VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS VALIDACIÓN DE MÉTODOS 1

VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS VALIDACIÓN DE MÉTODOS 1

Índice 1. Por qué validar un método de análisis? 2. Cuándo validar un método de análisis? 3. Validación de métodos de análisis. 3.1. Selectividad 3.2. Linealidad 3.3. Exactitud 3.4. Precisión 3.5. Límites de detección y cuantificación 3.6. Intervalo de trabajo VALIDACIÓN DE MÉTODOS 2

POR QUÉ VALIDAR UN MÉTODO DE ANÁLISIS? Todas las operaciones de un procedimiento de medida suponen introducir errores aleatorios y puede que también sistemáticos, debido a defectos en la instrumentación, defectos en el operador y defectos en el método de análisis Sólo la utilización de un método validado permite al analista dar una respuesta fiable al problema analítico inicialmente planteado La validación de un método de medida garantiza: La calidad de la información analítica La trazabilidad de las medidas La comparabilidad de los resultados Facilitar la transferencia de métodos de análisis entre laboratorios. Apoyar la armonización entre laboratorios. Reconocimiento mutuo de resultados entre laboratorios. VALIDACIÓN DE MÉTODOS 3

CUÁNDO VALIDAR UN MÉTODO DE ANÁLISIS? Norma UNE-EN ISO 17025 Un laboratorio NO debe validar los métodos normalizados (ISO, CEN, AENOR) siempre que su aplicación sea bajo las condiciones estrictamente descritas por mismos, comprobando que lo aplica correctamente (evaluando la exactitud y la precisión de sus medidas, u otras propiedades analíticas de interés para la aplicación prevista). Métodos oficiales (directivas europeas, BOE, EPA, FDA, ) Métodos de referencia (ASTM, AOAC, Farmacopeas, ). Norma UNE-EN ISO 17025 Un laboratorio DEBE validar los métodos no normalizados, los métodos desarrollados en el laboratorio, los métodos normalizados utilizados fuera de su campo de aplicación previsto, y las ampliaciones o modificaciones de métodos normalizados. VALIDACIÓN DE MÉTODOS 4

Validar un método analítico es documentar su calidad Establecer la evidencia documental de que un método conducirá a la obtención de resultados aceptables dentro de las especificaciones de calidad previamente establecidas, demostrando ser útil para el fin deseado Siete parámetros de calidad en una validación: Selectividad Linealidad Exactitud Precisión Límite de detección Límite de cuantificación Intervalo de trabajo VALIDACIÓN DE MÉTODOS 5

Parámetros a ser validados según el tipo de ensayo a realizar TIPO DE ENSAYO Identificación Determinación cuantitativa Determinación cualitativa PARÁMETROS Selectividad Selectividad Linealidad Exactitud Precisión Límite de detección Límite de cuantificación Intervalo de trabajo Selectividad Límite de detección VALIDACIÓN DE MÉTODOS 6

SELECTIVIDAD Capacidad que tiene un método para medir y/o identificar simultáneamente o separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en presencia de otros componentes que puedan estar presentes en la muestra analizada VALIDACIÓN DE MÉTODOS 7

SELECTIVIDAD La selectividad es una medida del grado de interferencias que producen los compuestos que acompañan al analito en la muestra Error constante Sustancias presentes en la matriz de la muestra o añadidas durante el proceso analítico. Se pueden evitar: - Uso de técnicas de separación (cromatográficas) - Optimización de las condiciones de operación (interferentes) - Reacciones de enmascaramiento (interferentes) - Herramientas quimiométricas Errores sistemáticos Error proporcional a la concentración del analito Efectos inespecíficos: efecto de matriz Se pueden evitar: - Calibración por adiciones patrón VALIDACIÓN DE MÉTODOS 8

SELECTIVIDAD Análisis de muestras con interferencias adicionadas o presentes EVALUACIÓN DE LA SELECTIVIDAD Análisis de materiales de referencia Comparación con otros métodos de referencia VALIDACIÓN DE MÉTODOS 9

LINEALIDAD Capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un intervalo de trabajo (una respuesta lineal facilita el trazado, interpolación e interpretación) Procedimiento para determinar la linealidad Estudio a partir de disoluciones patrón según el método de la recta de calibrado. La linealidad se debe establecer a partir de al menos cinco niveles de concentración que abarquen todo el intervalo de trabajo y analizarlos por triplicado (p.e., tres rectas de calibrado en días distintos para el mismo grupo de patrones ) VALIDACIÓN DE MÉTODOS 10

LINEALIDAD: EVALUACIÓN 1. Visualización gráfica de la recta de calibrado y de los puntos que la generan. 2. Ecuación de la recta por el método de mínimos cuadrados, coeficiente de correlación (r) y errores de los distintos parámetros de la recta. 3. Análisis gráfico de los residuos. Criterios de aceptación Los puntos de la recta muestran una linealidad adecuada. El límite de linealidad: punto en que la diferencia entre la señal predicha por el modelo lineal (ŷ) y la señal medida (y) representa el 3% de la señal medida. r 0.999 compuestos mayoritarios; r 0.99 compuestos minoritarios. Gráfico de residuos muestra una distribución de puntos sin ninguna tendencia Test de linealidad: b t s b (intervalo de confianza no debe incluir el cero). Test de proporcionalidad: a t s a (intervalo de confianza debe incluir el cero). - Ordenada en el origen 2-5 % de la señal media en la recta de calibrado. y = a + bx VALIDACIÓN DE MÉTODOS 11

