PALABRAS CLAVES: Espectrofotometría Ultravioleta-Visible, Validación, Microescala, Fármacos, FNHZ.

Transcripción

1 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS A MICROESCALA PARA LA CUANTIFICACIÓN DE ACIDO ACETILSALICILICO (AAS) Y 2, 4-DINITRO-FENILHIDRAZINA (FNHZ) POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE Magali Yadira Machuca Avila 1, Julio Cesar Rivera Leyva 2 1 División de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Guanajuato, nadeisko@hotmail.com; 2 División de Ciencias Naturales y Exactas Universidad de Guanajuato, juliorivera@hotmail.com. RESUMEN El análisis de fármacos se considera como prioritario, por lo cual se requieren técnicas analíticas confiables. Por otro lado, las técnicas a microescala presentan diversas ventajas para el manejo de pequeños volúmenes de muestras sin generar altos niveles de contaminación. Desarrollar o transferir técnicas analíticas requiere de un cuidoso proceso de validación y evaluación del desempeño de cada método analítico. En este proyecto se desarrollaron dos técnicas a microescala para cuantificar AAS y FNHZ utilizando espectrofotometría ultravioleta-visible. Se utiliza un espectrofotómetro Thermo con celdas de cuarzo de 3 ml y un equipo espectrofotométrico EPOCH con placas de 96 pozos con volumen de 200 µl por pozo. Se observa una diferencia significativa en el comportamiento de los métodos de cuantificación en ambos equipos, ya que la precisión y linealidad, parámetros utilizados para verificar el desempeño de un método analítico varía considerablemente tanto en la cuantificación de AAS como de FNHZ. Se logró establecer las condiciones de trabajo para los métodos a microescala, sin embargo, se considera necesario mejorar algunas condiciones analíticas para disminuir la variación en la precisión de ellos. PALABRAS CLAVES: Espectrofotometría Ultravioleta-Visible, Validación, Microescala, Fármacos, FNHZ. INTRODUCCIÓN La espectroscopia ultravioleta-visible o espectrofotometría ultravioleta-visible (UV/VIS) es una técnica analítica que se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de moléculas, y para determinar el contenido de compuestos en distintos tipos de sustancias. La determinación se basa en utilizar la radiación electromagnética (luz) de las regiones visible, ultravioleta cercana (CUV) e infrarroja cercana (CIR) del espectro electromagnético. La radiación absorbida por las moléculas desde esta región del espectro provoca transiciones electrónicas que pueden ser cuantificadas. Se utiliza de manera general en la determinación cuantitativa de los componentes de soluciones de iones de metales de transición y compuestos orgánicos altamente conjugados (con dobles o triples enlaces en su estructura [1]. En los laboratorios farmacéuticos es de gran importancia contar con técnicas analíticas para la determinación de principios activos que sean confiables, además de rápidas para la cuantificación de dichos compuestos. La espectrofotometría ultravioleta-visible es una técnica de elección para el análisis de contenido de principios activos y de la potencia de medicamentos. Dado que la utilización de medicamentos está dirigida principalmente a humanos, es imprescindible que las técnicas analíticas demuestren su aplicación a distintos niveles de confiabilidad y con la mayor precisión posible [2]. De este aspecto se desprende la oportunidad de desarrollar técnicas a microescala, ya muy difundida en el ámbito químico y que ha presentado diversas ventajas: Permite optimizar recursos y así reducir la generación de residuos. Mejoramiento de la calidad del aire dentro del laboratorio y disminución de riesgos a la salud por la emanación de vapores tóxicos. Reducción de riesgos de accidentes de laboratorio provocados por reactivos cáusticos, inflamables o explosivos. Si estos accidentes ocurren, serán necesariamente menos graves. [3]. La confiabilidad de la metodología se puede lograr mediante los adecuados procesos de validación analítica. La norma NOM-059-SSA indica que los métodos analíticos

