Filogenia y Taxonomía bacteriana 2015
Evolución: implica - descendencia con modificación - desaparición de formas de vida - diversidad de organismos actuales - elevado nivel de complejidad - organismos bien adaptados, bajo la presión de la selección natural.
De qué manera se produce la evolución de los organismos? Mediante variación en la secuencia de DNA Cómo se producen estas variaciones en la secuencia de DNA? Mutaciones (errores en la replicación, UV etc.) - Adaptativas: mejoran la capacidad de supervivencia - Deletéreas: disminuyen la capacidad de supervivencia - Neutrales: ni mejoran ni disminuyen. Otros: Duplicación génica Transferencia génica horizontal Recombinación homóloga Mejorar la supervivencia de los organismos bajo las nuevas condiciones ambientales
A QUÉ SE DENOMINA FILOGENIA? -Estudia las relaciones evolutivas entre los organismos. -Las relaciones filogenéticas entre las células se pueden deducir mediante la comparación de la información genética que existe en sus ácidos nucleicos o en sus proteínas. -Las moléculas que forman el ribosoma, en particular las del RNA de los ribosomas (rrna), resultan ser indicadores excelentes para determinar las relaciones evolutivas.
GENES UTILIZADOS EN EL ANÁLISIS FILOGENÉTICO Genes de la subunidad pequeña del RNA ribosómico (small subunit ribosomal RNA o SSU rrna) - Procariotas: genes que codifican el rrna 16S - Eucariotas: los genes del rrna 18S. Procariota: 70S Eucariota: 80S 30S: rrna 16S y 21 proteínas 50S: rrna 5S y 23S y 31 proteínas -Imágenes tomadas de: www. Google/ imágenes
POR QUÉ SON APROPIADOS LOS GENES DE LA SUBUNIDAD PEQUEÑA DEL RNA RIBOSÓMICO PARA EL ANÁLISIS FILOGENÉTICO? - están universalmente distribuidos - son estables y constantes en su función, forman parte integral de la maquinaria de síntesis proteica básica de toda célula viva - están lo suficientemente conservados (cambian lentamente) - tiene la longitud adecuada, de tal modo que proporcionan una visión de la evolución que abarca todos los organismos vivos. Base de datos de secuencias génicas de rrna: Ribosomal database Projet II (RPD-II: http://rdp.cme.msu.edu)
MOLÉCULAS USADAS PARA MEDIR DIVERGENCIAS EVOLUTIVAS RELOJ O CRONOMETRO MOLECULAR: un gen (rrna), cuya secuencia de DNA puede emplearse como medida temporal comparativa de divergencia evolutiva. RNAs ribosómicos (rrna) : 5S, 16S y 23S (Carl Woese) Proteínas conservadas: factor de elongación Tu (síntesis de proteínas), proteína de choche térmico Hsp60, sintetasas de trna. Varios citocromos Ferrodoxinas (proteínas de hierro y azufre) Subunidad beta de ATPasa Gen reca (proteína: recombinasa, requerida para la recombinación genética, solo en bacterias)
rrna Procariota: 70S 30S: rrna 16S y 21 proteínas 50S: rrna 5S y 23S y 31 proteínas NOMBRE TAMAÑO UBICACIÓN (nucleótidos) 5S 120 Subunidad mayor 16S 1500 Subunidad menor 23S 2900 Subunidad mayor Fuente: Brock. Biología de los Microorganismos.10ª ed. El correlativo eucariótico es el rrna 18S de los ribosomas 80S
El gen de la subunidad grande del 23S rrna ( LSU rrna) también resulta útil para proveer información filogenética, en tanto que su secuencia es más larga proporciona información adicional, si bien es más cara y lenta de secuenciar. Dado que el RNA 16S es más manejable experimentalmente que el RNA 23S, se ha utilizado preferentemente para desarrollar la filogenia en procariotas (en eucariotas se secuencia el rrna 18S de los ribosomas 80S).
SECUENCIAS DEL RNA RIBOSÓMICO y árboles filogenéticos: Los métodos para obtener secuencias del rrna y generar árboles filogenéticos implican una combinación de Biología Molecular y análisis computarizado. Las nuevas secuencias generadas se comparan con secuencias obtenidas de bases de datos: RDP II: Base de Datos del Proyecto de Secuenciación Ribosómica (contiene una colección de secuencias, actualmente supera las 440.000 y proporciona una variedad de programas de análisis) Dirección online: http://rdp.cme.msu.edu/html/ GenBank (USA) DDSS (Japón) EMLB (Alemania) Utilizando un programa de análisis, se generan árboles filogenéticos y se selecciona el que mejor se adapte a la información evolutiva presente en las secuencias.
