Dako LSAB2 System-HRP Nº de catálogo K0672 15 ml Nº de catálogo K0673 15 ml Nº de catálogo K0675 110 ml Uso previsto Para uso en diagnóstico in vitro. Estas instrucciones se aplican al Dako Labelled Streptavidin-Biotin2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB2 System, HRP) Universal. Este sistema está diseñado para ser usado con anticuerpos primarios de ratón o de conejo suministrados por el usuario para la identificación cualitativa de antígenos mediante microscopía óptica e inmunohistoquímica (IHQ) en tejidos incluidos en parafina, tejidos o preparaciones celulares realizados con criostato, de modo de contribuir al diagnóstico de trastornos patológicos. Es posible utilizar tejidos procesados con diversos fijadores como etanol, B-5, de Bouin, formol y zinc, y formol neutro tamponado. Consulte las Instrucciones generales para la tinción inmunohistoquímica de Dako o las instrucciones del sistema de detección de los procedimientos de IHQ para: 1) Principio del procedimiento, 2) Material necesario pero no suministrado, 3) Almacenamiento, 4) Preparación de la muestra, 5) Procedimiento de tinción, 6) Control de calidad, 7) Solución de problemas, 8) Interpretación de la tinción y 9) Limitaciones generales. Resumen y explicación El LSAB2 System, HRP se basa en una técnica modificada de avidina-biotina marcada (LAB) donde un anticuerpo secundario biotinilado forma un complejo con moléculas de estreptavidina conjugada con peroxidasa 1. Se ha comunicado que el método LAB/LSAB es de cuatro a ocho veces más sensible que el ABC (complejos de avidina-biotina) 2. Giorno et al. 2 atribuyen la mayor sensibilidad al menor tamaño del complejo de (estrept)avidina marcada con enzimas del método LAB/LSAB con respecto al complejo de enzimas avidina-biotina del método ABC. La interpretación clínica de cualquier tinción positiva, o su ausencia, deberá ser complementada con estudios morfológicos e histológicos con los controles adecuados. Las evaluaciones deben ser realizadas por una persona cualificada dentro del contexto de la historia clínica del paciente y otras pruebas diagnósticas. Principios del procedimiento El LSAB2 System, HRP es un procedimiento IHQ sensible y versátil que permite el procesamiento simultáneo de varias muestras con anticuerpos primarios de conejo o de ratón en menos de una hora. La actividad de la peroxidasa endógena se reduce incubando la muestra durante 5 minutos con peróxido de hidrógeno al 3%. Entonces se incuba la muestra con un anticuerpo primario de conejo o de ratón apropiadamente caracterizado y diluido, seguido por incubaciones consecutivas cada 10 minutos con un anticuerpo de enlace biotinilado (que contiene inmunoglobulinas anti-conejo y anti-ratón) y estreptavidina marcada con peroxidasa. La tinción se completa después de una incubación con el sustrato-cromógeno (AEC o DAB). Para el AEC en K0672, ésta es una incubación de 10 minutos con el sustratocromógeno 3-amino-9 etilcarbazol (AEC), que tiene como resultado un precipitado de color rojo en la zona del antígeno. Para el DAB en K0673, ésta es una incubación de 5-10 minutos con el sustrato-cromógeno 3-3 -diaminobenzidina (DAB), que tiene como resultado un precipitado de color marrón en la zona del antígeno. Reactivos suministrados Nº de catálogo K0672 En el kit se incluyen los siguientes materiales, suficientes para 150 cortes de tejido si se utilizan 100 µl por corte: Cantidad Descripción Inhibidor de peroxidasa Peróxido de hidrógeno al 3% en agua. Anticuerpo de enlace Inmunoglobulinas de cabra anti-conejo y cabra anti-ratón aisladas por afinidad, marcadas con biotina en solución salina tamponada con fosfato (PBS), con proteína estabilizadora y 0,015 mol/l de azida de sodio. Estreptavidina-HRP Estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano en PBS que contiene proteína estabilizante y agentes antimicrobianos. Sustrato-cromógeno AEC AEC en N,N-dimetilformamida (DMF) y tampón de acetato, ph 5,0, con peróxido de hidrógeno, estabilizadores, estimuladores y un agente antimicrobiano. Consérvese a 2-8 C. (107448-003) 302289ES_001 p. 1/8
