Electroforesis de DNA

DNA Topoisomerasas Izquierda Derecha

Enzimas de restricción Clasificadas en 3 tipos, donde la mayoría pertenece al grupo II (proteínas monoméricas, poseen simetria rotacional y generalmente requieren Mg 2+ Secuencias palindrómicas Isosquisomeros: Varias enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia, donde, algunas cortan sec blanco en diferentes posiciones. Sma I / Xma I Secuencias metiladas: A*: N 6 -metiladenina C*: 5-metilcitosina : Hpa II y Msp I Reconocen la secuencia CC*GG Hpa II: no digiere DNA metilado Msp I: Digiere met o no-metilado *90% de las metilaciones en genomas ocurren en 5.metilcitosina en C*G

Clonamiento de DNA

Desfosforilación de vectores (para evitar asociación intramolecular)

68 kda DNA Ligasa Actividad se mide en Unidase Weiss (Weiss, 1968)

Ligación de extremos cohesivos

Generación de cdna

Fabricación de replicas en Nitrocelulosa e hibridación in situ (en placa) Screening: Rastreo, Escrutinio

Fago Lambda como vector de clonamiento

Clonamiento de DNA en plasmidos

DNA plasmidal PBR322

Clonamiento de DNA en plasmidos

Denaturación y Renaturación del DNA Construcción de bibliotecas de secuencias únicas

Southern, E. M. (1975) J.Mol. Biol. 98, 503-517 Southern y Northern blot

Southern blot

Eliminación de fragmentos de Okazaki

Eliminación de fragmentos de Okazaki (Reacción de Nick translation) + Mg 2+ DNA pol I (E. coli) Holoenzima (monómerica) de 109 kda. 5 3 Polimerasa 5 3 exonucleasa 3 5 exonucleasa Alternativamente: Marcaje por random Primer o incorporación en reacción de PCR

SINTESIS de DNA in vitro Reacción de polimerización en cadena = polymerase chain reaccion (PCR) - Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA templado) - Múltiples copias (de una molécula templado 1 millon de copias) - DNA polimerasa (termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq Pol) - Partidores, un par (los partidores dan la especificidad de la reacción) - dntps - Tampón (Mg 2+, tampón) 30 ciclos de amplificacion: denaturacion 94ºC, 30seg apareamiento, 40-60ºC, 30seg extensión, 72ºC, 30seg ESPECIFICIDAD VELOCIDAD SENSIBILIDAD CONTROLES!

SINTESIS DE DNA in vitro PCR INICIACION cuando y donde ELONGACION - Iniciacion, elongacion, terminacion - in vitro - multiples veces un fragmento de DNA - par de partidores sentido y antisentido secuencia especifica - DNA polimerasa termoestable TaqPol (Thermophylus aquaticus) -ciclos de denaturacion, apareamiento, extension TERMINACION -Extension final y guardar a 4ºC

Taq DNA pol (Thermus aquaticus) MW 65 kda PCR

PCR de MICROSATELITES GATCGGATAACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGGTA 5 CACCTGATATCTGGTA Partidor 2 TGTGTGTGTGTGTGTG MICROSATELITE CGACACTACCAGATG lll111111111111 3 GCTGTGATGGTCTAC Partidor 1 5 CACCTGATATCTGGTA 3 llllllllllllllll 3 GTGGACTATAGACCAT ACACACACACACACAC GCTGTGATGGTCTAC 5 3 5 Marcadores genéticos: Identidad, medico legal, paternidad, etc

pb 210 200 190 180 170 160 150 140 1 2 3 4 5 6 7 170 188 HMS7 Análisis de microsatélites de caballos 130 120 140 HTG4 120 Sistema manual en geles de poliacrilamida modificada, Spreadex en geles de 10 cm y tinción con bromuro de etidio. pb 250 240 230 220 210 200 190 180 170 160 150 140 1 2 3 4 5 6 7 218 238 HMS2 149 172 HMS3

R-Loops

R-Loops Microscopía Electrónica, Tinción Negativa Metodología alternativa: Ensayos de digestion con nucleasa S1, Degrada preferencialmente ssdna o RNA. También para generar extremos romos y apertura del hairpin generado en la segunda hebra del cdna

Replicación Viral: Circulo rodante y desplazamiento de hebra. (MET) Tinción negativa

Denaturación y Renaturación del DNA Construcción de bibliotecas de secuencias únicas

Denaturación del DNA e Hipercromicidad

Secuenciación de DNA (Sanger,1977) Enzima/ Propiedades Frag. Klenow (DNA pol I) Sequenasa Procesividad 10-50 nt 2000-3000 nt Velocidad de Polimerización 45 nt/seg 300 nt/seg Taq DNA pol >7600 nt 35-100 nt/seg Klenow: MW 76 kda, carece de actividad 5 3 exonucleasa por remoción proteolítica (Klenow, 1970). Sequenasa: DNA pol T7 modificada químicamente (sin activ. 3 5 exonucleasa)

Secuenciación de DNA (Sanger,1977)

Secuenciación Automatizada de DNA

DNA Fingerprinting AFLP AFLP Amplified Fragment polymorphism RFLP Restriction Fragment Length polymorphism RAPD Random Amplified polymorphic DNA DAF DNA Amplification Fingerprinting SSCP Single Strand Confirmational polymorphism Microsatellite

Análisis de Microarreglos de DNA

Microarreglos de DNA

Microarreglos de DNA Síntesis in situ y análisis in silico

Microarreglos de DNA

Expresión Génica Temporal por microarreglos de DNA