Árboles filogenéticos: representación de las líneas de descendencia y la relación entre dos organismos deben interpretarse y se construyen a partir de un parentesco (similitudes y diferencias) con un ancestro común A partir de diferencias en la secuencia de nucleótidos: construcción de un árbol filogenético, que ilustra gráficamente las relaciones entre secuencias de los organismos. Está compuesto de ramas y nodos. Los nodos internos: los ancestros Los extremos de las ramas: las distintas cepas de las especies bacterianas de las cuales se obtuvieron las secuencias. Ramas: definen el orden de la descendencia, los ancentros de los nodos y la longitud: N de cambios. Cuanto mas reciente sea el ancestro común compartido entre dos especies, más cercanas se consideran esas especies. Ej: la B esta mas cercana a la C que a la A, porque B y C comparten un ancestro común mas reciente (nodo 2) que B y A (nodo1) Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12ª ed.
PASOS A SEGUIR PARA GENERAR UN ÁRBOL FILOGENÉTICO DNA Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12ª ed.
Amplificación por PCR del gen del 16 rrna a partir del DNA genómico: obtención suficiente cantidad de DNA del gen del 16 rrna para poder secuenciar, con el uso de cebadores específicos: Amplificación por PCR del gen del 16S rrna Termociclador Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12ª ed. y de www.google/imagenes. 1465 nucleótidos
SECUENCIACIÓN DEL DNA Secuenciación: determinación del orden preciso de los nucleótidos en una molécula de DNA (o RNA). - Se utilizan cebadores cortos (10 a 20 nucleótidos) de DNA: iniciadores de la síntesis de nuevas cadenas MÉTODOS: Método didesoxi de Sanger - Secuenciación automatizada - Pirosecuenciación 454
1-MÉTODO DIDESOXI DE SANGER Se basa en el uso de: -Dideoxinucleótidos (ddntp) :carecen del grupo OH en el carbono 3 y la elongación de la cadena no puede continuar Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 10 ed.
2 7 1 5 6 4 3 Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 10 ed.
Secuenciación automatizada: se utilizan cebadores marcados con pigmentos fluorescentes. Los productos se separan por electroforesis automatizada y las bandas se detectan por espectroscopia de fluorescencia. Los resultados son analizados por un ordenador y se genera una secuencia, en la que cada una de los 4 bases se distingue por un color. Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed. Pirosecuenciación 454: genera datos de secuencias cien veces más rápido que los métodos anteriores. Se libera un grupo pirofosfato que aporta la energía necesaria para la liberación de luz-
ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS: consiste en alinear dicha secuencia con la secuencia de genes homólogos de otras cepas o especies, identificándose las diferencias (desapareamientos, inserciones delecciones o huecos). Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed. Programa BLAST(Basic Local Alignment Search Tool: thhp://www.ncbi.nim.nih.gov/blast
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ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS: Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed.
Aspectos que asocian bacterias o arqueas con eucariotas Características Bacterias Arqueas Eucariotas Lípidos de membrana enlace éster enlace éter enlace éster Fotosíntesis c/clorofila Sí No Sí Presencia de histonas No Sí Sí Pared celular contiene Ác murámico No contiene No contiene trna iniciador formilmetionina metionina metionina Polimerasa de RNA una (4 subunidades) una (8-12 sub) tres (8-14 sub) Sensibilidad a Sí No No Cloranfenicol, estreptomicina y kanamicina
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed.
SECUENCIAS FIRMA O SIGNATURA Oligonucleótidos cortos de secuencia definida que forman parte de la secuencia del SSU rrna y que caracterizan organismos específicos o grupos de organismos filogenéticamente relacionados. Secuencias específicas de ciertos grupos de organismos, por ej. para cada uno de los dominios, de un género o especie en particular. Usos: - Clasificar microorganismos recientemente aislados - Previamente mal clasificados Ejemplos: AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria CACACACCG (posición 1400) en Archaea El uso más habitual de las secuencias firma es el diseño de sondas de ácidos nucleicos específicas.