Nº de catálogo K0673 En el kit se incluyen los siguientes materiales, suficientes para 150 cortes de tejido si se utilizan 100 µl por corte: Cantidad Descripción Inhibidor de peroxidasa Peróxido de hidrógeno al 3% en agua. Enlace biotinilado Inmunoglobulinas de cabra anti-conejo y cabra anti-ratón aisladas por afinidad, marcadas con biotina en solución salina tamponada con fosfato (PBS), con proteína estabilizadora y 0,015 mol/l de azida de sodio. Estreptavidina-HRP Estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano en PBS que contiene proteína estabilizante y agentes antimicrobianos. Sustrato 1x18 ml Tampón imidazol-hcl, ph 7,5, con peróxido de hidrógeno y un agente antimicrobiano. Cromógeno DAB 1x1 ml 3,3'-diaminobenzidina en solución de cromógeno. Accesorios 1 Tubo de ensayo calibrado 1 Pipeta plástica de Pasteur Nº de catálogo K0675(11) En el kit se incluyen los siguientes materiales, suficientes para 1100 cortes de tejido si se utilizan 100 µl por corte: Cantidad 1x110 ml Descripción Enlace biotinilado Inmunoglobulinas de cabra anti-conejo y cabra anti-ratón aisladas por afinidad, marcadas con biotina en solución salina tamponada con fosfato (PBS), con proteína estabilizadora y 0,015 mol/l de azida de sodio. 1x110 ml Estreptavidina-HRP Estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano en PBS que contiene proteína estabilizante y agentes antimicrobianos. Nº de catálogo K0675(89) En el kit, envasado para su uso con el Dako Autostainer (Nº de catálogo S3400), se incluyen los siguientes materiales: Cantidad 10x11 ml Descripción Enlace biotinilado Inmunoglobulinas de cabra anti-conejo y cabra anti-ratón aisladas por afinidad, marcadas con biotina en solución salina tamponada con fosfato (PBS), con proteína estabilizadora y 0,015 mol/l de azida de sodio. 10x11 ml Estreptavidina-HRP Estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano en PBS que contiene proteína estabilizante y agentes antimicrobianos. (107448-003) 302289ES_001 p. 2/8
Material necesario, pero no suministrado Paños absorbentes Anticuerpos: Anticuerpos de la serie N, listos para su uso o concentrados, diluidos en Antibody Diluent (Nº de catálogo S0809 o S3022) Antibody Diluent (Nº de catálogo S0809 o S3022) Tejidos de control, positivos y negativos Contratinción; en base acuosa, tal como Hematoxylin de Mayer Modificada por Lillie (Nº de catálogo S3309) Cubreobjetos Agua destilada Horno de secado, capaz de mantener una temperatura de 60 C o menos. Etanol, puro y al 95% Microscopio óptico (20x 800x) Medio de montaje, como Faramount (Nº de catálogo S3025) o Glycergel (Nº de catálogo C0563) Reactivo de control negativo Portaobjetos recubiertos con poli-l-lisina o Silanized Slides (Nº de catálogo S3003) Baños o recipientes de tinción Cronómetro (capaz de medir intervalos de 2-10 minutos) Frascos de lavado Solución de tampón de lavado Xileno, tolueno o sustitutos de xileno Para el K0675 LSAB2 System (110 ml) se necesitan los siguientes reactivos además de los mencionados arriba: Peróxido de hidrógeno, solución al 3%, o Peroxidase Block (Nº de catálogo S2001) Solución de sustrato-cromógeno, como la AEC Substrate-Chromogen (Nº de catálogo K3464, 110 ml, lista para su uso), o Liquid DAB (Nº de catálogo K3466) Materiales opcionales; no se suministran Tampones: Wash buffer (Nº de catálogo S3006), para uso automático y manual Phosphate buffered saline (Nº de catálogo S3024) Tris-buffered saline (Nº de catálogo S3001 o S1968) Enzimas proteolíticas: Pepsin (Nº de catálogo S3002) Proteinase K (Nº de catálogo S3004 o S3020) Proteolytic Enzyme, RTU (Nº de catálogo S3007) Otros: Portaobjetos de control positivo (disponibles en Dako) Target Retrieval Solution (Nº de catálogo S1699 o S1700) Target Retrieval Solution, High ph (Nº de catálogo S3307 o S3308) Target Retrieval Solution, ph 9 (Nº de catálogo S2367 o S2368) Cámara húmeda Hidróxido de amonio, 15 mol/l diluido hasta 0,037 mol/l Precauciones Específicas del producto 1. Para usuarios profesionales. 