EFECTO DEL CHOQUE TÉRMICO EN CANALES IÓNICOS ENDÓGENOS EN OVOCITOS DE Xenopus laevis Salazar Soto, D. B. (1) ; Martínez Torres A. (2) ; Ochoa de la Paz L. (2) ; (1) Facultad de Química Universidad Autónoma de Querétaro (2) Instituto de Neurobiología Universidad Nacional Autónoma de México RESUMEN Se indujo la maduración de ovocitos de la rana Xenopus laevis por la acción de un choque térmico a 40 C durante 10 minutos. Aplicando métodos electrofisiológicos se registraron los cambios ocurridos en las corrientes eléctricas generadas por canales iónicos dependientes de voltaje. Se estudiaron específicamente las corrientes iónicas inducidas por el flujo de cloro, sodio y potasio. Se encontró que el potencial de membrana en reposo de los ovocitos disminuye dramáticamente de -25 a -14mV. Sin embargo, las corrientes generadas por los canales dependientes de voltaje se mantuvieron relativamente constantes. INTRODUCCIÓN Los ovocitos de Xenopus laevis han sido empleados en estudios biológicos y farmacológicos, dado su fácil manejo se han empleado para la expresión heteróloga de proteínas de transporte, receptores y canales iónicos ya que al expresar la proteína exhiben las propiedades farmacológicas y electrofisiológicas propias. La ovogénesis se compone de seis estadios (I-VI), la principal diferencia entre ellos está en su variación en el tamaño el cual va desde 100 μm hasta 1300μm. Por otra parte la coloración de sus hemisferios se modifica ya que en las fases inmaduras hay una coloración casi homogénea entre los hemisferios animal y vegetal hasta que se observa una diferenciación ecuatorial entre los hemisferios donde el vegetal es claro y el animal es oscuro. Se pueden encontrar a un mismo tiempo toda la diversidad de los estadios simultáneamente; sin embargo, al llegar al estadio VI ya no crece el ovocito sino que se mantiene en la fase G2/M de la profase de la meiosis. La liberación de gonadotropina estimula a las células foliculares a producir progesterona, e inicia el ciclo de la meiosis el cual es señalado unas horas después por la desintegración de la vesícula germinal, (Weber, 1999), el cual se puede observar en el hemisferio animal a causa de una decoloración. La maduración del ovocito puede producirse por variaciones en las condiciones ambientales, como lo es la temperatura. En base a estudios realizados en el laboratorio se ha encontrado que la temperatura de activación de dicha señal es optima a 40 C durante una exposición de 10 minutos (Sánchez, no publicado). Durante la maduración las propiedades bioeléctricas de la membrana plasmática cambian, el potencial de membrana se despolariza, debido a que pocos son los sistemas que se mantienen activados como el caso de los canales de cloro independientes de calcio, así como la inactivación de la bomba de sodio-potasio la cual contribuye en el proceso de despolarización. Página 1 de 1
El objetivo de este trabajo consistió en determinar si existen cambios en las propiedades de los canales iónicos activados por voltaje durante la inducción de la maduración del ovocito. METODOLOGÍA Se operaron tres ranas hembras Xenopus laevis las cuales fueron anestesiadas por hipotermia para extraer un folículo de ovocitos, posteriormente se dejaron para su recuperación en agua a temperatura ambiente. Los ovocitos fueron desfoliculados y tratados con colagenasa (SIGMA, lote 055K1676) a una concentración de 5 μm para eliminar las células foliculares durante 30 minutos y lavados con solución Barth (la cual contiene una concentración de: 88mM de cloruro de sodio, 1mM de cloruro de potasio, 2.4mM de bicarbonato de sodio, 0.82mM de sulfato de magnesio, 0.33mM de nitrato de sodio, 41mM de cloruro de calcio, 5mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetano sulfónico (HEPES) y 50μg/ml de gentamicina) por 10 minutos dos veces; se almacenaron a 14ºC en solución Barth toda la noche para su recuperación. Posteriormente fueron