Secuencias signatura de RNA 16S o 18S que definen los tres dominios de la vida Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 10ª ed.
Sonda molecular: cadena de acido nucleico que una vez marcada puede utilizarse para que hibride con su cadena complementaria en una mezcla de ácidos nucleicos SONDAS FILOGENÉTICAS Sondas universales de SSU de rrna están diseñadas para unirse a secuencias conservadas en el rrna de cualquier microorganismo, con independencia del dominio al que pertenezca. Sondas específicas que reconozcan exclusivamente especies del dominio Bacteria, gracias a secuencias firma que sólo se encuentran en su RNA. Sondas específicas de Archaea o Eukarya que reaccionarán con las respectivas especies de uno u otro dominio. Pueden diseñarse sondas filigenéticas que reconozcan grupos específicos dentro de un dominio, como determinadas familias, géneros o especies.
HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH, Fluorescence In Situ Hybridization) -Imágenes tomadas de: www. Google/ imágenes
HIBRIDIZACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH) Bacillus Aplicaciones: Levaduras Ecología y diagnostico clínico Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed.
RIBOTIPADO método para la identificación de organismos basado en el análisis de los fragmentos de DNA generados por digestión de sus correspondientes genes del rrna mediante una enzima de restricción. Características -No requiere secuenciación -Digestión del DNA de la bacteria con enzimas de restricción - Separación de los fragmentos resultantes mediante electroforesis en gel -Los fragmentos separados de DNA se transfieren a una membrana de nylon y se hibridan con una sonda marcada del gen 16S rrna -El patrón generado por los fragmentos de DNA en el gel se digitaliza -Se compara con los patrones de referencia de otros microorganismos disponibles en la base de datos.
Ribotipado de cuatro bacterias lácticas diferentes: rápido y específico Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed. Aplicaciones: Diagnostico clínico y análisis microbiológico de alimentos
Sistemática microbiana: es el estudio de la diversidad de los organismos y sus relaciones mutuas o de parentesco; incluye la taxonomía y la filogenia. Taxonomía: es la ciencia de la identificación, la clasificación y la nomenclatura. La taxonomía utiliza tres tipos de métodos: fenotípicos, genotípicos y filogenéticos para la identificación y descripción de las bacterias.
ALGUNAS CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE VALOR TAXONÓMICO Morfología: morfología de la colonia, reacción a tinción de Gram, tamaño y forma de la colonia, presencia de esporas, cuerpos de inclusión, etc. Movilidad: no móvil, movilidad por flagelos, movilidad por deslizamiento, movilidad por vesículas gaseosas, etc. Metabolismo: mecanismos de conservación de energía (fotótrofo, quimioorganotrofo, quimiolitótrofo), utilización de compuestos de carbono, etc. Fisiología: rangos de temperatura, ph, y sales para su crecimiento, respuesta al oxígeno, producción de enzimas extracelulares, etc. Química celular: ácidos grasos, lípidos polares, quinonas respiratorias, etc. Otros aspectos: pigmentos, luminiscencia, sensibilidad a antibióticos.
Desventajas de la utilización de FAME: REQUIERE UNA ESTRICTA ESTANDARIZACIÓN, ya que el perfil de ácidos grasos de cualquier bacteria varia en función de la temperatura, fase de crecimiento y medio de cultivo. Es necesario estandarizar todas las condiciones para poder comparar el perfil de ácidos grasos del microorganismo problema con el de la base de datos. Su aplicación se limita a aquellos microorganismos que puedan crecer en condiciones estandarizadas. No esta claro el perfil de cepas individuales dentro de una misma especie
MÉTODOS GENOTÍPICOS UTILIZADOS EN TAXONOMÍA BACTERIANA MÉTODO DESCRIPCIÓN/APLICACIÓN Hibridación DNA/DNA Comparación de similitud de genomas. Útil p/ diferenciar especies dentro de un género. Pérfil de DNA Ribotipado, AFLP, Rep- PCR. Métodos rápidos para diferenciar entre especies y entre cepas dentro de una misma especie. MLST Tipado de cepas utilizando las secuencias de DNA de múltiples genes. Útil p/ diferenciar cepas muy cercanas dentro de una misma especie. Contenido de G+C Porcentaje de pares de bases de G+C en el genoma. Es poco común en taxonomía, porque tiene una resolución pobre. AFLP: polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados MLST: análisis de secuencias multilocus Rep- PCR: secuencias palindrómicas extragénicas repetitivas
