Glucósidos Cianogénicos en Productos de Yuca

Transcripción

1 Glucósidos Cianogénicos en Productos de Yuca Darwin Ortiz Osorio* Teresa Sanchez* Harold Acosta Zuleta** *CIAT, Centro internacional de agricultura Tropical, **Ph.D. Profesor titular, escuela de ingeniería de alimentos. Universidad del Valle

2 Glucósidos Cianogénicos Son carbohidratos que producen algunas planta y son productos intermediarios de la biosíntesis de algunos aminoácidos.

3 Yuca Melocotón Ciruelas Pera Almendras amargas Sorgo Alimentos con cianoglucósidos Cereza Limón Remolacha azucarera Manzana

4 Enfermedades asociadas al consumo de yuca Konzo o bukabuka Causa parálisis y deformación irreversible de las piernas Neuropatía atáxica tropical, "TAN" Causa dificultad progresiva para caminar, se presenta urgencia o retención urinaria, estreñimiento, dolor lumbar e impotencia Niño enfermo de konzo Fotografías cortesía de Konzo.info. Facultad de Medicina de la Universidad de Bergen Thorkild Tylleskar, 2002.

5 Técnica Analítica Etapa de Extracción Hidrólisis Enzimática Destilación del Cianuro Etapa de Cuantificación

6

7 CH 2 OH CN CH 2 OH OH OH O O C CH 3 CH 3 H2O β glucosidasa OH OH O OH HO CH 3 C CH 3 CN OH Linamarina, Glucósido Cianogénico DGlucosa OH Cianohidrina CH 3 HO C CN HCN O C CH 3 CH 3 CH 3 Cianohidrina Acetona

8

9

10

11 Cl O N S Na O Na N H HCN CNCl O S O O O O O CNCl Cl N N CN

12 O O COO N Cl H 2 O O C C C H H CH2 C H O CN N N O CH 2 O C C C H H COO CH2 C H O H 2 C CH 3 N N CH 3 O N N O C C H C H COO C CH2 C H C CH 3 N N CH 3 O

13

14

15

16 Como aseguramos que la metodología funciona? LINEALIDAD EXACTITUD ROBUSTEZ Validación de Métodos Analíticos SENSIBILIDAD PRECISIÓN

17 Análisis de Muestras Prueba t por parejas, y comparación de dos medias experimentales Ho = Las medias de los resultados dados por ambos métodos son iguales Ha = Las medias de los resultados por ambos métodos son significativamente distintas Bolsa 1 t calculado > t tabla La diferencia entre los dos resultados es significativa al nivel del 5 % Bolsa 2 Método Japón Método CIAT Método Japón Método CIAT Promedio 25,54 ± 1,39* 22,90 ± 0,84* 18,48 ± 0,65* 14,67 ± 0,54* Desviación estándar 3,13 1,90 1,21 1,02 LC 95% 1,39 0,84 0,65 0,54 Numero de muestras t calculado 3,39 9,61 t tablas 2,04 2,04 * Los limites de confianza son calculados al 95 %

18 CONCLUSIONES La etapa de extracción del cianuro en la muestra es crítica porque proporciona un nivel de error elevado La curva de calibración del método presenta dos intervalos de respuesta lineal, uno entre ppm y el otro desde 1.2 y 2.4 ppm. La ecuación de la recta para el primer caso es Y = (± 0.038) X (± 0.018) El límite de detección para la determinación de cianuro, hallado según la definición de la IUPAC y basado en la curva de calibración a bajas concentraciones de analito fue de ppm, el límite de cuantificación establecido con base en el intervalo de respuesta lineal fue de 0.1 ppm

19 Los coeficientes de variación para la repetibilidad y precisión intermedia, tanto para el sistema como para el método, se encontraron por debajo de los valores aceptados para los niveles de concentración ensayados; esto permite concluir que tanto el sistema como el método tienen buena precisión intralaboratorio El método de adición de estándar en la determinación de cianuro mostró resultados cercanos al 100 %. Estos permite decir que el método es exacto