separados en dos grupos: un control los cuales se hizo fijación de voltaje directamente y el grupo tratado el cual fue sometido a un choque térmico en baño María en solución Barth a 40º C durante 10 minutos, posteriormente fueron registrados fijándose el potencial de membrana a -60mV y se corrieron los 4 protocolos respectivamente a cada ovocito, cuyos programas se muestran en la tabla 1 Nombre del protocolo Calcium independent Cl Transient out Tabla 1: Programa de los protocolos para activar los voltajes Canal iónico de estudio Canal de cloro independiente de calcio Canal de cloro activado por calcio Programa Inicia en un voltaje de -140mV, incrementando 20 veces 10 mv con duración de 1 segundo cada uno Inicia en un voltaje de 0mV, incrementando 8 veces 20 mv con duración de 2 segundos cada uno Transient K Canal de potasio Inicia en un voltaje de 0mV, incrementando 11 veces 10 mv con duración de 12 milisegundos cada uno Sodium protocol Canal de sodio Inicia en un voltaje de 0mV, incrementando 10 veces 10 mv con duración de 5 milisegundos cada uno Posteriormente fueron analizados los datos en el programa ORIGIN 7.5. RESULTADOS Se registraron en total 30 ovocitos de los cuales 6 fueron controles y el resto fueron registrados a diferentes tiempos a partir del momento en que finaliza el choque térmico mientras que el resto fueron incubados a 14ºC, a cada uno de ellos se registro su potencial de membrana inicial cuyo rango vario entre cada ovocito y los diferentes donadores. Página 2 de 2
A continuación en la tabla 2 se muestra el rango del potencial de membrana clasificados por ovocitos tratados y controles, Tabla 2: Variación del potencial de membrana con respecto al tiempo después del choque térmico Potencial de membrana 1 hora 2 horas -15.27 +2.16-24.98 +0 3 horas 4 horas 5 horas 6 horas 7 horas control -15.33 +3.34863-15.3 +0.8660-16.45 + 3.5-13.77 +4.96681-41.85 +21.20-23-38 +5,337 Así como los protocolos que se corrieron, la relación corriente-voltaje y el potencial dado al punto más hiperpolarizante o despolarizante según sea el caso Tiempo (min) 0 120 240 360 480 Fig. 1 Cambios morfológicos en un ovocito sometido a choque térmico entre 0 y 480 min. La flecha indica la formación de la vesícula germinal. A B C intensidad na - - -0.6 5 s 200 na -0.8 - -1.2 60 mv 5 s -150-100 -50 0 50 Figura 2: A) protocolo de los pulsos de voltaje para activar canal de cloro independiente de calcio B) curva voltaje-corriente C) pulso hiperpolarizante a 140 mv A B C 0.8 Intensidad na 0.6 0.5 s 300 na 0.5 s 70 mv 20 40 60 80 100 120 140 Página 3 de 3
Figura 3: A) protocolo de los pulsos de voltaje para activar canal de cloro dependiente de voltaje B) relación corriente-voltaje C) pulso despolarizante a 140 mv. A B C 1.2 1.1 0.9 intensidad na 0.8 0.7 0.6 0.5 0.3 0.1-0.1-0 20 40 60 80 100 0.1 s 2200 na 0.1 s 50 mv Figura 4: A) protocolo de los pulsos de voltaje para canal de potasio B) relación corrientevoltaje C) pulso despolarizante a 100 mv A B C 1.5 Intensidad na 0.5-0.5 3600 na 25 s 45 mv 25 s 0 20 40 60 80 100 Figura 5 A) protocolo de los pulsos de voltaje para canal de sodio B) relación corrientevoltaje C) pulso despolarizante a 90 mv CONCLUSIONES. Existe un cambio en la pigmentación del hemisferio animal después del choque térmico. Este cambio corresponde al desplazamiento de la vesícula germinal. Los cambios en el potencial de membrana en reposo indican que los ovocitos se despolarizan eléctricamente. No se encontraron cambios en las corrientes generadas por canales de cloro, sodio o potasio. BIBLIOGRAFIA. Parker, I. y Miledi, R. A calcium independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus laevis, Proc. R. Soc. Lond.,233, 191-199. Página 4 de 4
Parker, I. y Miledi, R. Transient potassium curent in native Xenopus laevis, Proc. R. Soc. Lond.,234, 45-53. Weber, W. M. Ion currents of Xenopus laevis oocytes: state of the art, BBA., 1421, 213-233. Página 5 de 5