2. Este producto contiene azida de sodio (NaN 3), un compuesto químico altamente tóxico en su forma pura. Aunque a las concentraciones presentes en el producto no está clasificada como peligrosa, la azida de sodio puede reaccionar con cañerías de plomo y cobre formando acumulaciones de azidas metálicas altamente explosivas. Después de desecharla, deje correr abundante cantidad de agua para evitar acumulaciones de azidas metálicas en las cañerías 3,4. 3. Los sustrato-cromógenos AEC y DAB son sensibles a la contaminación por diversos agentes oxidantes como metales, bacterias, polvo y artículos de vidrio de uso común en laboratorios. Para prevenir la contaminación y la caducidad prematura, evite la exposición de las soluciones AEC o DAB a cualquier fuente potencial de contaminación y no pipetee nunca directamente desde el frasco. Vierta la cantidad necesaria en un recipiente limpio y pipetee de él. No devuelva los restos de las soluciones AEC o DAB al recipiente de almacenamiento primario. 4. Los reactivos suministrados están diluidos de forma óptima. Una dilución mayor puede provocar la pérdida de tinción del antígeno. El usuario debe validar cualquiera de dichos cambios. Las diferencias en el procesamiento de los tejidos y en los procedimientos técnicos del laboratorio del usuario pueden producir una importante variabilidad en los resultados, lo que exige un uso regular de los controles en cada laboratorio. 5. No reemplace los reactivos por reactivos con otros números de lote o de kits de otros fabricantes. 6. El uso de tiempos de incubación o temperaturas diferentes a los especificados puede producir resultados erróneos. El usuario debe validar cualquiera de dichos cambios. 7. Las enzimas y cromógenos pueden verse afectados de manera adversa si se exponen a niveles excesivos de luz. No almacene los componentes del kit ni realice tinciones en presencia de luz intensa, como la luz solar directa. Generales 1. Al igual que con cualquier producto de origen biológico, deberán aplicarse los procedimientos de manipulación adecuados. 2. Minimice la contaminación microbiana de los reactivos, ya que es posible que se produzcan resultados erróneos. 3. Evite salpicar los reactivos o generar aerosoles. 4. Como regla general, los menores de 18 años no deben manipular este producto. Los usuarios deben ser meticulosamente instruidos en el procedimiento correcto, las propiedades peligrosas del producto y las instrucciones de seguridad necesarias. 5. Utilice el equipo de protección personal adecuado para evitar el contacto con los ojos y la piel. Los reactivos que no se utilicen deberán desecharse de acuerdo con las normativas locales, provinciales y nacionales. (107448-003) 302289ES_001 p. 3/8
6. Puede solicitar la hoja de datos de seguridad que se encuentra disponible para usuarios profesionales. Declaraciones de riesgos y seguridad K0672 - Sustrato-cromógeno AEC listo para su uso: 1-<10% N,N-Dimetilformamida / Símbolo de riesgo: Tóxico R61 S35 S45 S53 Puede provocar daños al feto. Este material y su envase deben desecharse de forma segura. En caso de accidente o malestar, busque atención médica inmediatamente (muestre la etiqueta siempre que sea posible). Evite la exposición; obtenga instrucciones especiales antes de su uso. Uso limitado a profesionales. K0673 - Cromógeno DAB: 1-5% Tetracloruro de bifenilo 3,3',4,4'-tretrailtetramonio / Símbolo de riesgo: Nocivo R40 Evidencia limitada de efecto carcinógeno. R43 Puede causar sensibilización por contacto con la piel. R68 Posibles riesgos de efectos irreversibles. S35 Este material y su envase deben desecharse de forma segura. S36/37 Llevar ropa y guantes protectores adecuados. Almacenamiento Los reactivos del LSAB2 System, HRP deben almacenarse a 2-8 C. No congelar. No utilizar después de la fecha de caducidad impresa en los viales del reactivo y en la etiqueta del kit. Si los reactivos se almacenan bajo condiciones diferentes a las especificadas, deben ser validadas por el usuario 5. Las soluciones de sustrato-cromógeno AEC y DAB no son estables a temperaturas superiores a 8 C. Use y almacene las soluciones de sustrato-cromógeno AEC y DAB en el rango de temperatura de 2-8 C recomendado. Estas soluciones pueden utilizarse inmediatamente después de sacadas del frigorífico. Después de su uso, repóngalas lo antes