HIBRIDACIÓN DNA-DNA 1- DNA genómico 2- Cortar y marcar 3- Desnaturalizar Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
Rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR): basado en la existencia de elementos muy conservados de DNA repetitivos distribuidos aleatoriamente en el cromosoma bacteriano. El número y posición difiere entre cepas de la misma especie. Utilizando cebadores específicos que amplifican dichos elementos por PCR de distintos fragmentos genómicos, se genera un patrón de bandas, produciendo una huella de DNA (DNA fingerprinting) especifica para cada cepa. Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados): se basa en la digestión del DNA genómico con una o dos enzimas de restricción y la amplificación selectiva de estos fragmentos. Se genera un patrón de bandas, produciendo una huella de DNA (DNA fingerprinting) especifica para cada cepa. El elevado número de bandas proporciona un grado elevado de discernimiento entre cepas de la misma especie -Imágenes tomadas de: www. Google/ imágenes
Análisis de secuencia multilocus(mlst): (MLST):implica la secuenciación de varios genes de mantenimiento básico celular de un determinado organismo (cromosoma), y su comparación con los genes equivalentes de otra cepa del mismo organismo. 1- Amplificación y secuenciación de los genes diana (450pb) 2- Se comparan las secuencias nucleotídicas y se toman las diferencias. 3- Cada diferencia o variante de secuencia: alelo del gen (número). 4- A cada cepa se le asigna un conjunto de números: perfil alélico o tipificación de secuencias multilocus. 5- El grado de relación entre los distintos perfiles alélico: dendrograma (0: cepas idénticas y 1: cepas poco relacionadas). Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed. Muy útil para detectar cepas patógenas de una misma especie y en epidemiología
Proporción G-C: porcentaje de G+C. 20% al 80% en bacterias -Si la proporción de G-C de dos organismos difiere en mas de un 5%: poco emparentados. -Si la proporción de G-C es idéntica puede ser engañosa: secuencias nucleotídicas muy diferentes -No tiene futuro en taxonomía bacteriana. Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE): estudios epidemiologicos
RANGOS TAXONÓMICOS EN CLASIFICACIÓN BACTERIANA TAXONES: Dominio Phylum Clase Orden Familia Género Especie: Sub-especie TAXÓN DE MAYOR NIVEL Especie: unidad fundamental de la diversidad biológica. Importancia en estudios clínicos y ecológicos Especie procariota: colección de cepas que presenta un alto grado de similaridad en una serie de rasgos independientes: hibridaicón DNA-DNA de al menos 70% y parecido de secuencia del 16 S rrna de al menos el 97%.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
SISTEMA BINOMIAL DE NOMENCLATURA (Linneo) Los procariotas reciben: Género y especie Los nombres derivan del latín o griego latinizado que describen alguna propiedad típica de la especie y se escriben con letras itálicas o cursivas. Ej: Escherichia coli o E. coli Bacillus subtilis o B. subtilis El código Internacional de Nomenclatura Bacteriana
MANUAL DE BERGEY Manual Bergey de Bacteriología Sistemática (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology): Es la principal recopilacion en el campo de la taxonomía microbiana Compendio de información estándar y molecular de todas las especies reconocidas de procariotas en el momento de su publicación, y contiene tablas, figuras y otra información útil a los efectos de identificación de microorganismos. La segunda edición del Manual Bergey (Vol I: 2001; Vol II: 2005; 3 vol adicionales: 2007), publicado en 5 volúmenes a partir del 2001 ha incluido muchos conceptos surgidos de los estudios de secuenciación del rrna con abundante información de la taxonomía clásica. The Prokaryotes (http://www.prokaryotes.com)
COLECCIONES DE CULTIVO: depósitos de la diversidad bacteriana American Type Culture Collection (ATCC, Colección Americana de Cultivos Tipo; Manasas, Virginia, EE.UU) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen (DSMZ, Colección Alemana de Microorganismos; Brauns-Chweig, Alemania) Las colecciones catalogan y conservan microorganismos y los distribuyen bajo pedido, a investigadores de instituciones académicas, médicas o industriales. La cepa depositada sirve como cepa tipo de la nueva especie y como estándar para comparar otras cepas que se cree que pueden ser la misma. Conservación de los cultivos vivos: - Liofilizados - Congelados a bajas temperaturas: -80º C a -196º C