2 utilizados para cuantificar principios activos en materia prima y en productos farmacéuticos deben estar validados adecuadamente de forma obligatoria [4]. De esta manera se garantiza la debida reproducibilidad de los métodos analíticos en cada laboratorio. Por otro lado, la evolución de los equipos analíticos cada vez más sofisticados, sensibles y modernos hacen necesario el traslado de técnicas analíticas que presenten mayores ventajas, incluyendo el volumen de manejo de muestras, sin perder eficiencia con respecto a las condiciones originales. Por esta razón, se pretende en este trabajo, desarrollar métodos analíticos para la cuantificación de AAS y de FNHZ en un espectrofotómetro ultravioleta visible con celdas de 3 ml de volumen y un espectrofotómetro ultravioleta que utiliza placas con pozos de 200 µl. [5]. HIPOTESIS: Los métodos desarrollados para cuantificar AAS y FNHZ con volúmenes de muestra de 3 ml y con 200 µl no presentarán diferencias en precisión, exactitud y rango de trabajo. OBJETIVO GENERAL: Desarrollar un método de cuantificación de AAS y FNHZ a por espectrofotometría ultravioletavisible a microescala. OBJETIVOS ESPECIFICOS: Capacitación en el manejo de los equipos espectrofotométricos Thermo y Epoch. Desarrollo de un método para cuantificar AAS en ambos equipos espectrofotométricos. Desarrollo de un método para cuantificar FNHZ en ambos equipos espectrofotométricos Validar los métodos desarrollados. MATERIALES Y MÉTODOS Para desarrollar el proyecto trabajo, este fue dividió en dos etapas: 1) Capacitación y, 2) Desarrollo de y validación de los métodos a microescala. Para la capacitación en manejo de los equipos y preparación de curvas se utilizó una curva de paracetamol con 7 niveles de concentración: 0.5, 1, 5, 10, 12.5, 15 y 20 µg/ml por triplicado durante varios días hasta que se alcanzó una r > 0.99 y una precisión menor al 3 % de CV % por día, leyendo las muestras preparadas en el espectrofotómetro con arreglo de diodos Thermo, el cual utiliza una celda de 3 ml de volumen. Para el desarrollo de los métodos de cuantificación, se corrieron los espectros de AAS y FNHZ, eligiendo una longitud de máxima absorción, se prepararon curvas con al menos 5 niveles de concentración (5, 0.1, 1, 5, 10, 100 µg/ml para AAS y 50, 100, 250, 500, 750 y 1000 µg/ml para la FNHZ). Se prepararon 3 curvas por día y se determinó la linealidad (r>0.99 para cada curva) y la precisión (CV %< 3% para cada día) durante 3 días diferentes, leyendo en el espectrofotómetro Thermo con celda de cuarzo de 3 ml de volumen y en el espectrofotómetro EPOCH utilizando placas NUNC de 96 pozos con volumen de 200 µl. Se establecieron las diferencias entre los métodos en volumen de 3 ml y 200 µl en base a la sensibilidad obtenida, la linealidad y precisión en cada día de evaluación y se procedió a elegir las mejores condiciones de lectura en el espectrofotómetro EPOCH. Posteriormente se corrigieron los intervalos de concentración y se validó cada método con estás condiciones finales determinando la linealidad, la precisión y la exactitud de cada método durante 3 días, así como los límites de detección y cuantificación utilizando los criterios del intercepto y la pendiente. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la figura 1 se puede apreciar el grado de variabilidad obtenida en la preparación de curvas de paracetamol preparadas durante 6 días por triplicado y leídas en el equipo THERMO a 250 nm. La tabla 1 muestra la precisión obtenida en cada día de trabajo mediante el CV % a cada nivel de concentración. Se puede apreciar que la precisión va aumentando (al disminuir el CV %), lo cual indica que se adquiere habilidad en la preparación de las curvas, corrigiendo diferentes factores de trabajo: pipeteo, manejo de muestras en la lectura, mejora en el aforo de volúmenes, etc. De igual forma, en la tabla 1 se encuentran los parámetros de regresión de las curvas de cuantificación de paracetamol, y se aprecia que el coeficiente de correlación va incrementando,

3 alcanzando un valor a r> 0.999, con lo que interpretamos una mejora sustancial en la preparación de las curvas al disminuir la variabilidad del analista al realizar todas las actividades inherentes al desarrollo del método analítico en cuestión Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día Concentración µl/ml Figura 1. Curvas de paracetamol cuantificadas en el espectrofotómetro Thermo con celda de cuarzo de 3 ml (1 cm 2 ) Tabla 1. Precisión del método de cuantificación de paracetamol durante 6 días determinado con el CV % (Coeficiente de variación) y parámetros de regresión de las curvas de cuantificación promedio. Concentración Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 µg/ml CV % Parámetros de regresión m b r Una vez finalizada la capacitación se procedió al desarrollo del método de cuantificación de AAS, utilizando el máximo de absorción a 320 nm. Las curvas preparadas se leyeron en el espectrofotómetro con un volumen de 3 ml (THERMO) y en el equipo con celda de 96 pozos con un volumen de 200 µl (EPOCH). En la figura 2(a) se aprecian las diferencias entre las curvas obtenidas con ambos equipos, encontrando que no se tiene el mismo comportamiento, ya que las lecturas en el equipo THERMO presentan un comportamiento lineal en el rango evaluado, y en el equipo EPOCH se observan lecturas menores, debido principalmente a la cantidad de analito presente, y que influye en la sensibilidad de las lecturas. En la tabla 2 puede observarse que la precisión es mayor en el equipo THERMO a concentraciones mayores a 5 µg/ml, y en el equipo EPOCH los valores de CV% son mayores en prácticamente todo el rango de trabajo, en los dos días evaluados, mostrando una menor precisión.