posible a la temperatura de almacenamiento de 2-8 C. No existen signos evidentes que indiquen inestabilidad de estos productos. Por lo tanto, los controles positivo y negativo deberán realizarse de manera simultánea con muestras del paciente. Si observa una tinción inesperada que no puede explicarse por variaciones en los procedimientos del laboratorio y sospecha un problema con el equipo, póngase en contacto con el Servicio de asistencia técnica de Dako. Preparación de los reactivos Es conveniente preparar los siguientes reactivos antes de proceder con la tinción. Solución de tampón de lavado TBST, 0,05 mol/l de Tris Buffered Saline with Tween (Nº de catálogo S3006), es el tampón de lavado recomendado para la detección IHQ automática y manual. TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (Nº de catálogo S1968) y PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (Nº de catálogo S3024) son también adecuadas como soluciones de tampón de lavado para la tinción manual. No se recomienda utilizar las soluciones de tampón de lavado con azida de sodio. La azida de sodio inactiva la peroxidasa de rábano (HRP), lo que resulta en una tinción negativa. Almacene el tampón no utilizado a 2 8 ºC. Deséchelo si está turbio. El agua destilada puede utilizarse para enjuagar el peróxido de hidrógeno, la solución de sustrato-cromógeno y la contratinción. Anticuerpo primario Se encuentra disponible una amplia gama de anticuerpos primarios de la serie N, listos para su uso, y de reactivos de control negativo con los sistemas LSAB2. También se pueden conseguir anticuerpos concentrados en Dako; no obstante, el usuario debe determinar experimentalmente las diluciones óptimas. Éstas deben prepararse con Antibody Diluent (Nº de catálogo S0809), que contiene 0,05 mol/l de tampón Tris-HCl, ph 7,2-7,6, y albúmina de suero bovino al 1% (BSA). La BSA actúa como inhibidor proteico y elimina la necesidad de una incubación por separado con un reactivo bloqueante de proteínas. Antibody Diluent with Background Reducing Components (Nº de catálogo S3022) también es adecuado como diluyente. No se recomienda un diluyente sin un transportador de proteína. Para la mayoría de los anticuerpos primarios usados con los sistemas LSAB2, una incubación de 10 minutos es suficiente. Reactivo de control negativo Lo ideal es que un reactivo de control negativo contenga un anticuerpo que no muestre reactividad específica con los tejidos humanos (sin reactividad humana) en la misma matriz/solución que el anticuerpo primario. El anticuerpo sin reactividad humana debe pertenecer a la misma subclase y especie animal que el anticuerpo primario, y estar diluido hasta la misma concentración de inmunoglobulina o proteína que el anticuerpo primario diluido, utilizando el mismo diluyente. Según cuál sea el tipo de anticuerpo primario/antisuero utilizado, puede ser apropiado emplear suero normal/no inmune de la misma especie que la primaria en una concentración de proteínas equivalente a la primaria diluida en el mismo diluyente. El período de incubación del reactivo de control negativo debe corresponderse con el del anticuerpo/antisuero primario. Cuando se utilizan los anticuerpos Dako de la serie N listos para su uso, se recomienda emplear Universal Negative Control como reactivo de control negativo. Estos controles están optimizados para los anticuerpos de la serie N listos para su uso, de ratón (Nº de catálogo N1698), o de conejo (Nº de catálogo N1699). Solución sustrato-cromógeno El sistema LSAB2 K0672 contiene AEC listo para su uso, preparado para su aplicación en muestras de tejido o celulares. El sistema LSAB2 K0673 contiene DAB, que se prepara como sigue: Añadir 1 gota (ó 20 µl) de cromógeno DAB por ml de tampón sustrato. Utilizar la probeta graduada que se suministra para medir la cantidad de tampón sustrato necesaria. Mezclar bien y aplicar la solución utilizando la pipeta de transferencia que se suministra. Después del uso, enjuagar concienzudamente con agua destilada la probeta graduada y la pipeta. La solución DAB no utilizada es estable durante 2 semanas si se almacena a 2-8 C. Si se forma precipitado, mezclar bien antes de usarla. Se recomienda emplear Ready-to-use AEC Substrate-Chromogen Solution (Nº de catálogo K3464, (107448-003) 302289ES_001 p. 4/8