EXACTITUD La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado de una medida y el valor real del mesurado Conocemos el valor verdadero? E No, por eso utilizamos el valor que consideramos xi xv como verdadero E (%) 100 r x i x v x v - Valor certificado de un MRC - Valor obtenido por un método de referencia - Valor obtenido por un método alternativo - Valor añadido a muestras problema F I A B I L I D A D VALIDACIÓN DE MÉTODOS 12

EXACTITUD: EVALUACIÓN Una prueba de hipótesis (prueba t de dos muestras) o un análisis de regresión, determina con un cierto nivel de confianza (95%) que no existen diferencias significativas entre ambos. VALIDACIÓN DE MÉTODOS 13

PRECISIÓN La precisión indica el grado de concordancia entre los valores de ensayos independientes obtenidos en unas condiciones bien definidas VALIDACIÓN DE MÉTODOS 14

PRECISIÓN Repetibilidad Dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes, utilizando el mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipamiento en un intervalo corto de tiempo. Esta es una medida de la variabilidad del método y un reflejo de la máxima precisión que el método puede alcanzar. Precisión intermedia Dispersión de resultados entre ensayos mutuamente independientes utilizando el mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio en diferentes condiciones: distintos operadores, diferente equipamiento o distintos días. Cabe distinguir: entre días, entre equipamiento y entre operadores. Reproducibilidad Dispersión de resultados entre ensayos mutuamente independientes utilizando el mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra en diferentes laboratorios. Cabe distinguir: entre días, entre operadores y entre laboratorios. Implica la máxima dispersión de un mismo proceso analítico. VALIDACIÓN DE MÉTODOS 15

PRECISIÓN: EVALUACIÓN Muestra (s, N<30) Población (m, N>30) Desviación estándar Varianza s s 2 N i1 N i 1 x 2 i x N 2 x i m i1 N 1 x x N 1 2 N 1 i x m 2 N i1 i N 1 2 Desviación estándar relativa Coeficiente de variación (RSD en %) RSD s x i = valor individual; x = media; N = número de medidas; N-1 = grados de libertad; m = media poblacional x RSD s CV 100 CV 100 x m m Este parámetro deberá evaluarse en todo el intervalo de trabajo definido para el método de ensayo: - Un mínimo de 3 muestras a 3 niveles de concentración cubriendo el intervalo especificado (9 muestras en total) - Un mínimo de 6 muestras a la concentración nominal * Introducir los intervalos de confianza para cada nivel de concentración VALIDACIÓN DE MÉTODOS 16

PRECISIÓN: EVALUACIÓN Uno de los factores que más pueden influir en la precisión de un método analítico es la concentración del analito, ya que la desviación estándar de las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la concentración del analito Límites de la DER según la AOAC (1993) y Hortwitz DER Precisión Intermedia 2 DERMétodo VALIDACIÓN DE MÉTODOS 17

LÍMITE DE DETECCIÓN El límite de detección de un método analítico es la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede detectar aunque no cuantificar bajo las condiciones experimentales descritas para dicho método Concentración Analito Señal Analito Señal Blanco 0 0 X B Límite de detección C LD X LD X B +3σ B VALIDACIÓN DE MÉTODOS 18

LÍMITE DE DETECCIÓN MÉTODO BASADO EN EL EXAMEN VISUAL de la mínima concentración detectable MÉTODO BASADO EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA RESPUESTA Y LA PENDIENTE DE LA RECTA DE CALIBRADO LOD 3 σ b B PROCEDIMIENTOS PARA DETERMINAR EL LOD MÉTODO BASADO EN LA RELACIÓN SEÑAL/RUIDO LOD Señal Ruido VALIDACIÓN DE MÉTODOS 19 3

LÍMITE DE DETECCIÓN vs LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN El límite de cuantificación de un método analítico es la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar bajo las condiciones experimentales descritas para dicho método, con una adecuada exactitud y precisión Concentración Analito Señal Analito Señal Blanco 0 0 X B Límite de detección C LD X LD X B +3σ B Límite de cuantificación C LC X LC X B +10σ B VALIDACIÓN DE MÉTODOS 20

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN MÉTODO BASADO EN EL EXAMEN VISUAL de la mínima concentración detectable MÉTODO BASADO EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA RESPUESTA Y LA PENDIENTE DE LA RECTA DE CALIBRADO LOD 10 σ b B PROCEDIMIENTOS PARA DETERMINAR EL LOQ LOD MÉTODO BASADO EN LA RELACIÓN SEÑAL/RUIDO Señal Ruido 10 VALIDACIÓN DE MÉTODOS 21

INTERVALO DE TRABAJO Intervalo de concentraciones de analito en el que puede obtenerse una exactitud, precisión y linealidad adecuadas al objetivo del método Señal LL LOQ Concentración Intervalo de linealidad, intervalo de concentraciones en el que el método presenta una sensibilidad constante. Intervalo dinámico, intervalo de concentraciones en el que el método proporciona una respuesta que varía con la concentración. VALIDACIÓN DE MÉTODOS 22

BIBLIOGRAFÍA BÁSICA 1. Miller, J.N., Millar, J.C., Estadística y Quimiometría para Química Analítica. Prentice Hall, Madrid, 2002. 2. Compañó Beltrán, R., Ríos Castro, A., Garantía de calidad en los laboratorios analíticos, Editoriall Síntesis, 2002. 3. Bell, S. Forensic Chemistry, Pearson International Edition, New Jersey, 2006. VALIDACIÓN DE MÉTODOS 23