4 ml (a) 3 ml (b) 200 µl (a) 200 µl (b) Día 1 Día Figura 2. (a) Comparación del comportamiento de las curvas de cuantificación de AAS en los equipos THERMO y EPOCH (b) Curvas de Cuantificación de AAS para la evaluación de linealidad en el equipo EPOCH. Los coeficientes de regresión de AAS en ambos equipos fueron mayores a 0.99, mostrando excelente linealidad, aunque con baja precisión. La figura 2(b) muestra las curvas de AAS en el equipo EPOCH, indicando una excelente linealidad, con coeficientes de regresión r, mayores a 0.99 durante la validación (Tabla 2). Los límites de de detección y cuantificación en el equipo EPOCH para AAS fueron y µg/ml respectivamente, indicando con ello que el equipo EPOCH no puede utilizarse para determinar concentraciones de AAS menores a 100 µg/ml. Tabla 2. Evaluación de la precisión del método de cuantificación de AAS en los equipos THERMO (3 ml) y EPOCH (200 µl), durante el desarrollo y la validación del método, así como los límites de detección y cuantificación en el equipo EPOCH. Thermo 3 ml EPOCH 200 µl Validación Concentración Día 1 Día 2 Día 1 Día 2 Concentración Día 1 Día 2 µg/ml CV % µg/ml CV % Parámetros de regresión m m b b r r LD LQ µg/ml µg/ml En la figura 3 (a) se puede observar la diferencia entre las curvas de FNHZ cuantificadas a 430 nm, encontrando lecturas menores correspondientes a la evaluación en el equipo EPOCH. La figura 3 (b) muestra las curvas de cuantificación de FNHZ con las que se evalúa la linealidad y se encuentra un valor de correlación r>0.99 durante los 3 días evaluados. En la tabla 2 se

5 puede apreciar que la precisión en ambos métodos es baja sobre todo en concentraciones menores a 5 µg/ml, apreciado por el alto valor del CV % estimado para ambos equipos ml (a) 3 ml (b) 3 ml (c) 200 µl (a) 200 µl (b) 200 µl (c) Día 1 Día 2 Día Figura 3. (a) Comparación del comportamiento de las curvas de cuantificación de FNHZ en los equipos THERMO y EPOCH (b) Curvas de Cuantificación de FNHZ para la evaluación de linealidad en el equipo EPOCH. Tabla 3. Evaluación de la precisión del método de cuantificación de FNHZ en los equipos THERMO (3 ml) y EPOCH (200 µl), durante el desarrollo y la validación del método, así como los límites de detección y cuantificación en el equipo EPOCH. Thermo 3 ml EPOCH 200 µl Validación Concentración Día 1 Día 2 Día 1 Día 2 Concentración Día 1 Día 2 Día 3 µg/ml CV % µg/ml CV % Parámetros de regresión m m b b r r LD 3.95 µg/ml LQ µg/ml

6 Para la validación del método utilizando el equipo EPOCH se aprecia una mejora en la precisión en concentraciones mayores a 5 µg/ml. Los límites de detección y cuantificación fueron 3.95 y µg/ml respectivamente. Los métodos desarrollados utilizando el equipo EPOCH requieren de un intervalo de cuantificación mayor a 5 µg/ml para los compuestos evaluados, pues la precisión tiende a ser menor a concertaciones mas pequeñas (evaluado por un incremento del CV %). El coeficiente de regresión permite verificar el grado de correlación entre la concentración y la absorbencia, siendo en todos los casos mayor a 0.99, y con este se puede verificar si se trabaja correctamente en la preparación de curvas. Para los métodos desarrollados este parámetro siempre se comportó de forma adecuada. A pesar de no alcanzar a cumplir con un CV %< 3 % como indica la NOM-177-SSA!-1998, se aprecia una mejora en el trabajo experimental, una selección del intervalo de cuantificación más adecuado para cada analito evaluado, sin embargo se observa que los métodos a microescala (200 µl de volumen de lectura) son poco sensibles presentando limites de cuantificación mayor a 10 µg/ml para cada analito evaluado. CONCLUSIONES Se logró una capacitación adecuada para el analista durante el desarrollo del proyecto, los métodos para AAS y FHZN evaluados utilizando 3 ml de volumen presentan buena precisión un excelente coeficiente de correlación (mayor a 0.99), mientras que para los métodos en el equipo EPOCH la precisión es menor, requiriéndose concentraciones de trabajo mayores a 5 µg/ml para cada analito evaluado. La validación permitió encontrar estas conclusiones. AGRADECIMIENTOS Se agradece el apoyo del Departamento de Farmacia de la División de Ciencias Naturales y Exactas de la Universidad de Guanajuato para el desarrollo de este trabajo en sus instalaciones, así como a la Universidad de Guanajuato por la beca de estudiante aportada. REFERENCIAS [1] Fundamentos de la Espectroscopia Aplicada a la Instrumentación Química. DCNE, Fernando de Jesús Amezquita López, 4ª Edición [2] Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos 8ª Edición, 2008, México. [3] Determinación de cinc a Microescala en un medicamento específico. Química. Nova. Vol.27.No.5, , 2004 [4] NORMA Oficial Mexicana NOM-059-SSA1-2006, Buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos. [5] NORMA Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-1998, Que establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable. Requisitos a que deben sujetarse los terceros autorizados que realicen las pruebas.