110 ml) o Liquid DAB (Nº de catálogo K3466) con el LSAB2 System, HRP, 110 ml (Nº de catálogo K0675). Por favor siga las instrucciones suministradas con cada sistema de sustrato-cromógeno para el preparado de éstos. Contratinción El cromógeno DAB produce un producto final insoluble en alcohol y puede emplearse con una hematoxilina alcohólica. Cuando se utiliza el sustrato-cromógeno AEC, el producto final coloreado de la reacción de tinción es soluble en alcohol y sólo debe emplearse con contratinciones de base acuosa, como la hematoxilina de Mayer. Después de la contratinción de la hematoxilina, enjuague bien con agua destilada y sumerja los portaobjetos con tejidos en un baño de 0,037 mol/l de agua amoniacal. El agua amoniacal (0,037 mol/l) se prepara mezclando 2,5 ml de hidróxido de amonio 15 mol/l (concentrado) con 1 litro de agua. El agua amoniacal 0,037 mol/l no utilizada puede almacenarse a temperatura ambiente (20-25 C) en un frasco herméticamente cerrado d urante un máximo de 12 meses. Consulte en las instrucciones del fabricante los procedimientos alternativos de contratinción. Medios de montaje Se recomiendan los medios de montaje Faramount Aqueous Mounting Medium listo para su uso (Nº de catálogo S3025) o Glycergel Mounting Medium (Nº de catálogo C0563) para el montaje acuoso. Licue Glycergel calentándolo a aproximadamente 40 (±5) C antes de usarlo. Preparación de las muestras Consulte las Instrucciones generales para la tinción inmunohistoquímica o la Hoja de especificaciones del anticuerpo. Antes de la tinción IHQ, los tejidos deben fijarse y procesarse. La fijación evita la autólisis y putrefacción de los tejidos escindidos, preserva la antigenicidad, mejora el índice de refracción de los constituyentes tisulares y aumenta la resistencia de los elementos celulares al procesamiento de los tejidos. El procesamiento de los tejidos incluye deshidratación, eliminación de agentes deshidratantes, infiltración de medios de inclusión, inclusión y corte de los tejidos. Los fijadores más comunes para preparados de tejidos IHQ se analizan en las Instrucciones generales para la tinción inmunohistoquímica. Éstas sólo son pautas orientativas. El usuario debe determinar y verificar los procedimientos óptimos. Procedimiento de tinción Notas sobre el procedimiento El usuario debe leer atentamente estas instrucciones y familiarizarse con el contenido del sistema antes de utilizarlo. Los reactivos y las instrucciones suministradas con este sistema se han diseñado para obtener resultados óptimos. Una mayor dilución de los reactivos del sistema o la modificación de los tiempos de incubación o de las temperaturas pueden producir resultados erróneos. Todos los reactivos salvo el sustrato-cromógeno AEC deben equilibrarse a temperatura ambiente (20-25 C) antes de la inmunotinción. Asimismo, todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente. El sustrato-cromógeno AEC puede utilizarse inmediatamente después de retirado del frigorífico y no es necesario que alcance la temperatura ambiente antes de su uso. Después de utilizado, vuelva a almacenarlo a 2-8 ºC. El almacenamiento a una temperatura superior a 8 C afect a negativamente la estabilidad del sustrato-cromógeno AEC. No deje que los cortes de tejido se sequen durante el procedimiento de tinción. Los cortes de tejido secos pueden presentar un aumento de tinción inespecífica. Cubra los portaobjetos expuestos a corrientes de aire. Si se utilizan incubaciones prolongadas, coloque los tejidos en un ambiente húmedo. Si debe interrumpirse el protocolo de tinción, los portaobjetos pueden conservarse en un baño de tampón después de la incubación del anticuerpo de enlace (paso 3) hasta una hora a temperatura ambiente (20-25 C) sin que esto afecte el resultado de la tinción. Puede aumentarse aún más la sensibilidad del LSAB2 System, HRP prolongando los tiempos de incubación de los pasos 2, 3 y 4 a 30 ± 5 minutos cada uno. Protocolo de tinción PASO 1 INHIBIDOR DE PEROXIDASA