimo para las proteinasas conocidas en el material de partida. 2) Temperatura: Trabajar en frío y guardar las muestras congeladas (a -70 o C de ser posible), salvo que la proteína no lo soporte. 3) Tiempo: Trabajar tan rápido como sea posible. Usar inhibidores de proteinasas durante las etapas que insumen mucho tiempo (p. ej.: una diálisis de toda la noche). 4) Agentes estabilizadores: P. ej.: glicerol, al 15-35 %, o DMSO, al 10 % 5) Agregado de proteínas exógenas: P. ej.: 1-5 mg de seroalbúmina bovina por ml. 6) Agregado de efectores: Sustratos, análogos de sustratos, cofactores, efectores alostéricos, si el complejo de la proteína y el efector es mas estable que la proteína sola. 7) Uso de cócteles de inhibidores de proteinasas. 4
5
USO DE PROTEINASAS EN SECUENCIACION DE PROTEINAS Para la digestión parcial de las proteínas previa a su secuenciación por Edman o MS, se utilizan distintas proteinasas con diferentes especificidades. Serin proteinasas: Tripsina - Quimotripsina - Subtilisina - Glu-C - Lys-C - Arg-C. Cistein proteinasas: Papaína. Metaloproteinasas: Termolisina. Aspartil proteinasas. Pepsina. Actualmente lo mas frecuente es efectuar la digestión en el fragmento de gel de proliacrilamida, y luego extraer los péptidos para efectuar RP-HPLC o MS. 6
7
ALGUNAS PROTEINAS ESTUDIADAS POR PROTEOLISIS LIMITADA. ES ESENCIAL DETENER LA PROTEÓLISIS CON UN INHIBIDOR ADECUADO 1) MIOSINA. Clivaje con quimotripsina, detenido con PMSF. Produce las meromiosinas pesada y liviana. 2) COMPLEJO ASPARTOQUINASA-HOMOSERINA DEHIDROGENASA. Clivaje con quimotripsina, detenido con PMSF. Se aísla el fragmento C- terminal de 55 kda que contiene la actividad de homoserina dehidrogenasa. 3) DNA POLIMERASA I. Clivaje con subtilisina, en presencia de DNA. Detenido con PMSF. Separa el fragmento N-terminal de 35 kda del fragmento C-terminal de 68 kda. Este último es el fragmento Klenow, con actividad de polimerasa y 3-5 -exonucleasa. 8
USO DE PROTEINASAS PARA DETERMINAR LA TOPOLOGIA DE PROTEINAS DE MEMBRANA 9
USO DE PROTEINASAS PARA DETERMINAR LA TRANSLOCACIÓN DE PROTEINAS A ORGANELAS. 10
11
12
USO DE PROTEINASAS PARA PROCESAR PROTEINAS EXPRESADAS COMO PROTEINAS DE FUSION. 13
14
15
16
17
18
TIROSINA AMINOTRANSFERASA (TAT) DE TRYPANOSOMA CRUZI-FUSION GST WESTERN COOMASSIE WESTERN Nat Rec Fusion 19
Calles 1 (E. coli) y 2 (NatTAT), sustratos Tyr/αKG. Calles 3 (E. coli), 4 (RecTAT) y 5 (NatTAT), sustratos Tyr/Pyr. RecTAT clivada con trombina: Le quedan 17 residuos más que a la NatTAT, incluyendo 3 básicos: GSGGGGGSEASNSIKRK Km Fusion RecTAT NatTAT (mm) clivada Ala 6.1 6.2 5.7 (ALAT) Tyr 15.1 6.4 7.1 (TAT) 20