20 Gracias

21 Linealidad 3 curvas de calibración, preparadas en días diferentes, en el intervalo de ppm de HCN. Cada punto de la Curva se le midió la absorbancia por triplicado Absorbancia 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 y = 1,3006x 0,0214 R 2 = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 Concentración de HCN, (ppm)

22 Intervalo de Respuesta Lineal ppm de HCN Análisis de Varianza para el intervalo ppm, se realiza el análisis para las tres curvas en conjunto Curvas promedio para los 3 dias evaluados en el intervalo 0,1 0,8 ppm Absorbancia 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Dia 1 Dia 2 Dia 3 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Concentración ppm

23 Test de Cochran, homogeneidad de varianzas Gexp =0,4670; Gtablas (α = 0,05, K=5, n=3)= 0,6161 Gexp < Gtablas, las variancias de las concentraciones son homogéneas, el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados Normalidad de los residuales. se observa que la distribución de los residuales, es completamente aleatoria, no se observa ninguna tendencia 0.12 Residuos Concentración de HCN, (ppm)

24 Ecuación de la Recta obtenida Y = (± 0.038) X (± 0.018) (r = ) Coeficiente de correlación. Indica que un % de la variación de la respuesta es explicada por la recta de regresión. ANOVA. Prueba F Ho = El cuadrado medio de la regresión (CM reg) es igual a el cuadrado medio residual (CM res) (Ho: CM reg = CM res, Ha = CM reg CM res), F calculado = F crítico (P = 0.05) = 2.36 x 1016, Existe correlación muy significativa entre x e y. Absorbancia 1,2 0,9 0,6 0,3 y = 1,2955x 0,0109 R 2 = 0,9864 0,0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Concentración de HCN,(ppm)

25 TEST DE LINEALIDAD Test de verificación de la pendiente o linealidad Ho = La pendiente no es significativamente diferente de cero. Ha = La pendiente es significativamente diferente de cero. t calculado = 34.00, t teórico (P = 0.05, gl = 16) 2.12, t calculado> t teórico Existe diferencia significativa entre la pendiente y cero. Intervalo de confianza de la pendiente = 1,2955 ± 0,081 (1.376, 1.215) y se observa que este intervalo no incluye el cero. t = exp b s b

26 Test de verificación de la variable independiente o de proporcionalidad Ho = No existe diferencia significativa entre el intercepto y cero. Ha = Existe diferencia significativa entre el intercepto y cero. t calculado = 0.6 t teórico (P = 0.05, gl = 16) 2.12, texp < ttablas La ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero Intervalo de confianza del intercepto 0,018 ± 0,081 (0.049, 0,0273). t = exp a s a

27 Sensibilidad LD= y bl 3 b n s bl LC= y bl 10 b n s bl Método de Bajas Concentraciones Limite de detección = 0,004 ppm Limite de cuantificación = 0,012 ppm Método Miller Limite de detección = ppm Limite de Cuantificación = 0.015

28 Precisión Se calculan los coeficientes de variación para cada uno de los parámetros evaluados, es decir; Repetibilidad (sistema y método), Precisión Intermedia (sistema y método) CV(%) = 2 (1 0.5log( C)) Concentración 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 CV(%) 22,63% 20,38% 19,18% 18,37% 17,76% 17,28% 16,88%

29 Repetibilidad del Sistema Se observan que los coeficientes de variación obtenidos son inferiores al 10% Concentración* Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Promedio Desviación CV, CV, CV, CV, CV, (P= 0.05) Estándar % % % % % ± ,7 9,7 5,5 4,3 2,5 6,1 3, ± ,6 8,0 3,2 4,6 3,8 4,6 1, ± ,7 9,4 4,4 5,3 5,3 5,6 2, ± ,7 5,6 5,6 3,9 4,0 4,5 0, ± ,2 6,0 10,0 4,6 5,9 6,2 2, ± ,7 4,9 5,5 7,8 8,5 5,9 2, ± ,0 12,0 3,0 5,2 6,6 6,0 3,73

30 Precisión Intermedia del Sistema Se observan coeficientes de variación inferiores al 13 % Respuesta Promedio, Abs 0,139 0,279 0,416 0,555 0,675 0,792 0,883 Desviación Estándar 0,02 0,02 0,02 0,03 0,06 0,08 0,05 CV % 12,78 6,62 4,28 5,05 9,57 10,18 5,90