Elimine el exceso de líquido. Con un paño que no suelte pelusa (como Kimwipe o una gasa), limpie con cuidado alrededor de la muestra para eliminar cualquier resto de líquido y mantener los reactivos en la zona especificada. Aplique suficiente inhibidor de peroxidasa para cubrir por completo la muestra. Incube durante 5 (±1) minutos. Enjuague cuidadosamente con agua destilada o solución tamponada de una botella de lavado (no apunte el chorro directamente sobre el tejido) y colóquelo en un baño de tampón fresco. PASO 2 ANTICUERPO PRIMARIO O REACTIVO DE CONTROL NEGATIVO Elimine el exceso de líquido y limpie los portaobjetos como se indicó anteriormente. Aplique suficiente anticuerpo primario o reactivo de control negativo para cubrir la muestra Incube durante 10 (±1) minutos, a menos que se especifique lo contrario. Enjuague suavemente con solución tamponada de una botella de lavado (no apunte el chorro directamente sobre el tejido) y colóquelo en un baño de tampón fresco. PASO 3 ENLACE BIOTINILADO Elimine de inmediato el exceso de tampón y limpie los portaobjetos como se indicó anteriormente. Aplique suficientes gotas AMARILLAS de anticuerpo de enlace para cubrir la muestra. Incube durante 10 (±1) minutos. Enjuague los portaobjetos como se indicó en el paso 2. Si debe interrumpirse el protocolo de tinción, los portaobjetos pueden conservarse en un baño de tampón después de la incubación del anticuerpo de enlace (paso 3) hasta una hora a temperatura ambiente (20-25 C) sin que esto afecte el resultado de la tinción. (107448-003) 302289ES_001 p. 5/8
PASO 4 ESTREPTAVIDINA-HRP Limpie los portaobjetos como se indicó anteriormente. Aplique suficientes gotas ROJAS del reactivo de estreptavidina para cubrir la muestra. Incube durante 10 (±1) minutos. Enjuague el portaobjetos como se indicó anteriormente. PASO 5 SOLUCIÓN DE SUSTRATO-CROMÓGENO Retire las soluciones de sustrato-cromógeno AEC o DAB del almacenamiento a 2-8 ºC. Para la preparación de DAB, consulte con la Sección Preparado de reactivos. Limpie el portaobjetos como se indicó anteriormente. Aplique la suficiente solución de sustrato-cromógeno AEC o DAB para cubrir la muestra. Vuelva a almacenar el sustratocromógeno AEC o DAB en el frigorífico. Incube durante 10 (±1) minutos el AEC y durante 5-10 minutos el DAB. Enjuague suavemente con agua destilada de una botella de lavado (no apunte el chorro directamente sobre el tejido). Recoja los residuos de la solución de sustrato-cromógeno AEC o DAB en un recipiente para materiales peligrosos para su correcta eliminación. PASO 6 CONTRATINCIÓN CON HEMATOXILINA (OPCIONAL) Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina. Incube de dos a cinco (2-5) minutos, en función de la concentración de hematoxilina utilizada. Enjuague suavemente en un baño con agua destilada. Sumerja los portaobjetos 10 veces en un baño de agua amoniacal 0,037 mol/l (opcional). Enjuague los portaobjetos en un baño de agua destilada o desionizada de dos a cinco (2-5) minutos. PASO 7 MONTAJE Las muestras pueden montarse y cubrirse con un medio de montaje con base de agua, como Faramount (Nº de catálogo S3025) o Glycergel (Nº de catálogo C0563). Nota: El producto de reacción AEC es soluble en disolventes orgánicos y, por lo tanto, no es compatible con medios de montaje permanentes con base de tolueno o xileno. Nota: El DAB puede montarse con cualquier medio de montaje permanente. Nota: Los portaobjetos pueden leerse cuando sea necesario. Sin embargo, puede producirse decoloración si se exponen a luz intensa durante una semana. Para minimizar la decoloración, almacénelos en la oscuridad a temperatura ambiente (20-25 C). Control de calidad Las diferencias en el procesamiento de los tejidos y de los procedimientos técnicos del laboratorio del usuario pueden producir una importante variabilidad en los resultados, lo que exige un uso regular de los controles en cada laboratorio. Consulte las pautas de control de calidad del College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry y las referencias 6-8 para obtener información adicional. Consulte el prospecto de cada anticuerpo primario utilizado para obtener detalles acerca de la sensibilidad e inmunorreactividad. Consulte las Instrucciones generales para la tinción inmunohistoquímica para obtener más información acerca de los controles positivos y negativos. Interpretación de la tinción Consulte las Instrucciones generales para la tinción inmunohistoquímica para obtener las pautas de interpretación. Limitaciones generales Consulte las Instrucciones generales para la tinción inmunohistoquímica para obtener información acerca de las limitaciones generales. Limitaciones del producto Dako proporciona los reactivos del sistema LSAB2 en diluciones óptimas para usar siguiendo las instrucciones proporcionadas para IHQ en cortes de tejidos incluidos en parafina, criostatos y frotis de sangre. Cualquier desviación de los procedimientos recomendados para las pruebas puede invalidar los resultados declarados esperados; deben emplearse y documentarse los controles adecuados. Los usuarios que se desvíen de los procedimientos recomendados para las pruebas deben aceptar la responsabilidad de la interpretación de los resultados del paciente bajo tales circunstancias. Se ha observado actividad endógena de unión a la avidina (EABA) en secciones congeladas del hígado (nódulo hepático completo) y los riñones (epitelio tubular), como también en tejidos linfoides congelados y fijados con formol (histiocitos paracorticales) 9-12. La EABA se puede inhibir mediante incubaciones consecutivas de 20 minutos, primero con avidina al 0,1% y después con biotina al 0,01% en 0,05 M de tampón Tris-HCl, ph 7,2-7,6, antes de teñir o de usar Biotin Blocking System (Nº de catálogo X0590). Puede encontrarse actividad de peroxidasa endógena o pseudoperoxidasa en las hemoproteínas, como hemoglobina, mioglobina, citocromo y catalasa, así como en ciertos eosinófilos 13,14. En tejidos fijados con formol, esta actividad puede inhibirse incubando las muestras con peróxido de hidrógeno al 3% durante cinco minutos antes de la aplicación del anticuerpo primario. Los frotis de sangre y médula ósea y los cortes de tejido congelados pueden tratarse con Peroxidase Blocking Reagent (reactivo bloqueante de peroxidasa) (Nº de catálogo S2001). Sin embargo, este procedimiento no elimina el pigmento marrón rojizo de las hemoproteínas. Como alternativa, puede utilizarse una solución de metanol-peróxido de hidrógeno. Con este procedimiento pueden desnaturalizarse algunos antígenos. Los reactivos pueden mostrar reacciones inesperadas en tejidos no analizados previamente. No puede descartarse completamente la posibilidad de reacciones inesperadas en grupos de tejidos analizados previamente, debido a la variabilidad biológica de la expresión del antígeno en neoplasmas u otros tejidos patológicos 8. En caso de obtener reacciones inesperadas, póngase en contacto con el Servicio de asistencia técnica de Dako. (107448-003) 302289ES_001 p. 6/8
Los tejidos de personas infectadas con el virus de la hepatitis B y que contienen el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) pueden mostrar tinción inespecífica con la peroxidasa de rábano 15. Solución de problemas Problema Causa probable Solución sugerida 1. Los portaobjetos no 1a. Los reactivos no se 1a. Revise la aplicación de los reactivos. se tiñen. han usado en el orden correcto. 1b. Azida de sodio en el 1b. Utilice un tampón nuevo, libre de azida. 2. Los portaobjetos se tiñen débilmente. 3. Tinción de fondo excesiva en todos los portaobjetos, incluidos los de control negativo. 4. Los cortes de tejido se desprenden de los portaobjetos. 5. Tinción específica excesivamente intensa. baño de tampón. 1c. El reactivo de sustrato-cromógeno se ha mezclado en forma incorrecta. 2a. Los cortes retienen demasiada solución después del baño de lavado. 2b. Los portaobjetos no se han incubado el tiempo suficiente con los reactivos. 2c. Contratinción incompatible o medio de montaje que disuelve el producto de reacción. 3a. Las muestras presentan elevada actividad de peroxidasa endógena. 3b. No se eliminó completamente la parafina. 3c. No se enjuagaron bien los portaobjetos. 