31 Repetibilidad y Precisión intermedia del método Concentración Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Teórica 0,123 0,127 0,118 0,097 0,103 0,133 0,126 0,127 0,091 0,145 0,108 0,143 0,145 0,106 0,129 0,148 0,125 CV (%) 12,994 8,110 10,369 21,886 0,293 0,263 0,227 0,235 0,206 0,269 0,249 0,253 0,214 0,309 0,257 0,268 0,248 0,281 0,322 0,236 0,237 CV (%) 5,988 12,203 21,391 6,199 0,473 0,362 0,331 0,329 0,309 0,355 0,418 0,421 0,399 0,451 0,368 0,374 0,339 0,423 0,382 0,301 0,307 CV (%) 12,040 6,591 23,322 11,402

32 Exactitud 0,7 Muestra 1 Absorbancia 0,5 0,2 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Curva Promedio 0,0 0,08 0,16 0,24 0,32 Concentración de HCN, (ppm) Curva Patrón Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 endiente P= 0.05) ± ± ± ± ± 0,09

33 Prueba t student Ho = No hay diferencias significativas entre las pendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curva patrón promedio. t calculado = 0.597; t crítico fue 3.18, t calculado < t critico Estadísticamente las pendientes obtenidas de las curvas de adición estándar son iguales a la de la curva de adición patrón. No hay efectos de matriz en las muestras analizadas. Test de Cochran. Prueba de igualdad de variancias de varios grupos muéstrales del mismo tamaño Ho = El factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados G calculado = 0.624; G crítico , G calculado < G crítico El factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

34 Comparación de los dos métodos de cuantificación Se observa que los porcentaje de recuperación son cercanos al 100%, indicando que: La variación entre las dos formas de determinar las concentraciones es mínima y no es necesaria la adición de patrón para determinar cianuro en muestras de croqueta de yuca. Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Concentración con adición de estándar 31,03 40,66 41,92 31,38 Concentración por lectura directa 38,21 39,16 38,85 35,04 Porcentaje de recuperación 81,21 103,83 107,90 89,55

35 Concentración % Recuperación Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 0, ,48 87,96 96,67 86,60 0, ,71 100,37 88,77 109,89 0, ,50 94,60 85,00 108,65 R(n = 12) 99,60 DS 11,93 CV% 12,0 Test de t, (α = 0.05) Ho = no existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100. t calculado = 0.116, t critico 2.20, t calculado < t crítico No existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100% La exactitud del método analítico es correcta.

36 Robustez Se construyó una matriz de diseño, la cual se define como el valor que deben tomar cada uno de los factores a evaluar en cada uno de los experimentos a realizar. Nivel Factores Factor A: Temperatura del Baño 35ºC 45ºC Factor B: Tiempo de Reacción Colorimétrica 30 min. 50 min. Factor C: Tiempo de reacción cloramina T 3 min. 7 min.

37 ABC BC AC AB C B A Nº Ensayo Interacciones Factores

38 Efecto único (efecto principal) Efecto Intervalo de confianza A B C Interacción de dos factores AB AC BC Interacción de tres factores ABC El factor que no incluya el cero dentro del intervalo de confianza significa que el análisis se encuentra influenciado por la variación del factor en cuestión, el factor que incluya el cero se considera que su efecto es negligible

39

40

41 Recomendaciones La hidrólisis enzimática emplea gran parte del tiempo de la técnica analítica, es indispensable realizar un estudio con el objetivo de reducir en lo mínimo el tiempo empleado Adaptar la técnica analítica a un equipo de destilación por arrastre de vapor que sea mas eficiente y el tiempo de destilación se reduzca, ya que por el momento la técnica analítica no permite realizar análisis de rutina Realizar estudios de eficiencia de la enzima con el objetivo de reducir la cantidad de enzima utilizada Realizar ensayos a micro escala con el fin de reducir en lo mas mínimo la cantidad de reactivos utilizado Realizar un estudio de robustez de la técnica completa, es decir; incluyendo la etapa de la hidrólisis enzimática

42