3d. Reacción del sustrato más rápida de lo normal debido a una temperatura ambiente demasiado alta. 3e. Los cortes se secaron durante el procedimiento de tinción. 3f. Unión inespecífica de los reactivos al corte de tejido. 3g. Anticuerpo primario demasiado concentrado. 4a. Se utilizaron los portaobjetos incorrectos. 5a. Anticuerpo primario demasiado concentrado. 5b. La incubación del anticuerpo primario, el enlace biotinilado o la estreptavidina-hrp es demasiado prolongada. 1c. Prepare una nueva solución de sustrato-cromógeno siguiendo el protocolo del kit. 2a. Elimine suavemente el exceso de solución antes de limpiar alrededor del corte. 2b. Revise los tiempos de incubación recomendados. 2c. Para portaobjetos de inmunotinción con AEC sólo utilice contratinciones y medios de montaje de base acuosa. 3a. Incube los portaobjetos con peróxido de hidrógeno nuevo. 3b. Utilice baños de xileno o de tolueno nuevos. 3c. Utilice soluciones nuevas en los baños de tampón y en los baños de lavado. 3d. Incube la solución de sustratocromógeno durante menos tiempo. 3e. Utilice una cámara húmeda. Limpie sólo 3 ó 4 portaobjetos a la vez antes de aplicar el reactivo. 3f. Use diluyentes de anticuerpos o añada BSA al 1% al diluyente de anticuerpo. Como alternativa, se puede emplear 0,05 mol/l de Tris con 0,3 mol/l de NaCl y Tween 20 al 0,1%, ph 7,2-7,6 (Nº de catálogo S3306) como tampón de lavado. También puede ser necesario incubar un reactivo bloqueante de proteínas (Nº de catálogo X0909) separado antes de aplicar el anticuerpo primario. 3g. Use una dilución superior del anticuerpo primario. 4a. Utilice portaobjetos con poli-l-lisina para la mayoría de las tinciones. Para los anticuerpos que requieren técnicas de recuperación diana, utilice portaobjetos silanizados. 5a. Realice diluciones seriadas del anticuerpo primario para determinar la dilución óptima. 5b. Determine el protocolo de tinción apropiado para el anticuerpo, es decir la duración de la incubación del anticuerpo primario, el enlace biotinilado y el tiempo de incubación de la estreptavidina-hrp. (107448-003) 302289ES_001 p. 7/8
Nota: Si no se puede atribuir el problema a ninguna de las circunstancias anteriores, o si la acción correctiva sugerida no lo soluciona, póngase en contacto con el Servicio de asistencia técnica de Dako para solicitar más ayuda. Encontrará información adicional sobre técnicas de tinción y preparación de muestras en Immunohistochemical Staining Methods 10 (Métodos de tinción inmunoquímica) (suministrado por Dako), Atlas of Immunohistology 16 (Atlas de Inmunohistología) e Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis 17 (Técnicas de inmunoperoxidasa: tratado práctico del diagnóstico de tumores). Referencias bibliográficas 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979;27(8):1131-9 2. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984;2(3):161-6 3. Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April 30, 1976 4. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 5. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final rule, 57FR7163. February 18, 1992 6. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe S, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Amer J Clin Pathol 1989;92(6):836-43 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A 8. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991;66(4):194-9 9. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981:81 10. Key M (ed). Immunohistochemical Staining Methods. 4th Edition. Dako 2006 11. Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981;29(10):1196-204 12. Banerjee D, Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984;37(2):223-5 13. Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;35(2):213-20 14. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: American Society of Clinical Pathologists Press 1990; 46 15. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980;73(5):626-32 16. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: ASCP Press 1986 17. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques, A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: ASCP Press 1986 Edición 05/07 (107448-003) 302289ES_001 p. 8/8